楊以恒 藏平 張偉同

(1.菏澤市立醫(yī)院小兒外科，山東 菏澤 274000；2.湖南省兒童醫(yī)院兒科，湖南 長沙 410000)

腎母細(xì)胞瘤也稱為腎胚胎腫瘤，是一種混合胚胎腫瘤[1]。腎母細(xì)胞瘤是兒童中最常見的惡性腫瘤。在兒科疾病手術(shù)中占絕大多數(shù)，約占兒童所有實體瘤的8%[2]。腎母細(xì)胞瘤發(fā)病率約為百萬之二，發(fā)病年齡為1～3歲，發(fā)病高峰為3歲[2]。手術(shù)、化療和放療的聯(lián)合療法大大改善了腎母細(xì)胞瘤患者的預(yù)后[3]。然而，這些方法有可能引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)。microRNA是長度約為18～25個核苷酸的內(nèi)源RNA，miRNA可以與其靶基因的3’UTR結(jié)合以抑制蛋白質(zhì)翻譯[4]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)miRNA可以在多種細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用[5]。因此，對相關(guān)miRNA的透徹研究可能有助于解釋腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。本研究旨在探討腎母細(xì)胞瘤組織中miR-613表達(dá)水平及其抑制腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實驗樣本收集 選擇本院2015年10月至2018年7月手術(shù)切除的腎母細(xì)胞瘤體及癌旁非腫瘤腎臟組織(距離病灶至少2 cm)各64例。所有受試者術(shù)前均未行放療和化療。患者及家屬知情，且簽署同意書，本研究所有實驗方案及內(nèi)容獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2實驗材料和儀器

1.2.1實驗材料 人腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞系(SK-NEP-1和G401)(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)學(xué)院細(xì)胞庫)；miR-613模擬物(mimics)和對照mimics negative control(miR-NC)(廣州市銳博生物科技有限公司)；胰蛋白酶、DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清(Gibco公司)；Interferin 轉(zhuǎn)染試劑、MTT試劑盒和Taqman microRNA assay Real-time PCR試劑盒(美國Sigma公司)；兔抗GAPDH和FRS2多克隆抗體(美國Cell Signaling Technology公司)；Lipofectamine3000 和Trizol試劑盒(美國Invitrogen公司)；AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)。

1.2.2實驗儀器 超凈工作臺和CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific公司)；流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)；Real-time PCR儀(Roche公司)。

1.3腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞培養(yǎng)和miR-613模擬物轉(zhuǎn)染

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) 按照9(DMEM培養(yǎng)基)∶1[胎牛血清(FBS)]配置培養(yǎng)基，用其培養(yǎng)人腎母細(xì)胞瘤系SK-NEP-1和G401細(xì)胞株，置于CO2恒溫培養(yǎng)箱孵育，每隔1～2 d換培養(yǎng)液。細(xì)胞達(dá)到80%～85%匯合，用胰蛋白酶消化，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并保存生長狀態(tài)好的細(xì)胞株用于實驗。

1.3.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將對數(shù)生長期的細(xì)胞分為空白組、miR-NC組和miR-613 mimics組；采用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染miR-NC和miR-613 mimics分別至miR-NC組和miR-613 mimics組，空白組不加任何轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。選取SK-NEP-1和G401 2株人腎母細(xì)胞瘤株，所有操作均按照試劑盒說明書進(jìn)行。(1)配置試劑：將miR-NC和miR-613 mimics樣品離心，用焦碳酸二乙酯(diethy pyrocarbonate，DEPC)水稀釋成20 μmol/L母液，置于-20 ℃?zhèn)溆?；取適量無血清Opti-MEMI培養(yǎng)基稀釋miR-NC或miR-613 mimics母液(A液)和 Lipofectamine2000(B液)，輕輕混勻；將A液和B液混合(C液)，室溫放置20～30 min。(2)培養(yǎng)細(xì)胞：在6孔板上種植細(xì)胞，每孔2 mL培養(yǎng)液，等細(xì)胞匯合度達(dá)80%時，開始實驗。(3)轉(zhuǎn)染：將C液加入6孔板孵育6h后，換成含10%FBS的DMEM 培養(yǎng)基，置于CO2恒溫培養(yǎng)箱孵育。

1.4q-PCR檢測 Real-time PCR檢測組織和腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞株中miR-613的表達(dá)用Trizol試劑盒提取癌旁組織、腎母細(xì)胞瘤組織和腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞株中總RNA；采用 Taqman microRNA assay Real-time PCR試劑盒和Real-time PCR儀進(jìn)行分析。實驗重復(fù)3～5次，細(xì)胞實驗中設(shè)置8個復(fù)孔。組織和細(xì)胞中 miR-613表達(dá)水平采用2-ΔΔCt法計算。引物序列見表1。

