王琳琳 馮佳莉 劉俊芬 郝秀輕 左路廣 劉圣君 劉華

河北北方學院附屬第一醫(yī)院1腎內科，2病理科，3檢驗科（河北張家口075000）

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是2型糖尿病（type 2 diabetes，T2DM）常見的并發(fā)癥之一，發(fā)病較為隱匿，加之目前診斷手段存在一定局限性，較難早期診斷DN并進行有效治療［1-3］。有研究［4-5］報道，約有30%～35%的T2DM患者并發(fā)DN，最終發(fā)展為終末期腎?。╡nd stage renal disease，ESRD）。ESRD患者需長期接受維持行腎臟替代治療，5年生存率極低，約為20%［6］。目前，腎臟活檢是確診DN的金標準，但由于其具有創(chuàng)傷性及不便利性，多數(shù)患者較難接受，因此，較難用于臨床篩查及推廣。尿白蛋白/肌酐比值（urinary albuminuria/creatinine ratio，ACR）對于DN診斷有一定價值，但易受其他因素影響，如控制血糖及腎臟相關指標可抑制ACR升高。因此，探尋用于DN診斷的敏感度和特異度均較高的生物標志物勢在必行。微RNA（microRNA，miR）是一類非編碼蛋白質的小分子RNA，廣泛參與機體的生理、病理過程的調控［7］。近年來，有研究［8］證實miR-181b可以靶向調控TIMP3參與DN的病理生理過程。但關于miR-181b在DN患者中的表達及其與DN發(fā)病及預后的關系還未闡明。因此，筆者選擇T2DM和DN患者作為研究對象，探究miR-181b在其發(fā)病及預后中的作用，以期為DN的診斷及治療提供幫助?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料前瞻性選取2016年5月至2017年4月在本院就診的87例T2DM并發(fā)DN患者（DN組）作為研究對象。另擇同期84例單純T2DM患者（T2DM組）和90例健康體檢者（對照組）作為對照。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）制定的T2DM診斷標準及美國糖尿病協(xié)會制定的DN診斷標準對T2DM并發(fā)DN患者進行診斷。納入標準：（1）腎臟病理活檢或相關臨床指征符合DN特點；（2）簽署了知情同意書。排除標準：（1）合并心腦血管疾??；（2）并發(fā)酮癥酸中毒；（3）合并甲狀腺疾病或其他代謝性疾??；（4）急、慢性腎小球腎炎、尿路感染或其他腎臟相關疾病；（5）使用過免疫抑制劑或其他腎臟毒性藥物；（6）妊娠或哺乳期婦女。DN組男49例，女48例，平均年齡（46.56±8.72）歲；T2DM組男45例，女39例，平均年齡（47.38±9.37）歲；對照組男48例，女42例，平均年齡（46.45±8.72）歲。3組受試者基線資料見表1。本研究經本院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1資料收集收集受試者年齡、性別、身高、體質量、收縮壓、舒張壓、病程、空腹血糖（FPG）、糖化血紅蛋白（HAblc）、肌酐（SCr）及尿微量白蛋白水平等。并計算體質量指數(shù)（BMI）、估算的腎小球濾過率（eGFR）和尿微量白蛋白與肌酐比值（ACR）。BMI=體質量（kg）/身高2（m2）；eGFR=a×（Scr／b）c×（0.993）年齡［男性：a=141，b=0.9，c=-0.411（Scr≤ 0.7 mg/dL）或-1.209（Scr＞0.7 mg/dL）；女性：a=144，b=0.7，c=-0.329（Scr≤ 0.7 mg/dL）或-1.209（Scr＞0.7 mg/dL）］；ACR=尿白蛋白（mg/L）/Cr（g/L）。

1.2.2血清miR-181b水平檢測采用RT-qPCR法檢測受試者血清miR-181b水平。抽取受試者肘部靜脈血10 mL，3 500 r/min離心15 min后，提取上層清液于EP管中。將上清液加至TRIzol?LS試劑盒［賽默飛世爾科技（中國）有限公司］中提取總RNA，并用紫外分光光度計（上海美譜達公司）檢測總RNA濃度及純度。取2 μg總RNA加至反轉錄試劑盒［賽默飛世爾科技（中國）有限公司］中，進行反轉錄反應。取反轉錄產物進行PCR擴增，擴增條件為95 ℃ 30 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，循環(huán)40 次。miR-181b序列 F：GCGGATCATTCATTGCTGTCG，R：GTGCAGGGTCCGAGGT；U6序列F：CTCGCTTCGGCAGCACATA，R：GTGCAGGGTCCGAGGT。U6為內參，采用 2-ΔΔCt表示受試者血清 miR-181b 水平。

