王聯(lián)廣

摘 要：參照NY/T761-2008標(biāo)準(zhǔn)，對獼猴桃用乙腈溶劑提取，用氨基柱凈化，最終得到的提取液通過波長（270nm）、流動相（甲醇：水=7：3（V：V））、流動相流速（1.0mL/min）和柱溫（40℃）為色譜條件進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，吡蟲啉出峰對稱，峰寬狹窄，對檢測吡蟲啉效果好;通過添加回收實驗，在0.05～0.5mg/kg水平的回收率在90%左右，RSD在10%以內(nèi)，吡蟲啉檢出限為0.05mg/kg，符合有關(guān)國家農(nóng)藥最高殘留量標(biāo)準(zhǔn)。在本次實驗中未檢測到獼猴桃中吡蟲啉。

關(guān)鍵詞：獼猴桃;農(nóng)藥殘留;吡蟲啉;高效液相色譜;檢測

獼猴桃含有獼猴桃堿、蛋白水解酶、單寧果膠和糖類等有機物，以及鈣、鉀等多種礦物成分，和人體所需17種游離氨基酸，含有豐富的維生素C，其維生素C是蘋果的100倍，被譽為 “水果之王”[1]。其農(nóng)藥殘留吡蟲啉是一種含吡啶環(huán)的煙堿類超高效殺蟲劑 ，能選擇性地抑制害蟲神經(jīng)系統(tǒng)中乙酰膽堿受體，昆蟲接觸藥劑后，中樞神經(jīng)正常傳導(dǎo)受阻，造成害蟲麻痹而死亡[2] ，吡蟲啉的檢測方法主要有生物分析法，液相色譜法、氣相-質(zhì)譜聯(lián)酶法、液相-質(zhì)譜聯(lián)酶法、酶聯(lián)免疫檢測法和免疫層析檢測法等[2]，限于條件有限，本次試驗采用液相色譜法建立獼猴桃中吡蟲啉的檢測。

1儀器與試劑

島津LC-20A高效液相色譜儀，配備DAD檢測器和C18色譜柱，UPT-20純水/超純水系統(tǒng)（四川優(yōu)普超純科技有限公司），QC10260超聲波清洗器（天津市旗美科技有限公司），RE52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海雅榮生化設(shè)備儀器有限公司），XHF-D勻漿機（寧波新芝生物科技有限公司）;吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)溶液100μg/mL（農(nóng)業(yè)部環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（天津）），乙腈（色譜純），氨基柱（500mg/3mL），甲醇（色譜純），紅心獼猴桃（水富基地采購），其他試劑均為分析純，水為超純水，使用前景0.45 m濾膜過濾。

2試驗方法

2.1色譜條件

流動相甲醇：水 = 70：30（V/V ），波長為選擇280nm，流速設(shè)置分別為1.0mL/min，試驗選擇的柱溫40℃[3]。

2.2標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配置

將100μg/mL吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)溶液逐步稀釋，配制成質(zhì)量濃度為10.0 、5.0 、2.0、0.5、0.25、0.1、0.05、0.01μg/mL的吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定其HPLC色譜圖，以檢測的峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（標(biāo)準(zhǔn)方程）。

2.3 測定方法

定性分析：在相同色譜條件下，首先檢測已知吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)溶液的出峰時間，再檢測獼猴桃中吡蟲啉農(nóng)藥殘留，通過對色譜峰保留時間的比較，就可以確定獼猴桃中吡蟲啉出峰時間;定量分析：分別配制不同濃度的吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)溶液，用HPLC測其吸光值，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=A+BX，Y代表模板分子吸光值面積;X代表吡蟲啉濃度，再測定獼猴桃樣品經(jīng)提取的溶液后檢測得到的吸光值面積，進(jìn)而就得到其濃度。

2.4樣品的制備

（1）制樣：將樣品全部切碎，放入食品粉碎機中制成勻漿，制成勻漿后的樣品，放入容器中保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）提?。河梅Q量匙將樣品攪勻，于感量為0.1g的天平上準(zhǔn)確稱取25g試樣，放入150ml燒杯中，加入50ml乙腈，在約15000轉(zhuǎn)/min條件下均質(zhì)2min，經(jīng)濾紙過濾到裝有5g-7gNacL的100mL具塞量筒中。 收集到的濾液大約40ml-50ml，蓋緊蓋子，劇烈震蕩1min，將震蕩后的具塞量筒靜置30min以上，使乙腈相和水相充分分離，用移液管從具塞量筒中準(zhǔn)確吸取10ml上層有機相溶液，于100ml的契形瓶中，設(shè)置水域溫度為38℃左右旋轉(zhuǎn)速率約120r/min 冷卻循環(huán)系統(tǒng)的溫度在4℃以下，真空度保持在0.09-0.1Mpa之間，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至溶液還剩0.5ml左右時，停止旋轉(zhuǎn)，打開放氣閥，取下契形瓶，用氮氣吹至近干備用。

