周萬明 綜述，魯雄兵 校審

(南昌大學第二附屬醫(yī)院泌尿外科，江西南昌 330006)

外泌體是由細胞主動脫落釋放的直徑在40～100 nm的囊泡小體[1]，其膜由雙層磷脂分子層構成。人體內多種細胞都可分泌外泌體，包括血小板、內皮細胞、肥大細胞、樹突細胞、成纖維細胞、間充質干細胞和腫瘤細胞[2]等，但不同的細胞分泌的外泌體亞型有區(qū)別。在大多數(shù)體液及細胞培養(yǎng)液中均可檢測到外泌體。最新研究表明外泌體參與細胞間通訊，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及轉移上發(fā)揮了重要作用。

膀胱癌是指發(fā)生在膀胱黏膜上的惡性腫瘤，是我國泌尿系統(tǒng)最常見的癌癥之一，也是西方最常見的八種癌癥之一,其中移形細胞癌(占90%)發(fā)病率僅次于前列腺癌。外泌體參與了膀胱癌的發(fā)生發(fā)展以及轉移，攜帶的貨物有助于疾病的診斷、分期以及預后的監(jiān)測。

1 外泌體的生化特征

外泌體的主要分泌機制有兩種：依賴高爾基體的連續(xù)分泌和誘導分泌。不同亞型的外泌體釋放機制可能不同，攜帶的貨物成份也不同[3]。外泌體膜上及膜內富集了大量的蛋白,比如膜轉運和膜融合蛋白(如GTPases、Annexins和Flotillin)、多囊泡體合成所需的蛋白質(如腫瘤易感基因101)、四跨膜蛋白(如CD9、CD63、CD81)、凋亡連接基因2相互作用蛋白X(apoptosis-linked gene2-interacting protein X，ALIX)、熱休克蛋白(heat shock proteins，如HSP70、HSP90)[2]等。外泌體內攜帶許多核酸分子,如miRNA、非編碼的RNA 及mRNA等[4]。另外也攜帶了來源細胞相似的細胞因子、生長因子等蛋白質。

外泌體的分離方法尚未統(tǒng)一，包括蔗糖梯度離心、差異超速離心、過濾離心、免疫親和捕獲技術、層析技術、微流控芯片技術以及PEG聚合物沉淀[2]等，這些技術適當?shù)慕M合可能效果會更好，目前也有較多基于以上原理的商業(yè)試劑盒。黃金標準方法是差異超速離心[5]。蔗糖梯度離心法得到的外泌體純度高，但前期準備耗時、提取過程非常耗時且產量少。外泌體短期儲存(1～2 d內)置于4 ℃即可，長期保存則應放置于-80 ℃[6]。

外泌體的鑒定依賴于形態(tài)學觀察和蛋白質組成分析。在電鏡下觀察外泌體的形態(tài)，可見杯狀、或為扁平球囊體[7]，也可用納米顆粒追蹤(nanoparticle tracking analysis，NTA)對其直徑大小進行測量；蛋白組成分析常用Western blot技術檢測外泌體富集的蛋白質表達水平[8]，如常選擇檢測CD63和CD81。

2 外泌體與腫瘤

外泌體最早被發(fā)現(xiàn)參與抗原呈遞和免疫激活與抑制[9]。肥大細胞通過釋放的外泌體將其內的mRNA、miRNA轉運到受體細胞，并在受體細胞內翻譯出了蛋白質，因此證明外泌體具有轉運物質的功能。外泌體的脂質雙層膜降低了外泌體被蛋白酶及核糖核酸酶的降解，通過自分泌、旁分泌、內分泌等分泌途徑從細胞膜上脫落下來，膜內攜帶蛋白質、核酸等信號分子，通過受體-配體相互作用、直接膜融合、內吞作用(或吞噬作用)3種途徑將信號從外泌體轉移到受體細胞[2]，參與細胞間通訊、血管新生、免疫反應和腫瘤生長等生理和病理過程[10]。外泌體參與了腫瘤微環(huán)境的組成，促進可溶性蛋白質、核酸、功能性跨膜蛋白、趨化因子受體、表皮生長因子受體等來介導的腫瘤發(fā)生、生長、腫瘤血管生長、腫瘤轉移[11]、腫瘤免疫逃逸[9]、腫瘤微環(huán)境的形成[12]等。

腫瘤細胞會釋放外泌體，其攜帶的信號分子特征可以反應腫瘤細胞表型，比如腫瘤特異性抗原蛋白和RNA，它們具有很大的潛能作為腫瘤診斷的標志物[13]。THERY 等[9]的研究表明外泌體在B淋巴細胞和樹突狀細胞中具有免疫調節(jié)作用和抗腫瘤作用，同時腫瘤細胞可以通過分泌外泌體來排出抗腫瘤的藥物而導致腫瘤的多重耐藥性。CLAYTON等[14]的研究發(fā)現(xiàn)膀胱癌、前列腺癌、直腸癌等癌細胞分泌的外泌體中含有CD39和CD73，它們可以減少腺苷的產生和阻止T細胞的活化來逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視。

