許會(huì)靜，李玉杰，張馨月，王弘瑞，苗茁，柳玉，李艷，王會(huì)巖，董媛，*

（1.吉林醫(yī)藥學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院，黑龍江吉林132013；2.吉林醫(yī)藥學(xué)院抗體中心，黑龍江吉林132013）

T-2 毒素屬于A 型單端孢霉烯族化合物，主要由三線鐮刀菌、枝孢鐮刀菌、擬枝孢鐮刀菌、梨孢鐮刀菌、硫色鐮刀菌等真菌代謝產(chǎn)生[1]。在寒冷或潮濕的儲(chǔ)存條件下，燕麥、玉米、大麥、小麥和動(dòng)物飼料等易被污染。T-2 毒素可以抑制蛋白質(zhì)[2]和核酸[3]的合成，人類誤食污染的谷物后，表現(xiàn)出一系列急性和慢性的中毒癥狀，如嘔吐、腹瀉、昏睡、體重減輕、出血、免疫抑制，甚至死亡[4-5]。目前研究表明，人類食物中毒性白細(xì)胞缺乏癥和大骨節(jié)病[6]也與該毒素相關(guān)。T-2 毒素性質(zhì)穩(wěn)定，可在動(dòng)物體內(nèi)代謝和消除，產(chǎn)生比其本身毒性更強(qiáng)的代謝產(chǎn)物[7]。目前仍沒有有效的解毒方法進(jìn)行治療。因此，為避免T-2 毒素的污染，減少其對人類和畜牧業(yè)的危害，建立快速、靈敏、準(zhǔn)確地檢測T-2 毒素的方法已成為近年來研究的熱點(diǎn)。

目前，氣相色譜法（gas chromatography，GC）[8]、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（gas chromatography mass spectrometry，GC-MS）[9]，高效液相色譜法（high-performance liquid chromatography，HPLC）[10]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography mass spectrometry，LC-MS）[11]、酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）[12-13]等技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用到T-2 毒素的檢測中。但是，這些傳統(tǒng)的檢測方法操作繁瑣，需要昂貴的儀器，專業(yè)的技術(shù)人員等，不但成本高，而且分析速度慢，難以達(dá)到快速、簡便和現(xiàn)場檢測要求。膠體金免疫層析技術(shù)（colloidal gold immunochromatography，GICA）具有高靈敏度、低成本、操作簡便、結(jié)果判斷直觀等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于T-2 毒素的快速檢測、臨場檢測等領(lǐng)域，但目前該試紙條只能做定性檢測[14-15]。本試驗(yàn)制備出T-2 毒素單克隆抗體，根據(jù)膠體金免疫層析試驗(yàn)原理，結(jié)合定量讀卡儀，建立一種快速定量檢測T-2 毒素的膠體金試紙條，并在玉米檢測中進(jìn)行應(yīng)用，為真菌毒素的快速檢測奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Balb/c 小鼠（6 周～8 周雌性）：吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；T-2 毒素、HT-2 毒素、新石房蛤毒素（neosaxitoxin，NEO）、蛇形霉素（diacetoxyscirpenol，DAS）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇毒素（deoxynivalenol，DON）、雪腐鐮刀菌烯醇毒素（nivalenol，NIV）標(biāo)準(zhǔn)溶液：普瑞邦生物工程有限公司；卵清蛋白（ovalbumin，OVA）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）：合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；30 nm 膠體金、NC 膜、玻璃纖維膜、PVC底板：上海杰一生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

點(diǎn)膜儀（XYZ3000）：Bio-Dot 公司；數(shù)控切條機(jī)（CT-300）：上海金標(biāo)生物科技有限公司；分析型高效液相色譜儀（2695 分析型）：美國waters 公司；酶標(biāo)分析儀（SM-3 型）：北京天石天力醫(yī)療器械技術(shù)開發(fā)中心；紫外-可見分光光度計(jì)（Nanodrop2000）：美國 Thermo 公司；膠體金定量讀數(shù)儀（TND09MJ）：深圳拓能達(dá)科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 T-2 毒素單克隆抗體的制備

參考Chu 等[16-17]的方法合成T-2-HG-BSA 和 T-2-HS-OVA 抗原，以 T-2-HG-BSA 為抗原對 6 周～8 周的雌性Balb/c 小鼠進(jìn)行免疫，4 次免疫后取小鼠免疫血清ELISA 測定效價(jià)，選擇血清效價(jià)高的小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞（SP2/0）進(jìn)行融合，獲得T-2 毒素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，將其接種到Balb/c 小鼠腹腔內(nèi)采集腹水，得到T-2 毒素單克隆抗體，并采用間接ELISA法對抗體的效價(jià)進(jìn)行測定。

