劉益鋒，李蓉，劉恭源，張朋杰，容裕棠，張憲臣，胡儀光

（中山海關技術中心，廣東中山528400）

我國GB 2760-2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》[1]中食品添加劑的定義：為改善食品品質和色、香、味，以及為防腐、保鮮和加工工藝的需要而加入食品中的人工合成或者天然物質。在焙烤食品中，食品添加劑也都發(fā)揮著各自實際的作用與價值。GB 2760-2014 中明確規(guī)定焙烤食品中允許添加的色素和甜味劑種類和限量。有些食品生產者為節(jié)約成本，超量添加合成色素和甜味劑，給人民健康帶來威脅，因此，有必要建立高靈敏、準確、快速的篩查檢測方法[2]。

目前，已有檢測合成色素和甜味劑類物質的標準[3-6]，測定方法主要有離子色譜法（ion chromatography，IC）[7-8]、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[9-10]和液相色譜-串聯(lián)質譜法（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry ，HPLC-MS/MS）[11-17]等，現階段合成色素和甜味劑的檢測大多使用液相色譜法。但這些傳統(tǒng)的方法檢出限較高，并且無法從根本上解決基質干擾的問題，容易出現假陽性的結果。目前尚未見采用四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜測定焙烤食品中合成色素和甜味劑的報道，四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜儀（high resolution mass spectrometer，HR/MS）具有分辨率高及定量能力好的優(yōu)點，高分辨質譜可以利用目標物母離子的精確分子量直接定量，無需對目標物逐個優(yōu)化子離子及相關參數，對于多個目標物分析可以極大地降低檢測的時間，同時又能很好地避免受基質干擾而產生假陽性的現象。并且靜電場軌道阱高分辨質譜具有基于數據庫的多種未知物的篩查功能，適用于對食品中多種有害物進行快速篩查[18-20]。

本研究建立超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜法同時測定焙烤食品中10 種合成色素和甜味劑。通過建立該方法，可以對進出口焙烤食品進行有效把關，同時對保障國內焙烤食品的質量安全具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

亮藍（Lot.17001）、酸性橙Ⅱ（Lot.17001）、新紅（Lot.17001）、檸檬黃（Lot.17001）、莧菜紅（Lot.17001）、胭脂紅（Lot.17001）、誘惑紅（Lot.17001）標準溶液（0.5 mg/mL）：中國計量科學研究院；糖精鈉（Lot.G134259）、安賽蜜（Lot.G129941）、甜蜜素（Lot.G1319899）（純度均大于等于 98%）：德國 Dr.Ehrensorfer。

乙腈、正己烷（色譜純）：默克股份兩合公司；乙酸銨（分析純）：上海安譜公司。

1.2 儀器與設備

UltiMate 3000Q-Exactive 高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜（ultra-high performance liquid coupled with quadrupole/exactive orbitrap mass spectrometry，UPLC-HQMS），配有 HESI Ⅱ離子源：美國Thermo Fisher 公司；Coulter Avanti J-26XP 超高速冷凍離心機：美國BECHMAN 公司；Syncore 平行定量濃縮儀、B-740 再循環(huán)冷卻系統(tǒng)、V-700/701 真空泵：瑞士BUCHI 公司；VORTEX 3 渦旋震蕩器：德國 IKA 公司；DTY-B1200 電子天平：福州華志科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液配制

準確稱取糖精鈉、安賽蜜、甜蜜素標準物質約10.0 mg，于各自的10 mL 容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，配成1.0 mg/mL 的標準儲備液，置于4 ℃冰箱中保存。

