鮑玲娜， 馬洪*， 李超

(1.貴州醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院 口腔頜面外科， 貴州 貴陽 550004； 2.四川省腫瘤醫(yī)院 研究所&四川省癌癥防治中心 頭頸外科， 四川 成都 610000)

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是發(fā)生于口腔頜面部最常見的惡性腫瘤，具有侵襲能力強、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移快、惡性程度高及預后不良等特點[1]，即使診療技巧在過去的數(shù)十年中有不斷的提高，OSCC的復發(fā)率及轉(zhuǎn)移率仍然居高不下，5年生存率依舊較低[2]；與此同時，診療的延遲通常會導致更高的死亡率，因此探析OSCC細胞發(fā)展的分子機制、識別和鑒定與OSCC轉(zhuǎn)移相關的腫瘤標志物一直是學者們的研究熱點[3]。鈣衛(wèi)蛋白S100A8蛋白和S100A9蛋白是S100蛋白家族的重要成員，每個單體包含4個α-螺旋(HⅠ，HⅡ，HⅢ和HⅣ)和2個環(huán)(環(huán)Ⅰ和環(huán)Ⅱ)，S100A8和S100A9蛋白基因定位在1q21染色體上，該區(qū)域染色體易發(fā)生突變、穩(wěn)定性差、易缺失，因此與腫瘤的進展密切相關[4-5]。鈣衛(wèi)蛋白S100A8/A9是S100A8蛋白和S100A9蛋白以Ca2+依賴形式形成的異二聚體復合物，主要在細胞增殖和運動、細胞周期的調(diào)整、細胞分化及腫瘤相關信號通路中發(fā)揮重要作用[4-6]。頭頸部鱗癌研究發(fā)現(xiàn)，S100A8/A9蛋白在口腔癌、鼻咽癌中表達上調(diào)[7-8]，在食管癌中表達下調(diào)[9]，OSCC患者唾液中S100A8蛋白及S100A8/A9蛋白呈高表達[7]；OSCC組織中S100A8蛋白、S100A9蛋白較正?？谇火つそM織的表達明顯增高，且中低分化組表達高于高分化組[10-13]，這些研究均提示S100A8蛋白、S100A9蛋白及S100A8/A9蛋白可能在OSCC的進展中發(fā)揮重要的作用，但具體影響尚不清楚。因此，本實驗擬探討鈣衛(wèi)蛋白S100A8/A9對OSCC細胞增殖和遷移能力的影響，報告如下 。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

人舌鱗狀細胞癌細胞SCC-25購自美國模式菌種收集中心，DMEM/F-12培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青鏈霉素混合液購自美國Gibco公司，Transwell小室、離心管、細胞培養(yǎng)瓶、孔板購自美國BD公司，CCK-8試劑盒購自Biosharp公司，LA2-A生物安全柜購自新加坡ESCO公司，Synergy H4多功能酶標儀購自美國Hybrid公司，CKX41倒置顯微鏡購自日本OLYMPUS公司。

1.2 方法

1.2.1OSCC細胞的培養(yǎng)及傳代 SCC-25細胞培養(yǎng)于DMEM/F-12培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和1%青鏈霉素混合液)中，37 ℃、5% CO2條件下于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細胞生長至80%～90%時進行傳代。

1.2.2CCK-8法檢測細胞增殖能力 根據(jù)文獻[13]將S100A8和S100A9人重組蛋白以質(zhì)量比1 ∶1均勻混合，置于4 ℃，1 h使之結(jié)合形成復合物S100A8/A9以發(fā)揮其生物學效應。取對數(shù)生長期SCC-25細胞清洗、消化并接種于96孔板中，使每孔約含1 000個細胞，于各孔中分別添加5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L和40 mg/L S100A8/A9蛋白，以不接種細胞的空白培養(yǎng)基對照孔作為空白調(diào)零孔，以0 mg/L S100A8/A9蛋白的孔為對照孔，分別在24 h及48 h時加入10 μL CCK-8試劑混勻，在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h后于酶標儀450 nm波長處檢測吸光度值(optical density，OD)，調(diào)零并取3個復孔的平均值，以0 mg/L S100A8/A9蛋白濃度為基點，以各濃度S100A8/A9蛋白OD值與對照組OD值的比值繪制細胞增殖曲線。

1.2.3Transwell小室實驗 取對數(shù)生長期SCC-25細胞清洗、消化、重懸并調(diào)整細胞濃度約1×105個/mL，接種200 μL于Transwell小室內(nèi)，下室內(nèi)添加500 μL完全培養(yǎng)基。實驗組添加5 mg/L S100A8/A9蛋白(該濃度為CCK-8實驗結(jié)果中促增殖作用范圍內(nèi)濃度，本著節(jié)約原則，后續(xù)實驗均采用5 mg/L作為實驗濃度)，24 h后取出Transwell小室，清洗并于4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫中染色15 min，清洗、風干并于倒置顯微鏡下隨機選取5個視野拍照，合計每個視野中的穿聚碳酸酯膜細胞數(shù) 。

1.2.4劃痕實驗 取對數(shù)生長期SCC-25細胞清洗、消化、重懸并調(diào)整細胞濃度約1×105個/mL，接種2.0 mL細胞懸液于6孔板中，設置對照組及添加5 mg/L S100A8/A9蛋白的實驗組，置于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)0 h、24 h、48 h和72 h，拍照。

