王瑜 黃峰 郭琳瑯

南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院病理科（廣州510280）

肺癌是世界最常見的癌癥和導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的最主要原因［1］。據(jù)我國腫瘤登記中心2016年發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，肺癌在我國男性腫瘤發(fā)病患者中占據(jù)榜首［2］。肺癌按照病理類型分類，主要包括非小細胞肺癌和小細胞肺癌，小細胞肺癌占新發(fā)肺癌的10%～15%［3］。目前對小細胞肺癌的臨床治療以化療為主，盡管患者對化療藥物反應(yīng)較敏感，但由于極易出現(xiàn)多藥耐藥，化療效果常不理想，臨床預(yù)后較差。因此，闡明小細胞肺癌化療耐藥的分子機制，提高小細胞肺癌的生存率，是當(dāng)今肺癌臨床治療的重要研究課題之一。N-myc下游調(diào)控基因（N-myc downstream regulated gene，NDRG）家族由4個成員組成，在細胞增殖和分化等過程中發(fā)揮作用。雖然對NDRG1和NDRG2進行了廣泛的研究，但關(guān)于NDRG3和NDRG4的認(rèn)識卻很少［4］。NDRG4作為一種新的候選腫瘤抑制因子，與腫瘤的分化、侵襲、轉(zhuǎn)移和分期有顯著相關(guān)［5］。目前尚未見NDRG4與小細胞肺癌化療耐藥的相關(guān)報道。本研究采用免疫組化SP法檢測NDRG4在小細胞肺癌組織及其正常肺組織中的表達情況，探討NDRG4與小細胞癌化療耐藥及臨床預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1樣本收集小細胞肺癌組織收集于2013年1月至2017年10月期間南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院、中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院的手術(shù)及穿刺活檢標(biāo)本共48例，所有病例的病理診斷均經(jīng)兩位以上病理專家確診；另取48例正常肺組織作為對照。

1.2小細胞肺癌患者臨床病理特征男45例，女3例；60歲以下歲患者20例，60歲以上患者28例，中位發(fā)病年齡60歲；局限期（LD）患者28例，廣泛期（ED）患者20例；截止本研究結(jié)束仍存活患者12例，死亡患者36例。

1.3試劑濃縮型兔抗人NDRG4多克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），通用型試劑盒（SP-9000），濃縮型DAB試劑盒、多聚賴氨酸、檸檬酸組織抗原修復(fù)液粉劑、PBS粉劑（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.4免疫組化步驟將石蠟切片置入100%二甲苯脫蠟2次，每次10 min。依次經(jīng)100%、95%、85%、75%乙醇和純水各1次，每次5 min；PBS洗3次，每次5 min；脫蠟后玻片放入盛有0.1 mol/L檸檬酸緩沖液（pH=6.0）微波進行抗原修復(fù)15 min；冷卻至室溫。PBS洗3次，每次5 min；然后玻片用7%BSA（BPS∶BSA=100∶7）37 ℃下封閉30 min；滴加一抗（1∶200）4℃過夜孵育；室溫平衡30 min，PBS洗3次，每次5 min；玻片滴加生物素標(biāo)記的羊抗鼠二抗（1∶2 000），37℃濕盒30 min；用PBS洗3次，每次5 min；滴加DAB顯色5～10 min；PBS清洗DAB溶液，1次，每次5 min；蘇木素復(fù)染1 min，1%酒精鹽酸分化，自來水返藍；75%、85%、95%、100%梯度酒精脫水，二甲苯透明，每次3 min。待玻片干燥后，用中性樹脂封片；結(jié)果判定：NDRG4陽性染色為細胞漿呈棕黃色。

