彭艷輝 鄧?yán)蚶?周云

(郴州市第一人民醫(yī)院北院(兒童醫(yī)院)血液科，湖南 郴州 423000)

噬血細(xì)胞性淋巴組織細(xì)胞增生癥(hemophagocytic lymphohistipcytosis，HLH)又稱噬血細(xì)胞綜合征(hemophagocytic syndrome，HPS)，于1979年首先由Risdall等報告它是以全血細(xì)胞減少、發(fā)熱、肝脾腫大、高甘油三酯血癥和或(低纖維蛋白原血癥)、鐵蛋白異常升高、骨髓、淋巴結(jié)、肝脾出現(xiàn)噬血現(xiàn)象等為臨床特征的一類綜合征。它起病急、病情進展快、病死率高，嚴(yán)重威脅到患兒生命。該病分為兩種類型：原發(fā)性(或遺傳性)HLH和繼發(fā)性HLH。EBV-HLH是繼發(fā)性HLH中最常見的類型。EBV-HLH預(yù)后較差，病死率超過50%[1]。研究[2]表明，輔助 T 細(xì)胞/調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞(Treg)調(diào)節(jié)失衡可能與HPS的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。輔助T細(xì)胞 17(Th17)是2005年新發(fā)現(xiàn)的一類屬于CD4+T細(xì)胞亞群的細(xì)胞類型，主要分泌促炎因子IL-17、IL-22[3]。Treg細(xì)胞是一類具有維持免疫耐受、抑制T細(xì)胞過度活化的雙重作用的T細(xì)胞亞群。Foxp3(Forkhead boxp3，F(xiàn)oxp3)-叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子家族的一員，是Treg 最特異性分子標(biāo)記，CD4+Foxp3+的 T 細(xì)胞可作為 Treg的生物指標(biāo)[4]。目前已有研究證實Th-17 / Treg 細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)在維持正常免疫應(yīng)答和防止自身免疫性疾病中發(fā)揮了關(guān)鍵性的作用，但該穩(wěn)態(tài)與EBV相關(guān)性HPS發(fā)生發(fā)展的關(guān)系尚未報道。本文從細(xì)胞水平及分子水平檢測了HPS 患兒Th17細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)量的變化，初步探討了Th17/Treg失衡在EBV相關(guān)性HPS中發(fā)病及臨床療效評估中的作用。

1 資料與方法

1.1資料來源 選擇2015年9月至2017年12月郴州市人民醫(yī)院北院(兒童醫(yī)院)血液科收治的62例確診為EBV相關(guān)性HPS患兒為治療組，其中男34例，女28例，年齡8個月至9歲，平均(6.52±2.44)歲；血清EB病毒DNA拷貝數(shù)平均為(5.56±1.48)×105拷貝數(shù)/mL。初治組1例死亡，3例治療未緩解，其余58例為治療緩解組。緩解組血清EB病毒DNA拷貝數(shù)(2.76±3.48)×103拷貝數(shù)/mL。作為對照，選取本院同期門診體檢健康兒童60例為健康對照組，男32 例，女28例，年齡8個月至10歲，平均(6.87±2.35)歲。對照組及治療組(初治組、緩解組)年齡及性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。診斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)滿足下列8條中的5條：①發(fā)熱；②脾大；③血細(xì)胞減少(外周血三系或兩系減少)：Hb<90g/L(低于4周的嬰幼兒Hb<100 g/L)，血小板<100×109/L，ANC<1.0×109/L；④高甘油三酯血癥和(或)低纖維蛋白原血癥；空腹TG≥3.0 mmol/L，F(xiàn)ib≤1.5 g/L；⑤骨髓、脾臟或淋巴結(jié)中有噬血證據(jù)，無惡性腫瘤證據(jù)；⑥NK細(xì)胞活性降低或缺乏；⑦血清鐵蛋白≥500 μg/L；⑧可溶性CD25≥2 400 U/mL；(2)EBV感染的證據(jù)：滿足下列2條之一，①血清學(xué)抗體檢測提示原發(fā)性急性EBV感染；②分子生物學(xué)方法從患者血清、骨髓、淋巴結(jié)等受累組織中檢測EBV陽性。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有入選對象年齡≤14歲；(2)診斷符合EBV相關(guān)性噬血細(xì)胞綜合征。(3)患兒監(jiān)護人均被告知噬血細(xì)胞綜合征的化療方案，并簽署知情同意書。提交醫(yī)院倫理學(xué)委員會審核批準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：心肝肺腎功能疾病；惡性腫瘤；先天免疫性疾病及代謝性疾病、原發(fā)性HLH。

