王永芳 宋姍姍 張春芳 陳昊

(徐州醫(yī)科大學(xué)附屬連云港市第一人民醫(yī)院病理科，江蘇 連云港 222002)

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是目前全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率均居首位的惡性腫瘤，以老年患者居多，約70%以上的患者在發(fā)現(xiàn)腫瘤時(shí)已出現(xiàn)局部進(jìn)展或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移而失去手術(shù)機(jī)會(huì)，其5年生存率通常低于20%〔1〕。在我國(guó)，NSCLC 的發(fā)病率和死亡率均呈上升趨勢(shì)，其中鱗狀細(xì)胞癌和肺腺癌是其主要的組織學(xué)類型〔2〕。干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Nanog基因位于染色體12p13.31上，在維持外胚層多能性、阻止向原始內(nèi)胚層分化中起重要作用，有研究表明Nanog在生殖細(xì)胞腫瘤中陽(yáng)性表達(dá)，其表達(dá)上調(diào)能夠抑制鈣黏素的表達(dá)，可誘發(fā)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移〔3〕。此外，近年來(lái)多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)Nanog在乳腺癌、食管癌、胃腸癌及腎癌等多種惡性腫瘤組織中表達(dá)增高，且與患者預(yù)后密切相關(guān)，提示其可能作為腫瘤生物學(xué)和預(yù)后的分子標(biāo)志物〔4～7〕。本文擬分析干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Nanog在人NSCLC中的表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，為NSCLC的治療及預(yù)后提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1臨床資料 收集50例2014年2月至2017年6月在連云港市第一人民醫(yī)院NSCLC患者術(shù)中切除的新鮮組織，以其中30例癌旁組織(距癌組織≤3 cm)及正常肺組織(距癌組織>3 cm)作為對(duì)照組，每例標(biāo)本取下后立即放入冷凍管經(jīng)液氮速凍后，置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｋ谢颊吲R床資料完整，確診前未接受任何形式放療、化療等輔助治療，術(shù)后經(jīng)病理明確診斷?；颊吣挲g33～76歲，中位年齡61歲；男32例，女18例；鱗癌23例，腺癌27例；腫塊直徑1.5～10.0 cm，中位直徑3.5 cm；臨床TNM分期：Ⅰ期18例，Ⅱ期12例，Ⅲ期11例，Ⅳ期9例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移26例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例。

1.2主要試劑 Trizol RNA提取試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；兔抗人Nanog單克隆抗體(濃縮液)購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，以1∶400倍稀釋；三合一抗原修復(fù)液、過(guò)氧化物酶阻斷劑、二抗、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液、磷酸鹽緩沖液(PBS)均購(gòu)自美國(guó)DAKO公司。

1.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)Nanog基因 取100 mg的凍存新鮮組織液氮下研磨，加入1 ml Trizol RNA提取試劑抽提組織中的總mRNA，操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行。紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度及A260/280比值。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明書將提取 RNA逆轉(zhuǎn)成cDNA，-80℃保存?zhèn)溆?，Nanog和內(nèi)參照GAPDH的引物序列Nanog正義：5′-TGTGGGCCTGAAGAAAACTATC-3′,反義：5′-GCTGTCCTGAATAAGCAGATCC-3′；GAPDH正義：5′-TGTACGCCAACACAGTGCTG-3′，反義：5′-TCAGGAGGAGCAATGATCTTG-3′。采用SYBR Green染料法行qRT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件為95℃ 5 min，95℃ 10 s，60℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，并進(jìn)行擴(kuò)增曲線和熔解曲線檢測(cè)，數(shù)據(jù)分析采用相對(duì)定量的方法，取2-ΔΔCt值進(jìn)行比較，其中ΔCT =目的基因CT平均值-管家基因CT平均值，ΔΔCT=ΔCT癌-ΔCT癌旁。

1.4免疫組化檢測(cè)Nanog蛋白 標(biāo)本均用4%中性甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，采用EnVision二步法應(yīng)用儀器Roche Bench Mark XT免疫組化自動(dòng)染色儀行免疫組化染色。設(shè)陽(yáng)性對(duì)照并用PBS緩沖液代替一抗做陰性對(duì)照。Nanog陽(yáng)性表達(dá)主要定位于細(xì)胞核中，陽(yáng)性判讀使用半定量積分法〔8〕：光鏡(×200)下檢查組織中陽(yáng)性細(xì)胞所占比例和著色強(qiáng)度，①陽(yáng)性細(xì)胞染色比例<6%計(jì)0分；6%～25%計(jì)1分；26%～50%計(jì)2分；51%～75%計(jì)3分；>75%計(jì)4分。②陽(yáng)性細(xì)胞著色強(qiáng)度：無(wú)0分；淡黃色1分；棕黃色2分；棕褐色3分。將以上兩項(xiàng)得分相乘為最后評(píng)分，0分為陰性，1～4分為弱陽(yáng)性，5～7分為中陽(yáng)性，8分及以上為強(qiáng)陽(yáng)性。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS16.0軟件進(jìn)行方差分析、t檢驗(yàn)及χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1NSCLC、癌旁組織及正常肺組織中Nanog基因的表達(dá)情況 NSCLC組織中Nanog mRNA相對(duì)表達(dá)量(3.25±1.12)顯著高于癌旁(1.20±0.45)和正常肺組織(1.03±0.28，P<0.01)；而癌旁與正常肺組織差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2NSCLC、癌旁組織及正常肺組織中Nanog蛋白表達(dá)情況 Nanog蛋白的陽(yáng)性染色為棕黃色顆粒，在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)，但在細(xì)胞核中的表達(dá)強(qiáng)于細(xì)胞質(zhì)(圖1)。Nanog蛋白在NSCLC組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為48%(24/50)，以中度-強(qiáng)陽(yáng)性為主；癌旁組織Nanog陽(yáng)性表達(dá)2例，以弱陽(yáng)性為主；正常肺組織中Nanog未見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)；Nanog蛋白在NSCLC組織中的陽(yáng)性表達(dá)顯著高于癌旁組織和正常肺組織(P<0.01)。