表1 qPCR引物序列

1.5MTT檢測過表達(dá) miR-613 對腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞系增殖的影響 實驗分為空白組、miR-NC 組和miR-613 mimics 組，每組設(shè)8個平行復(fù)孔。96孔板200 μL腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，加入20 μL 5 g/L 的MTT，避光孵育3 h;再去上清，加入150 μL DMSO 孵育10 min；最后，用酶標(biāo)儀在570 nm波長下檢測吸光度值。實驗重復(fù)3～5次。

1.6流式細(xì)胞儀檢測過表達(dá)miR-613對腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡的影響 實驗分為空白組、miR-NC組和miR-613 mimics 組，每組設(shè)8個平行復(fù)孔。將轉(zhuǎn)染48 h腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞收集后，根據(jù)Annexin Ⅴ-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書處理，最后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡并分析數(shù)據(jù)。實驗重復(fù)3～5次。

1.7雙熒光素酶報告基因檢測miR-613對FRS2的靶向調(diào)控作用 將G401細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)到50%～60%即可用于轉(zhuǎn)染。試驗分為4組，每組設(shè)個復(fù)孔：(1)miR-NC+FRS2WT；(2)miR-613+FRS2WT；(3)miR-NC+FRS2 MT；(4)miR-613+FRS2 MT。細(xì)胞接種12 h后更換培養(yǎng)基，48 h后，根據(jù)雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書上機(jī)檢測各組熒光素酶的活性。

1.8Western blotting 檢測miR-613對 G401細(xì)胞中FRS2蛋白表達(dá)的影響 收集各組細(xì)胞，加入裂解液提取胞內(nèi)總蛋白。先用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法檢測每組蛋白濃度，再使蛋白變性后，每個樣品取40～50 μg蛋白經(jīng)12%SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移到PVDC膜，室溫封閉1～2 h；加入兔抗FRS2多克隆抗體(1∶2 000)和兔抗GAPDH多克隆抗體(1∶25 000)，室溫孵育2 h;洗膜后，加入二抗，HRP標(biāo)記的山羊抗兔 IgG(H + L)(1∶1 000)孵育1～2 h;最后用ECL顯影法，進(jìn)行曝光。

2 結(jié) 果

2.1miR-613的相對表達(dá)量 Real-time PCR檢測結(jié)果顯示，腎母細(xì)胞瘤組織中miR-613表達(dá)量明顯低于癌旁組織[(0.46±0.18)VS(1.10±0.06)]，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=22.65，P<0.05)。見圖1。

圖1 腎母細(xì)胞瘤組織和癌旁組織中miR-613的相對表達(dá)量

2.2miR-613表達(dá)與腎母細(xì)胞瘤患者病理特征的關(guān)系 綜合64例腎母細(xì)胞瘤患兒的臨床病理資料，方差分析檢驗不同年齡、性別、腫塊大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及病理學(xué)分型的miR-613的表達(dá)水平均無統(tǒng)計學(xué)差異，但miR-613表達(dá)水平與臨床分期有相關(guān)性，臨床Ⅰ～Ⅱ期患兒的腫瘤標(biāo)本中miR-613表達(dá)水平高于臨床Ⅲ～Ⅳ期的患兒，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 腎母細(xì)胞瘤組織miR-613表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性

2.3腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中miR-613過表達(dá) 在腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞系(SK-NEP-1和G401)中瞬時轉(zhuǎn)染 miR-613 mimics，建立過表達(dá) miR-613腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染24 h，用Real-time PCR檢測miR-613表達(dá)?？瞻捉M miR-613表達(dá)量設(shè)為1，在SK-NEP-1細(xì)胞系中，miR-NC 組為(0.94 ±0.15)，miR-613 mimics 組為(6.17 ±0.36)；在G401細(xì)胞系中，miR-NC組為(0.97±0.07)，miR-613 mimics組為(6.08±0.72)；兩組腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中，空白組和miR-NC組中miR-613表達(dá)差異均無顯著性(P>0.05)，miR-613 mimics 組中miR-613表達(dá)明顯高于空白組和miR-NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 兩種腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中miR-613表達(dá)水平

2.4過表達(dá)miR-613對SK-NEP-1和G401細(xì)胞增殖的影響 分別在培養(yǎng)0，24，48，72 h用MTT法檢測過表達(dá)miR-613對SK-NEP-1和G401細(xì)胞增殖水平的影響。結(jié)果顯示，miR-613 mimics 組細(xì)胞活力顯著低于空白組和miR-NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

圖3 過表達(dá) miR-613抑制腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖

2.5過表達(dá) miR-613對SK-NEP-1和G401細(xì)胞凋亡情況的影響 分別在培養(yǎng)0，24，48，72 h用用流式細(xì)胞儀檢測過表達(dá)miR-613對SK-NEP-1和G401細(xì)胞凋亡情況的影響。結(jié)果顯示，miR-613 mimics 組細(xì)胞凋亡率顯著高于空白組和miR-NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 過表達(dá) miR-613對腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡情況的影響