1.2方法

1.2.1外周血Th17細(xì)胞百分比檢測 采集初治組、治療組及對照組清晨空腹靜脈血各2mL，采用密度梯度離心法獲得外周血單一核細(xì)胞(PBMCs)，加入等體積RPMI 1640培養(yǎng)液中，與佛波酯和離子霉素在37 ℃含5% CO2培養(yǎng)箱共培養(yǎng)5 h，PBS緩沖液洗滌細(xì)胞后棄上清。向管中加入CD3 PE-Cy5、CD8α FITC、IL-17 PE室溫下避光反應(yīng)孵育30 min。加入固定劑100 μL，孵育后再加入破膜劑A 100 μL室溫孵育15 min，PBS洗滌1次后離心收集細(xì)胞，加入破膜劑B 100 μL，管中加入IL-17抗體，對應(yīng)的對照管中加入同等μg數(shù)的同型對照，混勻，室溫孵育20 min，PBS洗滌后將細(xì)胞重懸于500 μL PBS液中，隨后以在FACS CantoⅡ流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.2外周血Treg細(xì)胞檢測 采集HPS 初治組、治療組及對照組清晨空腹6點 EDTA 抗凝靜脈血1 000 μL加入流式專用試管，分別加入CD4-FITC、CD25-PE、CD127-PE-CY5單克隆抗體各10 μL 混勻，暗室孵育20 min，加入溶血素1 mL，充分混勻，加2 mL PBS緩沖液，以1 500 r/min 離心5 min，棄上清，加入500 μL PBS 緩沖液重懸細(xì)胞后，立即以FACS CantoⅡ 流式細(xì)胞儀檢測，分析軟件進行分析。

1.2.3外周血Foxp3 mRNA 表達的檢測 淋巴細(xì)胞分離液分離外周血淋巴細(xì)胞，Trizol一步法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA及行RT-PCR檢測 Treg 表達叉頭翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(Foxp3)mRNA(CD4CD25+Foxp3+Treg 轉(zhuǎn)錄因子)、Th17 表達孤核受體(RORγt)mRNA水平表達。表1列舉了基因引物序列、擴增產(chǎn)物長度。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算mRNA相對表達量(β-actin校正值)。引物由上海生工合成。

表1 基因引物序列及擴增產(chǎn)物長度

2 結(jié) 果

2.1初治組和對照組外周血Th17細(xì)胞及Treg細(xì)胞百分率比較 初治組Th17細(xì)胞百分率均明顯高于HPS對照組及緩解組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。外周血 Treg 細(xì)胞的百分率檢測 HPS 患兒初治組外周血 Treg 細(xì)胞的百分率明顯低于HPS對照組，差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；治療后，緩解組Th17細(xì)胞百分率降低，與初治組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，但與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。而緩解組Treg 細(xì)胞升高，相對初治組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但平均數(shù)值比對照組低，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 HPS初治組、緩解組及對照組外周血Treg細(xì)胞及Th17細(xì)胞百分率的比較

注：初治組VS對照組，aP<0.01；緩解組VS初治組，bP<0.05；初治組VS對照組，cP<0.01；緩解組VS初治組，dP<0.01；對照組VS緩解組，eP<0.05；緩解組VS對照組，fP> 0.05。

2.2不同分組的外周血Foxp3mRNA、RORtmRNA的表達 HPS初治組外周血RORTmRNA的相對表達量顯著高于健康對照組，而HPS初治組外周血Foxp3mRNA的相對表達量顯著低于健康對照組，兩者差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)。而治療緩解組外周血RORtmRNA較初治組明顯下降，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，緩解組同對照組相比，無顯著差異(P>0.05)；治療緩解組外周血Foxp3mRNA較初治組明顯上升，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但仍低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 HPS初治組、緩解組及對照組外周血RORtmRNA及Foxp3mRNA表達水平的比較

表3 HPS初治組、緩解組及對照組外周血RORtmRNA及Foxp3mRNA表達水平的比較

組別nFoxp3mRNAROR?tmRNA對照組601.18±0.21e0.99±0.18f治療組62初治組(n=4)0.33±0.12a2.89±0.36c緩解組(n=58)0.71±0.18b1.05±0.23d

注：初治組VS對照組，aP<0.01；緩解組VS初治組，bP<0.05；初治組VS對照組，cP<0.01；緩解組VS初治組，dP<0.01；對照組VS緩解組，eP<0.05；緩解組VS對照組，fP> 0.05。