1.3.2 T-2 毒素單克隆抗體的純化鑒定

將小鼠腹水與20 mmol/L 磷酸鈉溶液混合，平衡8 h 后過protein G 純化柱純化，最后用甘氨酸鹽酸洗脫液沖洗柱子，收集洗脫液并在PBS（0.01 mmol/L，pH 7.2）中透析24 h，得到純化后的T-2 毒素單克隆抗體。將純化后的抗體進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）電泳鑒定。

1.3.3 膠體金標(biāo)記抗體最適pH 值的確定

取酶標(biāo)板，加入100 μL 膠體金后，用0.1 mol/L HCl和 K2CO3溶液，調(diào)節(jié) pH 值分別為 6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0 和 9.5，混勻后加入 4 μL T-2 毒素抗體（1 mg/mL，混勻后加入 10 % NaCl 20 μL，30 min 后觀察標(biāo)記結(jié)果，測定 OD520值。

1.3.4 金標(biāo)抗體的制備

取膠體金溶液1 mL，用0.1 mol/L K2CO3溶液調(diào)節(jié)膠體金溶液（30 nm）至最佳pH 值，在溫和攪拌條件下，向其中逐滴加入20 μL T-2 毒素單克隆抗體（1.0 mg/mL），充分混勻 30 min 后，加入 40 μL 濃度為10%BSA 封閉15 min，加入終濃度為0.1%PEG20000混勻15 min。將上述標(biāo)記后的膠體金溶液1 500 r/min低速離心20 min；取上清再12 000 r/min 高速離心20 min；重懸沉淀于儲(chǔ)存液中，4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｗ贤鈼l件下全波長掃描標(biāo)記抗體的膠體金溶液和未標(biāo)記的膠體金溶液，觀察掃描圖譜波形變化，判斷標(biāo)記是否成功。

1.3.5 抗體最佳標(biāo)記濃度和抗原最佳包被濃度

在確定最佳pH 值條件下，單抗分別按照5、10、20、30 μg/mL 標(biāo)記，均勻噴涂在玻璃纖維膜上制成膠體金結(jié)合墊，T-2-HS-OVA 抗原按照 0.125、0.25、0.5、0.75 mg/mL 分別包被在 NC 膜上的檢測線（T 線），羊抗鼠二抗按 1.0 mg/mL 包被到 NC 膜的質(zhì)控線（C 線），將膠體金結(jié)合墊、樣品墊和吸水墊按順序組裝在底板上，進(jìn)行正交試驗(yàn)，檢測T-2 毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液（0、2、5、10、20、50 μg/kg）濃度，選擇 0 μg/kg 顯色明顯且靈敏度高的組合為最佳條件。在此條件下，羊抗鼠二抗按0.5、0.75、1.0、1.5 mg/mL 包被到 NC 膜的 C 線，選擇檢測10 μg/kg 標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)C 線顯色強(qiáng)度與T 線相當(dāng)?shù)陌粷舛葹闉樽罴褩l件。

1.3.6 快速檢測卡的組裝與檢測

用PBS 配置5%蔗糖、0.05%tween-20 溶液的處理液，玻璃纖維塑膜浸入處理液，10 min 后25 ℃室溫晾干。將最佳標(biāo)記量的金標(biāo)抗體均勻噴涂在玻璃纖維膜上制成膠體金結(jié)合墊，37 ℃干燥1 h。將T-2-HSOVA 抗原和二抗，分別用包被于NC 膜上的T 線和C線，37 ℃干燥2 h。將膠體金結(jié)合墊、樣品墊和吸水墊按順序組裝在底板上，并切割裝入塑料卡殼中，制成檢測卡。在檢測卡的加樣孔中滴加50 μL 待檢樣品溶液，2 min 后，放入膠體金定量讀數(shù)儀中，讀取濃度值。

1.3.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

配制不同濃度（0、5、10、20、50、100 μg/kg）的 T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取50 μL 加到檢測卡的加樣孔中，25 ℃室溫反應(yīng)2 min，放入膠體金定量讀數(shù)儀中，讀取T 線光密度/C 線光密度比值（T/C），T-2 標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0 μg/kg 時(shí) T/C 記為 B0，不同濃度 T-2 標(biāo)準(zhǔn)溶液 T/C 記為B，以T-2 毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)、B/B0值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.8 樣品前處理方法的確定

稱取粉碎的玉米樣品5 g，加入25 mL70%甲醇水溶液，漩渦震蕩提取3 min，提取液用雙層濾紙過濾，取1 mL 濾液加入到 4 mLPBS（0.01 mol/L）溶液中進(jìn)行5倍稀釋，樣品稀釋液用有機(jī)相濾膜（0.45 μm）過濾，取出該濾液50 μL 滴入檢測孔進(jìn)行檢測，2 min 后放入膠體金定量讀數(shù)儀中，讀取濃度值。