混合標準工作液：分別準確吸取適量上述準儲備液配成亮藍、日落黃、酸性橙Ⅱ、新紅、莧菜紅、胭脂紅、誘惑紅和糖精鈉濃度為10 mg/L 及安賽蜜、甜蜜素濃度為1 mg/L 混合標準工作液。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：Waters Atlantis T3（3 μm，2.1 mm×150 mm）；流動相：乙腈（A）-20 mmol/L 乙酸銨溶液（B），梯度洗脫條件：0～0.5 min，5%A；0.5 min～3 min，5%～50%A；3 min～5 min，50%A；5 min～7 min，50%～90%A；7 min～7.1 min，90 %～5 % A；7.1 min～10min，5 % A。流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：10 μL。

1.3.3 質譜條件

加熱電噴霧離子（heating electrospray ion source，HEIS）源溫度為350 ℃；離子傳輸溫度為320 ℃；鞘氣為40 unit；輔助氣為40 unit；毛細管電壓為3.2 kV；離子傳輸管溫度為325 ℃。Full scan/ddms2 掃描模式：采集范圍為80 Da～1 000 Da，正負切換采集；一級質譜分辨率為70000，二級質譜分辨率為17500；碰撞池能量（normalization collision energy，NCE） 為 20、40、60 eV，10 種添加劑的質量分析和色譜分析參數如表1 所示。

1.3.4 樣品處理

準確稱取2 g（精確至0.01 g）樣品于50 mL 離心管中，加入20 mL 20 %乙腈1 %氨水溶液，渦旋混合1 min，于 50 ℃水浴超聲 20 min 提取，加正己烷 10 mL，渦旋混合1 min，然后于4 500 r/min 離心5 min，棄去有機相，取2 mL 水相轉移至離心管中，10 000 r/min 離心5 min，清液過0.22 μm 有機相濾膜，供上機測定。

表1 10 種添加劑的質量分析和色譜分析參數Table 1 Parameters of MS and HPLC for 10 additives

2 結果與分析

2.1 流動相的優(yōu)化

本方法對流動相的種類進行了考察。比較了甲醇-甲酸乙酸銨水、乙腈-甲酸乙酸銨水、甲醇-乙酸銨、乙腈-乙酸銨作為流動相時各化合物的分離情況，10 種添加劑標準物質色譜圖見圖1。

圖1 10 種添加劑物標準物質色譜圖Fig.1 Chromatograms of 10 additives

甲醇體系和乙腈體系相比較，乙腈體系分離效果更好；流動相中加入甲酸后對色素的峰形和保留時間影響較大，有些峰分裂；流動相中加入乙酸銨后色譜峰峰形得到明顯改善；并對乙酸銨的濃度進行了進一步考察，結果表明流動相中乙酸銨濃度為20 mmol/L時多數化合物色譜峰響應值較高，峰形尖銳，因此選擇乙腈-20 mmol/L 乙酸銨作為流動相進行梯度洗脫。

2.2 質譜條件的優(yōu)化

本方法以流動注射方式對10 種目標物在負切換離子模式下進行一級全掃描，采用Q Exactive 高分辨質譜的一級母離子全掃描加數據依賴的二級子離子掃描模式（Full MS/dd-MS2），設定涵蓋目標物的質量數范圍（50 m/z～500 m/z）進行一級全掃描，并以每個化合物的理論質量數建立二級掃描的目標列表。在實際掃描過程中，當一級全掃描發(fā)現目標列表里的母離子時，且信號強度超過預設值后，就會觸發(fā)數據依賴子離子掃描模式，進而獲得對應母離子精確質量數的二級離子全掃描質譜信息。歐盟EC 2002/657 號文件對多級質譜確證時的碎片類型和識別點有明確規(guī)定，禁用物質確證須有4 個識別點，在高分辨質譜中，母離子的識別點為2.0，子離子的識別點為2.5，因此只需一個母離子和一個子離子即可對目標物確證。通過10 種甜味劑和合成色素的二級質譜全掃描獲得碎片離子信息，以實現定性確證，避免檢出假陽性或假陰性樣品的情況發(fā)生。