3 討 論

HPS患者血細(xì)胞減少有多種因素參與：(1)噬血細(xì)胞增多，加速血細(xì)胞的破壞；(2)血清中存在造血祖細(xì)胞增殖的抑制性物質(zhì)，骨髓內(nèi)粒系和紅系前體細(xì)胞和巨核細(xì)胞進行性減少，歸因于抑制性單核因子和淋巴因子的產(chǎn)生，諸如γ-干擾素、腫瘤壞死因子(TNF)和白介素-1以及造血生長抑制因子的產(chǎn)生。研究[5]表明，Epstein-Barr病毒相關(guān)的HPS(EBV-HLH)被認(rèn)為是繼發(fā)性HLH的主要亞型，在亞洲國家發(fā)病率較高，任何遺傳背景都可能影響繼發(fā)性HLH的發(fā)病。其病理生理機制為NK細(xì)胞/T淋巴細(xì)胞受到EBV感染后，出現(xiàn)功能缺陷，不能及時有效地清除受到感染的靶細(xì)胞，導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞異?；罨筎NF-α、IFN-γ等細(xì)胞因子分泌水平增加，促使大量活化的T淋巴細(xì)胞和細(xì)胞因子，在機體內(nèi)聚集，進而浸潤組織、損害臟器，形成HPS[6]。有研究[7]表明，T細(xì)胞亞群免疫功能紊亂在HLH發(fā)病中起著重要作用。但目前關(guān)于Th17/Treg失衡在EBV病毒相關(guān)性HPS的發(fā)生中研究甚少。

研究[8-10]證實，在炎癥或感染情況下，白細(xì)胞介素(IL)-6和TCFβ的刺激下，初始CD4+T淋巴細(xì)胞主要朝著Th17細(xì)胞分化，并主要分泌IL-17，IL-22等促炎癥因子，產(chǎn)生炎癥的放大效益。而當(dāng)外源性抗原刺激后誘導(dǎo)產(chǎn)生的Treg細(xì)胞，可通過分泌IL-10等抑制性細(xì)胞因子發(fā)揮免疫抑制功能。故Th17/Treg失衡在自身免疫性疾病、炎癥性疾病、過敏反應(yīng)等方面發(fā)揮舉足輕重的作用。本研究很好地揭示了EB病毒感染機體后，轉(zhuǎn)錄因子RORγtmRNA水平升高，從而促進了Th17細(xì)胞發(fā)育和促使其分泌特異性促炎因子IL-17，，進而導(dǎo)致其他炎癥因子的水平如 IL- 6、IL-1、TNF-α、粒細(xì)胞集落刺激因子及多種趨化因子等的提高，導(dǎo)致了炎癥瀑布式反應(yīng)[11-12]并引起單核巨噬細(xì)胞增殖并且功能亢進，導(dǎo)致多臟器功能損害。本研究結(jié)果顯示，在治療緩解組中，Th17細(xì)胞百分比明顯下降，較初治組有統(tǒng)計學(xué)意義，與對照組無顯著差異。提示可能在EB病毒感染相關(guān)性噬血細(xì)胞綜合征治療過程中，監(jiān)測Th17細(xì)胞百分比及相關(guān)炎癥細(xì)胞因子的水平變化對疾病療效的評判有重要的臨床意義。與研究[13-17]結(jié)果一致

我們還發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞百分比及Foxp3mRNA相對表達量在EB病毒感染相關(guān)性HPS初治患者體內(nèi)顯著下降，且按照噬血細(xì)胞綜合征指南治療后，治療緩解組Treg細(xì)胞百分比及Foxmp3mRNA水平明顯上升，但仍低于對照組。張茜[18]的臨床研究中提到，在機體免疫過程中，IL-6對Th17細(xì)胞與 Terg 細(xì)胞間平衡性具有關(guān)鍵性的調(diào)控作用，且其對初始CD4+T的分化方向具有決定作用，影響機體的免疫應(yīng)答傾向，所以我們推測可能在EBV相關(guān)性HPS中，EBV靶細(xì)胞T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞等功能缺陷，EB病毒清除障礙，某些炎癥因子促進了Th17細(xì)胞分化及發(fā)育，進一步產(chǎn)生炎癥級聯(lián)擴大效應(yīng)，從而抑制了Treg細(xì)胞的產(chǎn)生，不能有效地發(fā)揮抑制T淋巴細(xì)胞過度活化的作用。本研究結(jié)果就提示了Treg細(xì)胞介導(dǎo)的免疫耐受在EBV相關(guān)性HPS的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。同時在臨床中監(jiān)測外周血Treg細(xì)胞數(shù)及相關(guān)細(xì)胞因子水平對臨床療效評估亦有重大的臨床意義。

綜上所述，在EBV相關(guān)性HPS發(fā)生和發(fā)展的多個環(huán)節(jié)，Th17/Treg細(xì)胞發(fā)揮了重要的作用，監(jiān)測Treg細(xì)胞及Th17細(xì)胞百分比及相關(guān)細(xì)胞因子有效地調(diào)節(jié)機體的Treg 細(xì)胞及Th17細(xì)胞，可能為HPS臨床療效評判及干預(yù)治療提供新的思路。