1.3.9 回收試驗(yàn)

取玉米樣品，檢測其中T-2 毒素含量，向其中添加不同濃度的（5、10、20、50、100 μg/kg）T-2 毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，再次進(jìn)行檢測，計(jì)算回收率。

1.3.10 特異性檢測

用 PBS 稀釋 T-2 毒素、HT-2 毒素、NEO、DAS、DON、NIV 標(biāo)準(zhǔn)溶液至終濃度為 200、400、800、1 600、3 200 μg/L，用T-2 毒素快速檢測試紙條進(jìn)行檢測，每個(gè)濃度設(shè)6 個(gè)重復(fù)，檢測試紙條的特異性。

1.3.11 重復(fù)性檢測

隨機(jī)抽取3 個(gè)不同批次及同一批次的試紙條，檢測不同質(zhì)量濃度的（5、10、20、50、100 μg/kg）T-2 毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)樣本濃度重復(fù)測定5 次，檢查試紙條的重復(fù)性。

1.3.12 樣品檢測

取10 份玉米樣品，向其中隨機(jī)添加不同濃度的T-2 毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，制備T-2 毒素含量在5 μg/kg～100 μg/kg 之間的玉米樣品，分別用試紙條和高效液相色譜法[18]進(jìn)行檢測，每個(gè)樣品重復(fù)3 次，并將檢測結(jié)果進(jìn)行對比。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Excel 2007 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和標(biāo)準(zhǔn)曲線制作，數(shù)據(jù)以平均值表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 T-2單克隆抗體效價(jià)的測定

采用間接ELISA 方法測定T-2 單克隆抗體效價(jià)，單克隆抗體的效價(jià)為1 ∶256 000。

2.2 T-2毒素單克隆抗體的純化鑒定

T-2 毒素單克隆抗體經(jīng)protein G 純化后通過SDS-PAGE 電泳進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示（如圖1），50 kDa和25 kDa 位置有清晰條帶，且未見雜蛋白，表明純化得到純度較高的T-2 毒素單克隆抗體。

2.3 膠體金標(biāo)記抗體最適pH的確定

物理吸附是膠體金與蛋白質(zhì)結(jié)合的主要機(jī)制。膠體金顆粒表面的負(fù)電荷與蛋白表面正電荷通過靜電作用相互吸附，因此標(biāo)記溶液的pH 值對蛋白標(biāo)記成功與否有重要作用。如圖2 所示。

圖1 T-2 抗體純化后的SDS-PAGE 電泳鑒定結(jié)果Fig.1 Identification of T-2 antibody purification by SDS-PAGE

圖2 T-2 毒素金標(biāo)抗體最佳pH 的確定Fig.2 Optimal pH of T-2 toxin colloidal antibody

由圖2 可知，當(dāng)pH 值為8.5 時(shí)，膠體金標(biāo)記抗體蛋白結(jié)合物在520 nm 處的吸光值較高，且曲線趨于平坦，標(biāo)記抗體未發(fā)生死金現(xiàn)象，表明膠體金記抗體的最佳pH 值為8.5。

2.4 金標(biāo)抗體的質(zhì)量鑒定

紫外條件下全波長掃描標(biāo)記抗體的膠體金溶液和未標(biāo)記的膠體金溶液，結(jié)果見圖3。

圖3 膠體金掃描圖譜Fig.3 Colloidal gold scanned pattern

由圖3 可見，標(biāo)記T-2 毒素單克隆抗體的膠體金溶液最大吸收峰出現(xiàn)了明顯的位移，因此可判斷抗體被膠體金成功標(biāo)記。

2.5 抗體最佳標(biāo)記濃度和抗原最佳包被濃度

通過正交試驗(yàn)，單抗的最佳標(biāo)記濃度為20 μg/mL標(biāo)記，抗原的包被濃度為0.5 mg/mL，羊抗鼠IgG 的包被濃度為1.0 mg/mL，為最佳組合條件，此時(shí)試紙條的最低檢測限為5 μg/kg。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

通過檢測不同濃度的T-2 毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，膠體金讀數(shù)儀讀取T 線光密度/C 線光密度比值（T/C），以T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)、B/B0值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。T-2 毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度在10 μg/kg～100 μg/kg 時(shí)，線性范圍較好。其線性方程和回歸系數(shù)見圖4。

圖4 膠體金試紙條法檢測T-2 毒素的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve for detection of T-2 toxin by colloidal gold strip method

2.7 回收試驗(yàn)

