虞亞杰，梁 超，王尚乾，邵鵬飛

(南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院泌尿外科，江蘇南京 210029)

四跨膜蛋白家族(tetraspanins)是一種膜蛋白，參與正常的生理過程(比如細胞的活化、增殖、粘附和運動)，同時也參與病理過程(比如腫瘤的進展和轉(zhuǎn)移)[1]。CD151作為四跨膜蛋白家族中的一員，已被證實在乳腺癌、結(jié)直腸癌、肝癌、肺癌、胰腺癌和前列腺癌等腫瘤組織中高表達[2-7]。已有文獻報道高表達的CD151和腫瘤的生長、進展、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)[8-10]。然而，目前關(guān)于CD151和腎癌之間關(guān)系的研究很少，其在腎癌發(fā)生發(fā)展中的作用還不明確。本研究擬探討CD151對腎透明細胞癌的細胞遷移侵襲能力的影響及其相關(guān)分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料人腎透明細胞癌皮膚轉(zhuǎn)移細胞Caki-1，人腎透明細胞癌細胞Caki-2和人腎腺癌細胞786-0以及人腎小管上皮細胞HK-2(中國科學院生化細胞所)；DMEM、M5A、1640培養(yǎng)基及胎牛血清(Gibco公司，美國)；胰酶(Sigma公司，美國)；磷酸鹽緩沖液(Thermo Fisher Scientific公司，美國)；SiLent Fect Lipid Reagent 轉(zhuǎn)染試劑(Bio-Rad公司，美國)；siRNA-CD151及對照siRNA(Control siRNA)(蘇州吉瑪公司)；CD151抗體(Sigma公司，美國)；E-cad、N-cad和Vimentin抗體及山羊抗兔熒光二抗(CST公司，美國)；Transwell小室(Corning公司，美國)；Matrigel基質(zhì)膠(BD Biosciences公司，美國)。

1.2 細胞培養(yǎng)用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HK-2細胞，含10%胎牛血清的M5A培養(yǎng)基培養(yǎng)Caki-1和Caki-2細胞，含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)786-0細胞。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染取對數(shù)生長期Caki-1、Caki-2細胞，按每孔1×106個細胞分別接種在6孔板，培養(yǎng)至細胞達到50%融合度時按照轉(zhuǎn)染試劑說明書進行轉(zhuǎn)染，各分為兩組，轉(zhuǎn)染CD151特異性siRNA組(siCD151組)和轉(zhuǎn)染非特異性siRNA組(siCtrl組)。培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，24 h內(nèi)更換新鮮完全培養(yǎng)基。Western blot方法檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.4 Western blotWestern blot檢測腎癌細胞系中CD151蛋白表達水平。提取對數(shù)期生長的HK-2、Caki-1、Caki-2和786-0細胞的總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，加入SDS上樣緩沖液，煮沸5 min，-20 ℃保存。配置SDS-PAGE膠，每樣本取20 μg蛋白常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜。使用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加一抗4 ℃孵育過夜，次日緩沖液漂洗3次，每次5 min，加二抗室溫孵育2 h后緩沖液漂洗3次，每次5 min。ECL液顯色后曝光拍照，選用β-actin作為內(nèi)參。

Western blot檢測轉(zhuǎn)染效率和CD151基因沉默對E-cad、N-cad和Vimentin蛋白表達的影響。收集轉(zhuǎn)染48 h后的各組細胞，提取總蛋白，以上述同樣方法進行實驗。

1.5 Transwell遷移侵襲實驗遷移實驗：胰酶消化已轉(zhuǎn)染過的Caki-1和Caki-2細胞，終止消化離心后用無血清培養(yǎng)基重懸細胞，測濃度，稀釋至適宜濃度，在24孔板底部加入600 μL含有20%胎牛血清的培養(yǎng)基，小室內(nèi)加入200 μL含有2×104個細胞的無血清細胞懸液，將小室小心放入24孔板孔內(nèi)，避免氣泡產(chǎn)生，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。24 h后，用鑷子小心取出小室，用棉簽輕輕擦去小室內(nèi)部液體和殘留的細胞，室溫下用甲醇固定30 min；取出小室，吸干室內(nèi)液體，移入結(jié)晶紫中，室溫下染色30 min；取出小室，PBS中漂洗數(shù)次，吸干水分，顯微鏡下隨機取5個視野計數(shù)，統(tǒng)計結(jié)果。

侵襲實驗：用50 mg/L Matrigel基質(zhì)膠稀釋液包被滅菌的Transwell小室聚碳酸脂膜上室面，4℃風干。在24孔板底部加入600μL含有20%胎牛血清的培養(yǎng)基，在小室內(nèi)加入200 μL含有5×104個細胞的無血清細胞懸液，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。其他步驟同遷移實驗。

2 結(jié) 果

2.1 腎癌細胞系中CD151的表達水平Western blot 結(jié)果表明CD151在Caki-1、Caki-2和786-0細胞系中的表達高于HK-2細胞系(圖1)，說明CD151在腎透明細胞癌中高表達。其中，Caki-1細胞系來源于腎透明細胞癌皮膚轉(zhuǎn)移，而Caki-2來源于腎透明細胞癌細胞、786-0來源于腎腺癌細胞，且Caki-2細胞系中CD151表達稍高，所以最終選擇Caki-1和Caki-2細胞系進行后續(xù)實驗。