外泌體與腫瘤息息相關，參與腫瘤的形成、轉移、耐藥、逃避免疫監(jiān)視，同時也可以協(xié)助診斷與治療等。

3 外泌體與膀胱癌的研究

3.1 膀胱癌來源的外泌體促進腫瘤生長和轉移SAMANT等[15]發(fā)現(xiàn)前列腺癌、膀胱癌以及乳腺癌細胞分泌的外泌體含有轉移生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)，作用于受體細胞成纖維細胞，可以減少肌成纖維細胞活化、促進腫瘤的血管再生和腫瘤生長。BERNARD等[16]研究發(fā)現(xiàn),膀胱癌細胞衍生的外泌體含有轉移生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)，通過外泌體介導的TGF-β轉移和SMAD途徑激活觸發(fā)成纖維細胞分化成癌相關成纖維細胞(cancer-associated fibroblasts,CAF)。OSTENFELD等[17]的研究顯示膀胱癌細胞分泌的miRNA-23b可以使癌細胞獲得轉移潛能。FRANZEN等[18]證明膀胱癌細胞來源的外泌體可以在靶細胞內觸發(fā)上皮間質轉化，這一過程與表型的改變導致癌細胞的遷移、侵襲和轉移。此外,體外實驗已經(jīng)證明，膀胱癌細胞產生的外泌體上調Bcl-2和Cyclin-D1抑制癌細胞凋亡,激活膀胱癌細胞中的Akt和ERK通路促進膀胱癌細胞的增殖[19]。CARLA等[20]證實膀胱癌患者尿液來源的外泌體中含有上皮生長因子樣重復盤狀結構I樣域蛋白3[epidermal Growth Factor (EGF)-Like Repeats and Discoidin I-Like Domains 3，EDIL-3 ]，EDIL-3可以促進膀胱癌細胞和內皮細胞的血管生成和遷移，當實驗沉默EDIL-3 后，其外泌體未能促進血管生成以及尿道上皮和內皮細胞遷移。此外，從高級別膀胱癌患者的尿中純化的外泌體中EDIL-3比健康對照組的表達水平更高，因此EDIL-3/DeL1蛋白可能可以用于評估膀胱癌的分級。長鏈非編碼RNA的表達與膀胱癌疾病進展相關，BERRONDO等[21]通過富集膀胱癌患者尿液外泌體中的長鏈非編碼RNA HOTAIR，證實 HOTAIR在膀胱癌細胞系中的敲低減少了膀胱癌細胞體外遷移和侵襲力。重要的是，膀胱癌細胞系中HOTAIR表達的缺失會改變包括上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)基因的表達(如：SNAI1、ZEB1、ZO1、MMP1、LAMB3和LAMC2等)，上皮-間質轉化與癌癥的形成密切相關。如圖1示。

圖1 膀胱癌細胞來源的外泌體促進腫瘤生長及轉移

a：外泌體中含TGF-β促進腫瘤血管生成和腫瘤生長[15]；b：外泌體中的miR-23b促進腫瘤轉移[17]；c：癌細胞來源外泌體通過上調Bcl-2及Cyclin-D1抑制腫瘤生長，促進增值[19]；d：癌細胞系中長鏈非編碼RNA HOTAIR表達的缺失或改變會改變包括上皮-間質轉化( EMT )基因的表達[21]。

3.2 外泌體具有成為膀胱癌診斷標志物的潛能膀胱癌臨床主要診斷和監(jiān)測工具是尿細胞學檢測和膀胱鏡檢查，但是尿細胞學檢測敏感性欠佳，尤其是低度惡性腫瘤；膀胱鏡檢查是目前的“金標準”，屬于侵入性檢查。然而，據(jù)報道使用膀胱鏡并不能全部檢出乳頭狀腫瘤(Ta和T1)以及高度的CIS病變[22]。因此臨床上急需探尋一種非侵入性且特異性和敏感性高的檢查方法。

尿液來源的外泌體越來越多地被研究，因其有以下優(yōu)點：可以通過非侵入性的方法從尿液中提??；尿路上皮細胞與尿液之間的接觸為外泌體分泌到尿液中提供了充足的條件，并且不同部位的上皮細胞分泌的外泌體，其膜上的蛋白質和脂質分子組成及含量不同，可通過外泌體膜的特征來分離膀胱來源的外泌體；外泌體是納米級顆粒，不能透過腎臟的濾過膜，所以尿液相對于血液減少了其他系統(tǒng)的干擾。這些特征使得外泌體很有可能成為腎、膀胱、尿道和前列腺等泌尿系統(tǒng)疾病診斷的潛在標志物[23]。