1.5免疫組化陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)NDRG4陽性表達主要定位在細胞漿。按照半定量積分方法，隨機觀察10個高倍視野（×200倍），判斷結(jié)果：綜合切片中陽性細胞占所觀察同類細胞數(shù)的百分比和著色強度評分，NDRG4陽性百分比評分：0%（0分），1% ～10%（1分），＞10%（2分）；染色強度評分：不著色（0分），弱著色（1分），中等強度以上著色（2分）。陽性細胞百分比與著色強度評分相加，總分0～2分為NDRG4表達缺失或低表達判為NDRG4表達陰性，3～4分判為NDRG4表達陽性。由2位病理醫(yī)師雙盲法讀片并計數(shù)。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法所有結(jié)果均經(jīng)SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行分析，NDRG4表達與臨床病理特征分析采用列聯(lián)表資料分析；多因素對小細胞肺癌患者生存時間的影響采用逐步Cox回歸模型分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1NDRG4在小細胞肺癌組織中的表達及正常肺組織中的表達情況NDRG4陽性表達位于細胞漿（圖1）。NDRG4蛋白在48例小細胞肺癌組中，10例表達陽性，38例表達陰性，NDRG4在小細胞肺癌組織中陽性表達率為20.83%（10/48）；NDRG4蛋白在48例正常肺組織中，45例表達陽性，3例表達陰性，NDRG4在正常肺組織中陽性表達率為93.75%（45/48）。NDRG4在小細胞肺癌組織中表達顯著低于正常肺組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=52.151，P＜0.001）。

圖1 NDRG4的免疫組化染色Fig.1 Immunohistochemical staining of NDRG4

表1 NDRG4表達與小細胞肺癌臨床病理特征的關(guān)系Tab.1 Relationship between NDRG4 expression and clinical pathological features of SCLC 例

2.2NDRG4在小細胞肺癌組織中的表達情況其與臨床病理特征的關(guān)系NDRG4的表達與患者的性別無相關(guān)性（χ2=0.303，P=0.582）；NDRG4的表達與患者的年齡無相關(guān)性（χ2=0.317，P=0.573）；NDRG4的表達與患者的臨床分期無相關(guān)性（χ2=0.707，P=0.400）。見表1。NDRG4的表達與患者的Ki-67增殖指數(shù)有相關(guān)性（χ2=4.076，P=0.044），NDRG4陽性患者Ki-67增殖指數(shù)低于NDRG4陰性患者，提示NDRG4陽性的腫瘤增殖指數(shù)更低。

2.3NDRG4在小細胞肺癌組織中的表達情況與化療耐藥以及生存期的關(guān)系48例小細胞肺癌患者中對化療敏感的23例，出現(xiàn)耐藥的25例，化療敏感的患者中NDRG4陽性表達率為34.78%（8/23），化療多藥耐藥的患者中NDRG4陽性表達率為8.00%（2/25），化療敏感的NDRG4陽性表達率患者顯著高于化療多藥耐藥的患者（χ2=5.210，P=0.033）。NDRG4的表達與患者的生存期有顯著的相關(guān)性，生存的12例患者中，NDRG4陽性者7例；死亡的36例患者中，NDRG4陽性者3例，NDRG4陽性的患者生存顯著高于NDRG4陰性的患者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=13.642，P=0.001）。

2.4小細胞肺癌患者生存分析采用逐步COX回歸模型分析NDRG4陽性表達與患者的生存時間的關(guān)系，變量的賦值情況見表2。其中變量“性別”的相對危險度為7.260，即女性患者的死亡風(fēng)險是男性患者的7.260倍（P=0.015），變量“NDRG4”的相對危險度為7.590，即NDRG4陰性表達的患者死亡風(fēng)險為NDRG4陽性表達患者的7.590倍（P=0.009），NDRG4的表達與患者生存曲線圖見圖2。變量“療效”的相對危險度為2.244，即化療耐藥患者死亡風(fēng)險為化療敏感患者的2.244倍（P=0.035）（表3）。綜上所述，患者的性別、化療療效以及NDRG4的陽性表達均與患者的生存時間相關(guān)。