圖1 Nanog在肺鱗癌和肺腺癌中表達(dá)(EnVision法，×200)

2.3Nanog mRNA表達(dá)與NSCLC臨床病理參數(shù)的關(guān)系 NSCLC組織中，Nanog mRNA表達(dá)量與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度和病理類型差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，與性別、年齡、腫瘤大小及臨床分期差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 NSCLC患者臨床病理特征與腫瘤組織中Nanog mRNA表達(dá)的關(guān)系

3 討 論

Nanog基因?qū)儆贜K家族基因，2003年由Mitsui等〔9〕和Chambers等〔10〕同時(shí)發(fā)現(xiàn)并報(bào)道，是一種在原始生殖細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞及囊胚內(nèi)細(xì)胞群中均有表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，在胚胎干細(xì)胞和胚胎發(fā)育早期高表達(dá)，而在已分化的組織中降低或消失。Nanog基因是維持外胚層多能性，阻止胚胎干細(xì)胞分化為原始內(nèi)胚層的關(guān)鍵因子，將其敲除可導(dǎo)致胚胎干細(xì)胞向原始內(nèi)胚層分化。研究發(fā)現(xiàn)，Nanog除了在生殖細(xì)胞中表達(dá)外，也在多種實(shí)體腫瘤中表達(dá)，將Nanog基因敲除后，腫瘤的發(fā)展在一定程度上受到抑制，提示Nanog與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，然而究其機(jī)制，目前尚無(wú)確切的定論〔11〕。

肺癌干細(xì)胞是導(dǎo)致肺癌發(fā)生的原始細(xì)胞，CD133+細(xì)胞主要分布在分化較差的腫瘤組織中，隨分化程度增高而減少，具有強(qiáng)致瘤性，而CD133-細(xì)胞則缺乏這種潛力。研究發(fā)現(xiàn)，在肺癌組織中Nanog可以抑制CD133+細(xì)胞向CD133-方向轉(zhuǎn)化，維持CD133+細(xì)胞自我更新等干細(xì)胞特征，其高表達(dá)的肺癌組織侵襲性和耐藥性增強(qiáng)，預(yù)后更差〔12〕。當(dāng)去除Nanog時(shí)，可以降低腫瘤干細(xì)胞的比例，消除腫瘤干細(xì)胞侵襲并抑制上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程，減弱了球體形成的能力，阻斷了肺癌細(xì)胞的致瘤和轉(zhuǎn)移能力〔13〕。

研究報(bào)道，Nanog具有誘導(dǎo)鱗狀細(xì)胞癌形成的潛力，常在人鱗狀細(xì)胞癌中過(guò)表達(dá)，包括食管鱗癌、口腔鱗癌及皮膚鱗癌等，可能與Nanog上調(diào)Zeb1、Twist和miR-21等驅(qū)動(dòng)因子，從而誘發(fā)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤干細(xì)胞特征相關(guān)〔4，18，19〕。此外，本研究結(jié)果表明合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的低分化NSCLC組織中Nanog mRNA表達(dá)量升高，推測(cè)其原因可能為分化程度低的腫瘤細(xì)胞其表型和基因結(jié)構(gòu)與原始幼稚的干細(xì)胞相近，因此具有干細(xì)胞特征的腫瘤細(xì)胞數(shù)量也越多，惡性程度越高，侵襲和轉(zhuǎn)移能力越強(qiáng)。Nanog的表達(dá)可維持干細(xì)胞低分化條件，并維持干細(xì)胞自我更新和增殖能力，這對(duì)于協(xié)助分化信號(hào)至關(guān)重要。雖然本研究中Nanog的表達(dá)與腫瘤大小和臨床分期沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是隨著腫瘤增大，Nanog的表達(dá)相對(duì)增高，TNM臨床分期越晚Nanog基因表達(dá)量越多，提示Nanog基因表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖及惡性程度密切相關(guān)，而這些均是腫瘤預(yù)后不良的相關(guān)因素。Zhao等〔20〕研究顯示，Nanog表達(dá)升高的患者總生存率和無(wú)病生存率較差，提示其可以作為新型腫瘤標(biāo)志物來(lái)指導(dǎo)臨床治療和指示預(yù)后。此外，有研究表明，Nanog表達(dá)上調(diào)可以增強(qiáng)致瘤性，而抑制或消除Nanog則可阻滯腫瘤的發(fā)生發(fā)展，Nanog的表達(dá)與腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移、抵抗治療及復(fù)發(fā)有關(guān)，且與患者的耐藥性和生存率差異呈正相關(guān)〔11〕。然而Nanog調(diào)控NSCLC發(fā)生發(fā)展的具體作用機(jī)制仍不清楚，還有待在更大樣本中進(jìn)一步證明。

綜上，Nanog在NSCLC發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中可能發(fā)揮癌基因的作用，有望成為NSCLC診斷的分子標(biāo)志物及治療的潛在靶點(diǎn)，為研究NSCLC發(fā)病機(jī)制提供了新思路。