膀胱癌外泌體的蛋白質組學研究顯示，從3例膀胱移行細胞癌患者尿液中分離的外泌體，其中CD36、CD44、CD73、滋養(yǎng)層糖蛋白 (5T4)的表達與健康組有明顯的差別。PEREZ等[24]發(fā)現(xiàn)尿液來源外泌體中的RNA可以作為穩(wěn)定的生物標志物，且人源性長壽保障基因2和黏液糖化蛋白酶1可以作為膀胱癌的診斷標志物。BAUMGART等[25]發(fā)現(xiàn)尿液來源的肌層浸潤性膀胱癌外泌體與非肌層浸潤性膀胱癌外泌體中miRNA表達有差異，有助于鑒別診斷，但是仍然沒有單獨的一個指標可用于臨床[26]。未來有望發(fā)現(xiàn)更可靠的指標盡早用于臨床。

3.3 外泌體可用于膀胱癌的治療無論如今的多學科治療如何努力，膀胱癌的高復發(fā)率仍是目前治療最大的障礙，外泌體介導的信號轉導在癌癥進展中的重要作用使得外泌體成為潛在的新型治療靶點，其重點集中于抑制腫瘤細胞通訊網(wǎng)絡的關鍵組分。外泌體有望在膀胱癌患者的治療中發(fā)揮重要作用，有助于早期診斷和監(jiān)測，也可提供準確的預測標志物。如圖2所示。

圖2 兩種利用外泌體治療膀胱癌的潛在策略

a：外泌體用于研制運輸抗癌藥物的載體，利用腫瘤來源的外泌體攜帶抑制腫瘤細胞增殖或轉移的藥物靶向輸送至腫瘤細胞發(fā)揮抗腫瘤作用；b：通過抑制腫瘤細胞來源的外泌體來抑制腫瘤的進展和轉移[27]：抑制外泌體合成或釋放，利用抗原抗體反應特異性去除循環(huán)中的腫瘤外泌體，阻斷腫瘤外泌體與細胞的識別。

3.3.1外泌體用于研制運輸抗癌藥物的載體 外泌體的脂質雙分子層膜可以保護膜內核酸及蛋白質不被降解，同時膜上具有識別分子，外泌體可以很好地成為靶向運輸藥物的載體。它可精準運輸干擾RNA、自殺mRNA、蛋白質、miRNA、藥物等。盡管外泌體具有巨大的治療潛力，但是該領域仍需要新的體內模型和強大的成像系統(tǒng)來追蹤單個細胞外泌體的合成、釋放、運輸和發(fā)揮作用的途徑。

3.3.2通過抑制腫瘤細胞來源的外泌體來抑制腫瘤的進展和轉移 外泌體參與了腫瘤微環(huán)境的構成、腫瘤細胞間信號轉導。誘導或干擾外泌體的信號轉導作用即可抑制腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，目前有幾種潛在策略[27]：①通過干涉參與外泌體形成的途徑組分(如ESCRT，神經(jīng)酰胺)或釋放(如Rab27、ARF6、RhoA)而抑制外泌體的生物發(fā)生或釋放；②通過體外血液濾過從循環(huán)中去除外泌體；③通過阻斷參與外泌體結合或內化的外泌體配體(如四跨膜蛋白)或細胞表面受體(如HSPG)來抑制受體細胞對外泌體的攝取。YANG等[28]的研究提示抑制膀胱癌來源的外泌體的分泌和釋放，可能為膀胱癌的治療提供新的策略。在敲低Rab27 siRNA的膀胱癌細胞，引起腫瘤抑制劑miR-23b在外泌體中表達降低，在細胞內表達增加，減弱細胞侵襲性，該效應被miR-23b抑制逆轉。MARLEAU等[29]的研究顯示在人表皮生長因子受體2(HER-2)過表達的乳腺癌患者中，使用抗HER-2抗體從循環(huán)中去除表達HER-2的外泌體可以改善乳腺癌的治療結果。FRANZEN等[30]的研究證實了在SW780膀胱癌細胞通過硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPGs)受體介導內吞膀胱癌來源的外泌體，用肝素可部分抑制內吞作用的發(fā)生。HSPGs介導的這種攝取途徑似乎對外泌體的功能很重要，用肝素競爭性抑制靶細胞對外泌體的攝取，顯著抑制外泌體誘導的靶細胞遷移[31]。以上三項研究證明利用幾種潛在策略干擾外泌體來治療癌癥是可行的。

4 展 望

越來越多的研究顯示外泌體在生理及病理過程中扮演著非常重要的角色。希望未來能夠統(tǒng)一外泌體分離與表征的方法，有望從血液或尿液來源的外泌體中找到膀胱癌的診斷標志物和監(jiān)測預后的指標。腫瘤細胞釋放和分泌外泌體的機制以及影響膀胱癌發(fā)生與發(fā)展的機制還需進一步闡明，從而找到精準的抑制外泌體在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中的促進作用，卻不影響正常細胞功能的治療方法。