1.2.3預后隨訪對87例T2DM并發(fā)DN患者進行為期2年的隨訪，主要通過復診及電話隨訪等方式，每月隨訪1次，了解患者是否進展為ESRD，隨訪至2019年4月。ESRD定義為接受維持行血液透析治療或eGFR＜15 mL/（min·1.73 m2）［9］。

1.3統(tǒng)計學方法采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計分析。服從正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標準差表示，3組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK法；不服從正態(tài)分布的計量資料用中位數(shù)和四分位數(shù)間距［M（Q1，Q3）］表示，3組間比較采用Kruskal Wallis檢驗，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。采用Pearson和Spearman相關分析血清miR-181b水平與臨床及病理指標的關系，并用多元線性回歸分析于miR-181b獨立相關的因素。用受試者工作特征（ROC）曲線評價血清miR-181b診斷T2DM進展為DN的效能。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.13組受試者基線資料比較3組受試者在年齡、性別、BMI及舒張壓水平方面比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；在病程、收縮壓、FPG、HAblc、eGFR及ACR水平方面比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.23組受試者血清miR-181b水平比較3組受試者血清miR-181b水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=324.775，P＜0.001）。DN組血清miR-181b水平為（2.56±0.62），高于T2DM組（1.55±0.41）和對照組（0.88±0.19），差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。T2DM組血清miR-181b水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.3血清miR-181b水平與臨床及病理指標的關系3組受試者血清miR-181b水平與收縮壓和ACR 均呈正相關關系（r=0.238，P=0.001；rs=0.577，P＜0.001）。將血清miR-181b水平作為因變量，將收縮壓和ACR作為自變量納入多元線性回歸分析，結果顯示收縮壓和ACR均與miR-181b獨立相關。見表2。

2.4血清miR-181b診斷T2DM進展為DN的效能ACR診斷T2DM進展為DN的ROC曲線下面積（AUC）為 0.995（95%CI：0.970～1.000），最大約登指數(shù)為0.943，其所對應的Cut-off值、敏感度和特異度分別為36.01、94.25%和100.00%。血清miR-181b診斷T2DM進展為DN的AUC為0.911（95%CI：0.858～0.949），最大約登指數(shù)為0.689，其所對應的Cut-off值、敏感度和特異度分別為2.30、71.26%和97.62%。血清miR-181b診斷T2DM進展為DN的AUC低于ACR診斷T2DM進展為DN的AUC，差異有統(tǒng)計學意義（Z=3.932，P＜0.001）。見圖1。

表1 3組基線資料比較Tab.1 Comparison of three sets of baseline data 例，± s

表1 3組基線資料比較Tab.1 Comparison of three sets of baseline data 例，± s

注：與對照組比較，*P＜0.05；與T2DM組比較，#P＜0.05

分組DN組T2DM組對照組F/χ2/Z值P值例數(shù)87 84 90年齡（歲）46.56±8.72 47.38±9.37 46.45±8.72 0.283 0.758性別（男/女）49/38 45/39 48/42 0.194 0.908病程（年）9.92（5.58，12.17）#7.50（3.50，9.83）—3.603 0.042 BMI（kg/m2）25.68±5.13 25.37±4.80 24.28±4.46 2.081 0.127收縮壓（mmHg）142.64±9.78*#127.70±8.74*110.24±5.37 350.673＜0.001分組DN組T2DM組對照組F/χ2/Z值P值例數(shù)87 84 90舒張壓［M（Q1，Q3）］84（81，86）84（79，87）77（73，84）0.878 0.285 FPG（mmol/L）7.34±2.60*#9.11±2.51*5.05±0.52 82.604＜0.001 HAblc（%）7.3±1.8*#8.9±2.4*5.0±0.5 111.113＜0.001 eGFR［mL/（min·1.73m2）］71.2±15.3*#108.6±11.2*116.9±10.4 333.392＜0.001 ACR［M（Q1，Q3），×10-3］148.26（75.03，850.28）*#14.25（9.07，19.25）14.09（9.05，18.16）170.502＜0.001