2.6雙熒光素酶報告基因檢測miR-613對FRS2的靶向調(diào)控作用 利用microRNA org軟件預(yù)測出miR-613與FRS2之間存在良好的堿基互補(bǔ)配對關(guān)系(圖5)，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建野生型和突變型的FRS2真核表達(dá)載體。雙熒光素酶報告基因檢測顯示共轉(zhuǎn)染miR-613+FRS2 WT的G401細(xì)胞熒光活性顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖6。

圖5 miR-613與FRS2 3’UTR存在互補(bǔ)堿基配對的序列

注：1.miR-NC+FRS2WT；2.miR-613+FRS2WT；3.miR-NC+FRS2；4.miR-613+FRS2 MT。

圖6各組G401細(xì)胞中熒光素酶活性的比較

2.7過表達(dá)miR-613對G401細(xì)胞中FRS2 mRNA表達(dá)量的影響 用q-PCR檢測G401細(xì)胞中FRS2 mRNA表達(dá)情況。轉(zhuǎn)染72h后，miR-613 mimics組細(xì)胞FRS2 mRNA表達(dá)量顯著低于miR-NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖7。

圖7 miR-613對G401細(xì)胞中FRS2 mRNA表達(dá)量的影響

2.8過表達(dá)miR-613對G401細(xì)胞FRS2蛋白表達(dá)量的影響 用Western blotting檢測G401細(xì)胞中FRS2表達(dá)情況。轉(zhuǎn)染72h后，miR-613 mimics組細(xì)胞FRS2蛋白表達(dá)量顯著低于miR-NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖8。

圖8 miR-613對G401細(xì)胞中FRS2 蛋白表達(dá)量的影響

3 討 論

目前腎母細(xì)胞瘤假說主要包括“雙擊模型理論”和“腎源性休息理論”[6-7]，但這些假說解釋腫瘤的發(fā)病機(jī)制都有各自局限性。近年來，由于分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，越來越多的研究表明，miRNA在各種腫瘤的進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用。例如，F(xiàn).Karimi Dermani等[8]發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可通過上調(diào)大腸癌中miR-200c來抑制細(xì)胞凋亡、抑制侵襲，并從EMT轉(zhuǎn)變?yōu)镸ET表型。Shen等[9]的研究表明在人乳腺癌中miR-660-5p通過靶向調(diào)控TFCP2的表達(dá)促進(jìn)乳腺癌增殖，為乳腺癌提供及極有前景的治療策略。X.M.Tian等[10]發(fā)現(xiàn)miR-509-5p通過靶向MDM2抑制前列腺癌的細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。Y.Du等[11]報道m(xù)iR-543通過靶向RKIP促進(jìn)前列腺癌的細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移。MiR-613是一種與腫瘤相關(guān)的miRNA，在幾種類型的癌癥中表達(dá)下調(diào)并起著抗癌基因的作用，如前列腺癌[12]、乳腺癌[13]、骨肉瘤[14]和結(jié)腸直腸癌[15]等。然而，miR-613在腎母細(xì)胞瘤的發(fā)生和發(fā)展中的作用和機(jī)制尚不清楚。

在本研究中，我們證實miR-613在Wilms的腫瘤組織中與鄰近的正常組織相比表達(dá)下調(diào)，這意味著miR-613在腎母細(xì)胞瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著潛在的抑癌作用。此外，miR-613的過表達(dá)減弱了腎母細(xì)胞瘤的增殖能力。進(jìn)一步通過流式試驗證實過表達(dá)miR-613可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡?？傊@些發(fā)現(xiàn)表明miR-613對Wilms腫瘤的細(xì)胞增殖具有抑制作用。為了進(jìn)一步明確miR-613如何抑制Wilms的腫瘤細(xì)胞腫瘤增殖的潛在機(jī)制，我們通過生物信息學(xué)分析預(yù)測并選擇FRS2(成纖維細(xì)胞生長因子2)作為miR-613的新靶標(biāo)。研究表明FRS2參與乳腺癌[16]和前列腺癌[17]等某些惡性腫瘤的腫瘤發(fā)生。FRS2可能主要通過介導(dǎo)前列腺癌中的促有絲分裂FGF信號傳導(dǎo)來調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生，并且可以作為激素受體陽性乳腺癌患者的預(yù)后生物標(biāo)志物。FRS2也可以通過腫瘤發(fā)生中的miRNA調(diào)節(jié)，例如胃癌中的miR-206[18]。在本研究中，我們通過雙熒光素酶報告基因證實miR-613與FRS2直接結(jié)合，且過表達(dá)miR-613可以顯著抑制FRS2基因的mRNA及蛋白表達(dá)，這就表明miR-613可能通過調(diào)節(jié)FRS2表達(dá)進(jìn)而抑制腎母細(xì)胞瘤的增殖。