2.3 前處理方法優(yōu)化

試驗發(fā)現如果單獨采用純水體系和乙腈-水體系對待測物進行提取，色素類物質的回收率均不太理想，波動較大，這可能由于色素類物質大多為苯磺酸鈉型，只有促進其電離，才能在極性的乙腈-水體系中得到較好的萃取結果，故考慮向體系中添加一定的氨水溶液，增加色素類物質在萃取溶液中的電離度進行回收試驗。試驗考察了0、0.5%、1%、2%（體積分數）氨水對萃取效果的影響，結果表明：隨氨水含量的增加，色素類物質的回收率有一定提高，但是超過1%后，由于提取雜質的增加，以及樣品中氨影響檢測物質電離，色素類物質的回收率波動較大，有時回收率超過200%，嚴重影響分析結果，也影響到部分甜味劑的萃取和出峰效果，綜合考慮各待測物的萃取效率，通過試驗比較，選擇含1%氨水的乙腈（氨水∶乙腈=20 ∶80，體積比）溶液作為提取劑。為了減少操作步驟及提高提取效率，采用超聲提取方式對樣品進行提取。同時考察了不同提取時間和和提取次數的提取效果，確定用20 mL 20%乙腈1%氨水溶液，在50℃水浴超聲提取20 min。

2.4 線性范圍與檢出限

在高分辨質譜的分析中，其提取的精確質量數色譜圖無基線噪音，因此采用傳統(tǒng)信噪比方法無法定義方法的檢出限。本方法采用基質標準曲線的y 軸截距除以斜率的標準偏差的3.3 倍以上數據確定檢出限。準確量取適量混合標準儲備工作液，用乙腈水溶液（乙腈∶水=10 ∶90，體積比）稀釋成一系列濃度梯度的標準品工作液，在1.3 節(jié)條件下依次測定。結果顯示各種化合物在質量濃度范圍內線性良好，相關系數（r）均大于 0.995，檢出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantity，LOQ）見表2。

表2 各化合物的回歸方程、線性范圍、相關系數及檢出限Table 2 Regression equation，liner range，correlation coefficient and detection limit of each compound

2.5 方法的回收率、精密度

用空白餅干、面包、月餅樣品進行添加回收率和精密度試驗。稱取2 g（精確至0.01 g），選取低、中、高3 個合適濃度分別添加標準溶液，每個加標水平平行測定3 次，計算平均加標回收率和相對標準偏差，結果見表3。

表3 方法的回收率和相對標準偏差Table 3 The recovery rate and RSD of the method

從表3 可以看出，各組分的回收率均在64.5%～119.5%之間，相對標準偏差在3.5%～9.8%之間（n=6），可見本試驗方法的準確度與精密度良好。

2.6 樣品測定

利用本研究建立的分析方法檢測18 批實際樣品（其中包括6 批月餅樣品、4 批餅干樣品、2 批面包和6批糕點），其中在1 批餅干樣品中檢出安賽蜜、甜蜜素、糖精鈉、檸檬黃和亮藍，檢出量分別為0.02、0.02、0.02、0.76 mg/kg 和 1.05 mg/kg。GB 2760-2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》中規(guī)定了允許焙烤食品使用安賽蜜、甜蜜素的最大使用量（烤食品中安賽蜜最大使用量0.3 g/kg、面包、糕點中甜蜜素的最大使用量1.6 g/kg、餅干中甜蜜素的最大使用量0.65 g/kg），而糖精鈉、檸檬黃、和亮藍屬于在焙烤食品中不得使用的添加劑（人工合成色素除焙烤食品餡料及表面用掛漿和糕點上的彩裝外）?？梢娛袌錾洗_實存在焙烤食品違法使用添加劑的現象，建議有關部門加強監(jiān)管，以保障人民身體健康。

3 結論

本文建立了同時測定焙烤食品中10 種合成色素和甜味劑的超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜的方法。該方法具有簡便快捷、測定速度較快，線性相關性好，準確度較高等優(yōu)點，適用于實際焙烤食品樣品中10 種合成色素和甜味劑的檢測，具有較高的實用價值和應用前景。