表2 miR-181b的多元線性回歸分析結果Tab.2 Results of multiple Linear regression Analysis of miR-181b

圖1 血清miR-181b診斷T2DM進展為DN的效能Fig.1 The diagnostic efficacy of serum microRNA-181b in the progression of T2DM to DN

2.5血清miR-181b水平與DN預后的關系取DN組患者血清miR-181b水平的中位數(shù)（2.55）為界，將其分為miR-181b高水平組（n=43）和miR-181b低水平組（n=44）。DN組患者共有36例（41.38%）進展為ESRD。其中，miR-181b高水平組患者共有28例（65.12%）進展為ESRD，miR-181b低水平組患者共有8例（18.18%）進展為ESRD，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=19.749，P＜0.001）。

3 討論

近年來，全球T2DM發(fā)病率逐年攀升，嚴重影響人們的生命健康［10］。DN作為T2DM常見的并發(fā)癥之一，伴隨T2DM發(fā)病率的升高，其發(fā)病率也逐年升高［11］。DN發(fā)病較為隱匿，且發(fā)病機制較為復雜，很難在疾病早期診斷，因此，多數(shù)患者在發(fā)現(xiàn)時已進展為DN臨床期，最終進展為ESRD［12］。目前，對于DN的治療主要手段為控制糖、脂代謝，糾正血壓等，并不能從根本上抑制DN的疾病進展［13］。因此，探尋早期診斷DN及預后評估的生物標志物意義重大。miR-181b是miR-181家族中的一員。有研究［14-16］顯示，miR-181b在慢性淋巴細胞白血病、胃癌及肺癌中特異性表達，并參與上述腫瘤的發(fā)病及疾病進展過程。但關于miR-181b在DN中的表達及其與預后的關系還未可知。

本研究比較了對照組、T2DM組及DN組患者血清miR-181b水平，發(fā)現(xiàn)DN組血清miR-181b水平高于T2DM組和對照組，T2DM組血清miR-181b水平高于對照組，提示miR-181b可能參與了T2DM的發(fā)生、發(fā)展過程，并促使T2DM進展為DN。相關性分析結果顯示血清miR-181b水平與收縮壓和ACR均呈正相關關系，結合上述研究結果，提示血清miR-181b可能成為DN診斷的生物標志物，并有助于DN治療療效及預后的判斷。為證實上述猜想，筆者構建了血清miR-181b診斷T2DM進展為DN的ROC曲線，結果顯示其ROC AUC為0.911，雖診斷效能低于ACR診斷T2DM進展為DN的ROC AUC，但診斷效能仍較高，可輔助T2DM進展為DN的診斷。本研究對87例DN患者進行了2年的跟蹤隨訪，了解到36例DN患者進展為ESRD，該結果與韓輝等［9］隨訪結果接近。筆者進一步比較了miR-181b高水平組和低水平組患者進展為ESRD的發(fā)病率，結果顯示miR-181b高水平組患者進展為ESRD的發(fā)病率高于miR-181b低水平組，提示miR-181b與DN患者預后有關，有望成為判斷DN進展的生物標志物。

本研究結果顯示血清miR-181b水平與收縮壓和ACR獨立相關。因此，筆者推測miR-181b可能間接或直接靶向調控收縮壓和ACR，進一步加重DN病情進展，但有關其病理、生理機制仍有待開展實驗證實。本研究簡要探究了DN的發(fā)病機制，為其發(fā)病機制研究提供了方向，同時也為其治療提供了靶點，但仍有一定不足，下一步將擴大樣本量，進行多中心研究，同時動態(tài)觀察血清miR-181b水平變化，進一步補充本研究結論。同時，開展基礎研究，進一步探究miR-181b參與T2DM進展為DN及DN進展的分子機制，以彌補本研究的不足。

綜上所述，T2DM和DN患者血清miR-181b水平升高。miR-181b與收縮壓和ACR獨立相關。檢測血清miR-181b水平有助于DN診斷及預后評估。與DN診斷的金標準腎臟病理活檢相比，檢測血清miR-181b水平更為便捷，且無創(chuàng)，患者更能接受。