（3）凈化：向蒸發(fā)近干的契形瓶中，用量筒加入2ml的淋洗液（甲醇：二氯甲烷（V：V=95：5 ）），蓋上鋁箔或塞子，待凈化。 氨基柱預(yù)淋洗：將500mg/6ml規(guī)格的氨基柱，用4ml淋洗液預(yù)淋洗，除去填料中的雜質(zhì)并將柱子溶劑化，棄去淋洗液;試樣的添加：當(dāng)預(yù)淋洗溶劑的液面達(dá)到柱吸附層表面時，立即倒入契形瓶中待凈化的溶液，用15ml刻度離心管收集洗脫液;分析物的洗脫：待溶液的液面快要達(dá)到柱吸附層表面時，用2ml淋洗液涮洗契形瓶后，倒入氨基柱中洗脫，待洗脫液的液面快要達(dá)到柱吸附層表面時，再用2ml淋洗液涮洗契形瓶后，洗脫一次，待淋洗液達(dá)到上層篩板時，用洗耳球擠壓，使柱中殘留液體全部流入試管中備用。

（4）過膜：將盛有洗脫液的刻度離心管置于氮吹儀上，在50℃水域溫度下，氮吹蒸發(fā)至近干用甲醇定容至5ml，在渦旋混勻器上混勻，使用0.22um的微孔濾膜過濾后，移入2ml進(jìn)樣瓶中，待測。

2.5樣品回收率的測定

準(zhǔn)確稱取25.0g獼猴桃試樣，于150ml燒杯中，分別添加標(biāo)準(zhǔn)溶液制成0.2、0.5、1.0mg/kg試樣三個水平，分別做重復(fù)3次回收率試驗。加標(biāo)準(zhǔn)溶液的樣品同樣品的處理方法與測定方法相同。

3結(jié)果與分析

3.1色譜條件優(yōu)化結(jié)果

（1）檢測波長的選擇：吡蟲啉吸收波長為選擇280nm。

（2）流動相的實驗：流動相分別為甲醇：水=80：20 （V/V），甲醇：水=75：25（V/V），甲醇：水=70：30（V/V），甲醇：水=65：35（V/V），經(jīng)色譜出圖分析流動相選擇甲醇：水=70：30（V/V）。

（3）流動相流速的實驗：流速分別為 0.5、0.8、1.0、1.2、1.5mL/min，經(jīng)色譜出圖分析，當(dāng)流速減慢時，峰出現(xiàn)增寬，為在分析樣品時有較高的靈敏度，選擇流動相流速1.0mL/min。

（4）色譜柱溫度的實驗：柱溫分別為 30 ℃、35℃和40℃，隨著柱溫逐漸升高，出峰時間逐漸縮短，從色譜圖看，柱溫選擇40℃較好。

綜合上述（1）（2）（3）（4），最終色譜條件溫：波長（270nm）、流動相（甲醇：水=7：3（V：V））、流動相流速（1.0mL/min）和柱溫（40℃）。

3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別進(jìn)吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)溶液0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、2.0mg/L，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=1039.3X+62271.1（Y代表出峰面積，X代表濃度），R為0.9993。

3.3方法的準(zhǔn)確性和精確度

分別添加標(biāo)準(zhǔn)溶液制成0.2、0.5、1.0mg/kg試樣三個水平，分別做重復(fù)3次回收率試驗，結(jié)果：回收率分別90.6%、91.7%、91.1%， RSD分別為6.5%、2.3%、2.4%。

4討論

本次試樣參照NY/T761-2008，獼猴桃試樣經(jīng)乙腈溶劑提取，氨基柱凈化，最終提取液通過波長（270nm）、流動相（甲醇：水=7：3（V：V））、流動相流速（1.0mL/min）和柱溫（40℃）為色譜條件進(jìn)行檢測，吡蟲啉出峰對稱，峰寬狹窄，對檢測吡蟲啉效果好，通過添加回收實驗，在0.05～0.5mg/kg水平的回收率在90%左右，RSD在10%以內(nèi)，吡蟲啉檢出限在0.05mg/kg，符合有關(guān)國家農(nóng)藥最高殘留量標(biāo)準(zhǔn)。在本次實驗中未檢測到獼猴桃中吡蟲啉。

參考文獻(xiàn)：

[1]薛 梅，呂麗丹，蔡向西，張 林，羅蘭艷，范厚明 .畢節(jié)山區(qū)紅心獼猴桃生產(chǎn)條件及高產(chǎn)栽培技術(shù).現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2017，（7）： 89-90.

[2]譚桂玉，陳俊玉，劉偉華，何 佳，李 燕，胡志鑫.農(nóng)藥吡蟲啉酶聯(lián)免疫檢測方法研究進(jìn)展.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，46（12）：17-19.

[3]王曉靜，馬文平.高效液相色譜法測定柚子中4種農(nóng)藥殘留.寧夏農(nóng)林科技 ，2014，55（03）：58-61.