1.3統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 CCK-8細胞增殖實驗

CCK-8細胞增殖實驗結(jié)果顯示，5、10、20、30和40 mg/L鈣衛(wèi)蛋白S100A8/A9作用下SCC-25細胞24 h時的增殖能力強于對照組(0 mg/L)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；5、10、20和30 mg/L鈣衛(wèi)蛋白S100A8/A9作用下SCC-25細胞48 h時的增殖能力表現(xiàn)出相同趨勢，但40 mg/L鈣衛(wèi)蛋白S100A8/A9作用下SCC-25細胞48 h時的增殖能力較對照組減弱，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。

注：A為24 h，B為48 h；(1)與對照組(0 mg/L)比較，P<0.05。圖1 不同濃度S100A8/A9蛋白對SCC-25細胞增殖的影響Fig.1 Effect of different concentrations of S100A8/A9 on the proliferation of SCC-25 cells

2.2 Transwell 小室實驗

Transwell 小室實驗結(jié)果顯示，5 mg/L鈣衛(wèi)蛋白作用的實驗組穿過聚碳酸酯膜的細胞數(shù)目多于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示5 mg/L鈣衛(wèi)蛋白促進SCC-25細胞侵襲和遷移。見圖2、圖3。

2.3 劃痕實驗

劃痕實驗結(jié)果顯示，5 mg/L鈣衛(wèi)蛋白作用的實驗組在24、48、72 h的細胞劃痕面積明顯小于對照組，提示5 mg/L S100A8/A9蛋白作用于SCC-25細胞可促進其遷移 。見圖4。

3 討論

S100蛋白家族是Ca2+結(jié)合家族中最大的亞類，可以參與細胞增殖、細胞侵襲轉(zhuǎn)移、腫瘤血管生成和免疫逃避等致瘤過程[4-5]。這個過程的原因主要在于[3，14-15]：(1)S100蛋白的基因主要位于人類染色體1q21上，該區(qū)域不穩(wěn)定，易發(fā)生突變；(2)一些腫瘤對S100蛋白的表達具有差異性；(3)許多S100蛋白通過與特定的靶蛋白如NF-κB、p53和β-catenin等相互作用而參加腫瘤的的進展。有研究認為，S100A8/A9蛋白作為一種智能分子，其功能依賴于在細胞內(nèi)外的濃度和位置；研究發(fā)現(xiàn)，在不同惡性腫瘤中S100A8/A9蛋白濃度范圍介于20～250 mg/L時，可通過抑制細胞內(nèi)鋅離子或與受體的相互作用而產(chǎn)生凋亡誘導活性，從而促進腫瘤細胞凋亡；較低水平(<10～25 mg/L)的S100A8/A9蛋白則能促進腫瘤細胞、血管內(nèi)皮細胞和炎癥細胞的存活或遷移，通過RAGE依賴的信號轉(zhuǎn)導及MAPK途徑和NF-κB的激活而促進腫瘤細胞的增殖[8，16-17]。因此，在不同腫瘤中，S100A8/A9蛋白對細胞增殖及抑制作用濃度不同，但趨勢相同。另外，近年來S100A8蛋白、S100A9蛋白和S100A8/A9蛋白的促炎和抗炎功能亦有報道，提示S100A8/A9蛋白的功能是具有濃度依賴性的，并且可受局部環(huán)境的細胞和生化組成的影響[18]。本研究結(jié)果顯示，5、10、20、30和40 mg/L鈣衛(wèi)蛋白S100A8/A9作用下SCC-25細胞24 h時的增殖能力強于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；5、10、20和30 mg/L鈣衛(wèi)蛋白S100A8/A9作用下SCC-25細胞48 h時的增殖能力表現(xiàn)出相同趨勢，但40 mg/L鈣衛(wèi)蛋白S100A8/A9作用下SCC-25細胞48 h時的增殖能力較對照組減弱，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示本實驗總體趨勢與其他學者研究結(jié)果大致符合。

注：(1)與對照組比較，P<0.05。圖2 鈣衛(wèi)蛋白S100A8/A9對SCC-25細胞遷移的影響Fig.2 Effect of different concentrations of S100A8/A9 on the migration ability of SCC-25 cells

圖3 鈣衛(wèi)蛋白S100A8/A9對SCC-25細胞遷移的影響(結(jié)晶紫染色)Fig.3 Migration of SCC-25 cells in Transwell chambers

圖4 S100A8/A9蛋白對SCC-25細胞遷移影響Fig.4 Effect of S100A8/A9 on the wound healing assay of SCC-25 cells

據(jù)腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移途徑理論認為，腫瘤細胞首先從原發(fā)部位脫落，然后侵入到細胞外基質(zhì)與基底膜及細胞間質(zhì)中一些分子黏附，并激活細胞合成、分泌各種降解酶類，協(xié)助腫瘤細胞穿過細胞外基質(zhì)進入血管，然后在某些因子作用下運行并穿過血管壁外滲到繼發(fā)部位，增殖形成轉(zhuǎn)移灶[19]。劃痕實驗是在細胞生長并融合成單層狀態(tài)時，在其上制造一個空白區(qū)域，劃痕邊緣的細胞會逐漸進入空白區(qū)域使其逐漸愈合，從而了解細胞的遷移情況。本研究結(jié)果顯示，5 mg/L鈣衛(wèi)蛋白作用的實驗組穿過聚碳酸酯膜的細胞數(shù)目多于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，同時在24、48及72 h后細胞劃痕面積明顯小于對照組，提示5 mg/L S100A8/A9蛋白作用于SCC-25細胞可促進其遷移，但具體的機制有待進一步研究。

綜上所述，本研究結(jié)果提示5 mg/L鈣衛(wèi)蛋白S100A8/A9能夠促進SCC-25細胞的增殖和遷移。