表2 變量的賦值Tab.2 Valuation of variables

圖2 NDRG4的表達情況與患者生存曲線圖Fig.2 NDRG4 expression and patient survival curve

表3 逐步COX回歸模型分析結(jié)果Tab.3 Analysis of stepwise COX regression model

3 討論

小細胞肺癌腫瘤細胞倍增時間短，進展快，極易出現(xiàn)繼發(fā)性耐藥。化療耐藥性的形成伴隨著細胞成分和生物過程的變化，如代謝重塑，膽固醇代謝可能有助于化療耐藥性［6］。此外，H3K9組蛋白甲基化可能在抑制腫瘤抑制基因和促凋亡基因的表達以促進耐藥性中起到重要作用。在富含細胞成分的途徑中，TRIPATHI等［7］發(fā)現(xiàn)突觸小泡也可能在耐藥性中起重要作用，包括ABCC1相關(guān)多藥耐藥性中起關(guān)鍵作用的ATP合酶復(fù)合物。超級增強子在獲得化療耐藥性等方面發(fā)揮著重要作用［8］。超級增強子作為跟蹤癌癥演變的生物標(biāo)志物，最終可能成為干預(yù)治療的重要目標(biāo)［9］。

靶向治療與免疫治療是近年來肺癌研究領(lǐng)域的焦點［10］。近年針對非小細胞肺癌靶點的靶向藥物治療獲益，目前還沒有分子靶向藥物被批準(zhǔn)為小細胞肺癌患者的常規(guī)治療［11］。其中可用于小細胞肺癌化療耐藥的二線治療的單克隆抗體有nivolumab和pembrolizumab，nivolumab聯(lián)合ipilimumab與nivolumab單藥方案治療含鉑兩藥聯(lián)合化療進展的晚期小細胞肺癌［12］。免疫療法PD-1/PDL-1抑制劑可針對化療耐藥的小細胞肺癌患者發(fā)揮持續(xù)療效，部分患者可長期生存獲益［13］。

NDRG家族作為與細胞增殖和分化密切相關(guān)的新基因，其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸中的作用越來越受到關(guān)注。在中國胃癌患者中，NDRG4啟動子甲基化可以作為胃癌的診斷生物標(biāo)記物，并可以作為不良的臨床預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)［4］。另有學(xué)者［14］報道NDRG4在宮頸癌細胞中可能作為抑癌基因發(fā)揮作用，為宮頸癌的治療提供了潛在的分子靶標(biāo)。胃癌中NDRG4蛋白的表達與腫瘤的分化、侵襲、轉(zhuǎn)移和分期有顯著相關(guān)性，NDRG4可能是一種潛在的胃癌抑制和預(yù)后標(biāo)志物［15］。

本研究通過免疫組化方法檢測NDRG4在小細胞肺癌組織及正常肺組織中的表達，分析其臨床意義。研究結(jié)果表明，與正常肺組織相比，NDRG4中在小細胞肺癌組織中表達顯著下調(diào)，表明NDRG4在小細胞肺癌組織中的表達被抑制，提示NDRG4基因在小細胞肺癌中也可能具有抑癌作用，作為小細胞肺癌的新型抑癌基因參與小細胞肺癌的發(fā)生發(fā)展。NDRG4表達陽性小細胞肺癌患者的生存期明顯延長，NDRG4表達陰性的小細胞肺癌患者生存期明顯縮短，提示NDRG4與患者的臨床預(yù)后有關(guān)。NDRG4表達缺失的患者對一線化療不敏感，容易出現(xiàn)繼發(fā)性多藥耐藥，NDRG4表達陽性的患者對一線化療較為敏感，提示NDRG4可能參與了小細胞肺癌化療多藥耐藥的調(diào)控，NDRG4的表達水平對評估小細胞肺癌化療藥物的療效具有指導(dǎo)意義。對小細胞肺癌患者進行COX回歸生存分析，患者的性別、化療療效以及NDRG4的陽性表達均與患者的生存時間相關(guān)。

綜上所述，NDRG4在小細胞肺癌中表達顯著低于正常肺組織，NDRG4陰性的小細胞肺癌患者更容易出現(xiàn)多藥耐藥，導(dǎo)致較差的臨床預(yù)后與較短的生存期，由此推測NDRG4的蛋白可以作為預(yù)測小細胞肺癌臨床預(yù)后的生物標(biāo)志物之一。

致謝：感謝中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院為本研究提供部分手術(shù)及穿刺活檢標(biāo)本。