圖1 腎癌細胞系中CD151表達水平

β-actin：內(nèi)參；HK-2：人腎小管上皮細胞；Caki-1：人腎透明細胞癌皮膚轉(zhuǎn)移細胞；Caki-2：人腎透明細胞癌細胞；786-0：人腎腺癌細胞。

2.2 Western blot檢測細胞轉(zhuǎn)染效率與siCtrl組相比，siCD151組的CD151蛋白表達量明顯下降。提示CD151-siRNA可以下調(diào)Caki-1和Caki-2細胞中CD151的表達(圖2)。熒光轉(zhuǎn)染對照顯示轉(zhuǎn)染效率(圖3)。

圖2 Western blot檢測轉(zhuǎn)染后CD151表達水平

2.3 沉默CD151基因?qū)δI透明細胞癌細胞遷移侵襲能力的影響Transwell細胞遷移實驗顯示，在2種腎透明細胞癌細胞系Caki-1和Caki-2中，與siCtrl組相比，siCD151組穿過Transwell小室的細胞數(shù)目分別減少了57%和47%，兩組比較差異具有顯著性統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示沉默CD151基因后腎透明細胞癌細胞的遷移能力減弱(圖3)。

Transwell細胞侵襲實驗也得到相似結(jié)果，在Caki-1和Caki-2細胞系中，與siCtrl組相比，siCD151組穿過Transwell小室的細胞數(shù)目分別減少了32%和43%，兩組比較差異具有顯著性統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示沉默CD151基因后能抑制腎透明細胞癌細胞的侵襲能力(圖4)。

圖3 熒光轉(zhuǎn)染對照顯示Caki-1和Caki-2細胞轉(zhuǎn)染效率

圖4 CD151基因沉默對腎透明細胞癌細胞遷移侵襲能力的影響

A：Caki-1和Caki-2細胞遷移、侵襲；B：Caki-1細胞遷移侵襲分析柱狀圖；C：Caki-2細胞遷移侵襲分析柱狀圖。兩組比較，*P<0.05(n=3)。

2.4 干擾CD151基因?qū)-cad、N-cad和Vimentin蛋白表達的影響Western blot實驗檢測與EMT相關(guān)的蛋白變化，結(jié)果顯示，siCD151組Caki-1和Caki-2細胞中E-cad的蛋白表達水平比siCtrl組顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而N-cad和Vimentin的表達量顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖5)。以上結(jié)果提示CD151基因可能通過促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程(epithelial-mesenchymal transition,EMT)而促進腎透明細胞癌細胞的遷移侵襲能力。

圖5 轉(zhuǎn)染siCD151后兩種腎透明細胞癌細胞中E-cad、N-cad和Vimentin蛋白的表達

A：Western blot檢測；B：E-cad蛋白表達灰度分析柱狀圖；C：N-cad蛋白表達灰度分析柱狀圖；D：Vimentin蛋白表達灰度分析柱狀圖。兩組比較，*P<0.05(n=3)。

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)CD151(也稱作GP-27、MER2、PETA-3、SFA-1或者Tspan24)在不同的細胞類型中都有表達[11]，并且已被證實在乳腺癌、結(jié)直腸癌、肝癌、肺癌、胰腺癌和前列腺癌等腫瘤組織中均高表達[2-7]。有文獻報道CD151通過介導細胞粘附相關(guān)信號通路而調(diào)節(jié)細胞功能，從而促進骨肉瘤的轉(zhuǎn)移[12]。CD151也可以通過與其他四跨膜蛋白家族成員(比如CD9、CD81)或者整合素(integrins)交互作用從而發(fā)揮調(diào)節(jié)細胞轉(zhuǎn)移和粘附的作用[13-14]。僅有少量文獻報道過CD151可能用來預測腎透明細胞癌的進展和轉(zhuǎn)移潛能[15-16]。本研究也證實，CD151在腎透明細胞癌細胞系中高表達，干擾CD151基因的表達后腎透明細胞癌細胞的遷移、侵襲能力明顯下降。

腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移涉及一系列的細胞生理改變(比如EMT)，以及增加并激活細胞外一些蛋白酶(比如MMPs)從而降解細胞外基質(zhì)等復雜的過程[17]。EMT，即上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，是指上皮細胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細胞的生物學過程。其主要的特征有上皮表型(比如E-cad)的丟失和間質(zhì)表型(比如N-cad和Vimentin)的獲得[18]。本研究證實，與對照組相比，干擾組E-cad的表達量顯著升高，N-cad和Vimentin的表達量則顯著降低。因此，我們推測CD151對腎透明細胞癌細胞的遷移侵襲能力的影響可能是通過促進EMT而實現(xiàn)的。TGF-β1 被公認為通過誘導 EMT 而起到腫瘤啟動子的作用，我們推測 CD151 可能影響 TGF-β1的表達，進而激活EMT過程，從而促進腎癌轉(zhuǎn)移。但是，本研究目前還存在一些局限性，比如轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的具體機制尚需進一步研究，還缺乏體內(nèi)實驗來驗證 CD151 在腎透明細胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用。下一步，我們將持續(xù)關(guān)注國際上的相關(guān)研究進展，并開展進一步研究，著重探究CD151與TGF-β1/Smad信號通路以及腎透明細胞癌之間的關(guān)系。

綜上所述，CD151通過促進EMT而增強腎透明細胞癌細胞的遷移與侵襲能力，該基因有可能成為腎透明細胞癌生物治療的重要靶點。