取玉米樣品，檢測其中T-2 毒素含量，向其中添加不同濃度的T-2 毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，再次進(jìn)行檢測，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1 玉米添加T-2 毒素的回收率和變異系數(shù)Table 1 Recoveries and coefficients of variation of T-2 in corn

結(jié)果顯示，該試紙條檢測玉米樣本的回收率在77 %～117.6%之間，變異系數(shù)小于10%，表明該檢測方法精密度和重現(xiàn)性良好。

2.8 特異性檢測

用 PBS 稀釋 T-2 毒素、HT-2 毒素、NEO、DAS、DON、NIV 標(biāo)準(zhǔn)溶液至不同濃度，用T-2 毒素快速檢測試紙條進(jìn)行檢測，評價(jià)試紙條的特異性，結(jié)果見表2。

表2 T-2 毒素快速檢測試紙條的特異性Table 2 Specificity of T-2 toxin rapid test trip

由表2 可知，T-2 毒素快速檢測試紙條與其他真菌毒素?zé)o交叉反應(yīng)。說明該試紙條有高度的特異性。

2.9 重復(fù)性檢測

隨機(jī)抽取3 個(gè)不同批次及同一批次的試紙條，檢測不同質(zhì)量濃度的T-2 毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，檢查試紙條的重復(fù)性。檢測結(jié)果見表3、表4，結(jié)果表明，T-2 毒素快速定量檢測試紙條的批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于10%，表明該檢測方重復(fù)性良好。

2.10 方法比對

隨機(jī)取 10 份 T-2 毒素含量在 5 μg/kg～100 μg/kg之間的玉米樣品，分別用試紙條和高效液相色譜法進(jìn)行檢測，并將檢測結(jié)果進(jìn)行對比。結(jié)果見圖5，GICA 與HPLC 檢測結(jié)果一致。

表3 T-2 毒素快速檢測試紙條的批內(nèi)重復(fù)性Table 3 Intra repetitiveness of T-2 toxin rapid test trip

表4 T-2 毒素快速檢測試紙條的批間重復(fù)性Table 4 Inter repetitiveness of T-2 toxin rapid test trip

圖5 GICA 與HPLC 檢測樣品中T-2 毒素結(jié)果的比較Fig.5 Correlation of quantitative data of T-2 obtained by GICA and HPLC

3 討論

玉米是我國重要的糧食作物之一，玉米加工食品也是人們?nèi)粘Ｉ畋夭豢缮俚?，比如玉米面、玉米油、速食玉米等。此外，玉米在工業(yè)方面也有重要作用，比如酒精、飼料、制藥等的加工原料。但隨現(xiàn)代化和工業(yè)化進(jìn)程的發(fā)展，T-2 毒素的污染對其造成嚴(yán)重的質(zhì)量安全問題[18-20]。世界各國對T-2 毒素都有嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)[21]，檢測玉米中T-2 毒素的含量對避免T-2 毒素的污染，減少其對人類和畜牧業(yè)的危害有重要意義。由于GICA 具有操作簡便，快速，靈敏度的特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于多種真菌毒素的檢測中[22-23]。目前，朱亮亮等[14-15]建立的飼料和谷物中T-2 毒素檢測試紙條只能定性不能定量。本試驗(yàn)建立的T-2 毒素膠體金定量檢測試紙條可以通過定量讀數(shù)儀獲得T-2 毒素的具體含量，避免了人為因素主觀判斷造成的差異。研究表明[13]，半抗原和載體蛋白之間間隔較長碳鏈的免疫原性優(yōu)于間隔較短碳鏈的免疫原性，包被抗原的異質(zhì)性可提高免疫反應(yīng)的特異性。因此本實(shí)驗(yàn)室選用比T-2HS-BSA 碳鏈較長的T-2HG-BSA 為免疫原自主制備出了高特異性的抗T-2 毒素單克隆抗體，并進(jìn)行了膠體金標(biāo)記，提高了檢測結(jié)果的特異性。選用與T-2HS-BSA 具有較高異質(zhì)性的T-2HS-OVA 為包被抗原噴涂在硝酸纖維膜上，提高了檢測結(jié)果的靈敏度。并通過實(shí)驗(yàn)室試紙條檢測參數(shù)的優(yōu)化，把T-2 毒素免疫膠體金快速試紙條檢測限提高到5 μg/kg，明顯高于膠體金標(biāo)記T-2 毒素多克隆抗體的靈敏度[15]，玉米添加回收率在77%～117.6%之間，批內(nèi)和批間重復(fù)性檢測變異系數(shù)小于10%，玉米中T-2 毒素的檢測結(jié)果與高效液相法檢測結(jié)果一致。表明本試驗(yàn)研制的快速定量檢測T-2 毒素的方法，可以有效地對食品中T-2 毒素進(jìn)行檢測和監(jiān)控，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)價(jià)值。