徐峰， 王瑩

(南通市第一人民醫(yī)院 婦產(chǎn)科， 江蘇 南通 226001)

先兆子癇(pre-eclampsia，PE)是與高血壓、蛋白尿、血小板減少或腎功能不全相關(guān)的妊娠特異性綜合征，嚴(yán)重危害孕產(chǎn)婦的健康[1]。世界范圍內(nèi)孕產(chǎn)婦PE患病率為2%～5%，病死率超過10%[2]。目前，PE診斷主要依靠測量血壓、分析血液和尿液標(biāo)志物，但這些指標(biāo)的特異性不強(qiáng)[3]。因此，篩選出PE早期診斷的特異性標(biāo)志物對于該病的早期預(yù)防及治療意義重大。微小核糖核酸(microRNA, miRNA)是真核生物中廣泛存在的長約21～23個(gè)核苷酸的RNA分子，可調(diào)節(jié)基因表達(dá)[4]。雖然有研究顯示，miRNA表達(dá)的失調(diào)如miR-210和miR-155等與PE的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但因研究的樣本人群過少(僅20例)， 其結(jié)果的代表性有待進(jìn)一步確定[5-6]。因此，本研究通過選取PE孕婦和健康孕婦各60例，比較血清miR-210和miR-155的相對表達(dá)水平，以期為PE的早期診斷提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月-2018年12月就診的PE孕婦和健康孕婦各60例，PE孕婦要求符合《婦產(chǎn)科學(xué)》第5版診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，即至少2次出現(xiàn)收縮壓≥160 mmHg或(和)舒張壓≥110 mmHg，且妊娠20～34周時(shí)伴有嚴(yán)重蛋白尿(≥2 g/24 h)，排除多胎妊娠或非自然受孕者；健康孕婦要求孕期無PE癥狀且臨床資料完整，排除妊娠期間有其他并發(fā)癥。

1.2 血液采集和指標(biāo)測定

收集所有孕婦就診(或孕檢)時(shí)的清晨空腹血，將血樣裝于5 mL離心管中，室溫靜置1 h，3 000 r/min，4 ℃離心5 min，取上清液，置于-80 ℃冰箱中保存。此外，收集所有孕婦就診(或孕檢)時(shí)的臨床資料，包括年齡、孕周、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index, BMI)、收縮壓、舒張壓、血紅蛋白、尿素氮和肌酐，血壓采用歐姆龍HEM-7071上臂式電子血壓計(jì)(上海涵飛醫(yī)療器械有限公司)測量，取坐位右上臂肱動(dòng)脈血壓，測量2次記錄平均值；血紅蛋白選用XT-4000型全自動(dòng)血液分析儀(日本希森美康株式會(huì)社)檢測，尿素氮采用人尿素氮酶聯(lián)免疫試劑盒(上?？祈樕锟萍加邢薰?測定，肌酐采用AU5 800全自動(dòng)生化分析儀(美國貝克曼庫爾特有限公司)測定。

1.3 血液miR-210和miR-155表達(dá)

采用TaqMan?miRNA純化試劑盒(賽默飛世爾科技中國有限公司)提取細(xì)胞總RNA。采用實(shí)時(shí)定量熒光PCR法檢測血液miR-210、miR-155的表達(dá)。根據(jù)目標(biāo)基因的mRNA 序列，按照引物設(shè)計(jì)的原則，用設(shè)計(jì)軟件Primer express 3.0 設(shè)計(jì)并合成引物及探針，見表1。進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄后，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，在ProFlexTM實(shí)時(shí)定量PCR儀(賽默飛世爾科技中國有限公司)上進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為85 ℃、 3 min，85 ℃、20 s，42 ℃ 、40 s，循環(huán)35次。采用2-ΔΔCT法計(jì)算miR-210和miR-155表達(dá)量。

表1 miR-210、miR-155及U6引物序列及產(chǎn)物Tab.1 The primer sequences used in this study

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般資料

兩組孕婦的年齡、BMI指數(shù)、孕周、血紅蛋白和尿素氮比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；但PE組孕婦的收縮壓、舒張壓和肌酐水平均明顯高于對照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示除收縮壓、舒張壓以及肌酐水平外，PE組和對照組孕婦的一般資料均具有可比性。見表2。

表2 兩組孕婦的一般資料比較Tab.2 Comparison of clinical information between two groups of pregnant women

2.2 血清miR-210和miR-155水平比較

PE組孕婦的血清miR-210和miR-155水平均高于對照組孕婦，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見表3。

表3 兩組孕婦血清miR-210和miR-155表達(dá)水平Tab.3 The impact of PE on relative expression levels of serum miR-210 and miR-155

2.3 血清miR-210和miR-155的ROC曲線分析

孕婦血清miR-210的ROC曲線下面積為0.904(95%CI為0.847～0.961，P<0.01)，miR-210相對表達(dá)量的臨界值為3.46時(shí)，其預(yù)測PE的敏感度和特異性最佳，分別為85.3%和82.2%；孕婦血清miR-155的ROC曲線下面積為0.843(95%CI為0.766～0.920，P<0.01)，miR-155相對表達(dá)量的臨界值為2.86時(shí)，其預(yù)測PE的敏感度和特異性最佳，分別為79.2%和74.9% 。見圖1。

圖1 孕婦血清miR-210、miR-155水平預(yù)測PE的ROC曲線Fig.1 ROC curves of serum miR-210 and miR-155 levels used for predicting PE

3 討論

近年來，雖然已有多種潛在蛋白質(zhì)標(biāo)志物用于檢測或預(yù)測PE，如妊娠相關(guān)蛋白、胎盤生長因子及其受體、內(nèi)皮因子和胎盤蛋白13，然而診斷的敏感性和特異性有待確定[7]。與這些潛在蛋白質(zhì)標(biāo)志物相比，miRNA的主要優(yōu)點(diǎn)是檢測成本相對較低、通量高、靈敏度和特異性高[8]。有研究表明miR-210參與了人體內(nèi)多種代謝的過程，包括氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡以及癌癥的發(fā)生發(fā)展等[9]。PE孕婦妊娠過程中，由于滋養(yǎng)細(xì)胞重建母體血管，胎兒-母體界面的氧張力遠(yuǎn)低于健康妊娠[10],與此同時(shí)miR-210通過靶向與胎盤線粒體功能障礙相關(guān)的幾種蛋白質(zhì)，如鐵硫簇支架蛋白(iron-sulfur cluster scaffold homolog,ISCU)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶1α亞復(fù)合體4、鉀通道調(diào)節(jié)因子1(potassium channel modulatory factor 1，KCMF1)等，破壞線粒體的氧化還原反應(yīng)，加重了胎兒-母體界面的缺氧狀態(tài)[11]。已有研究表明Toll樣受體3激活通過低氧誘導(dǎo)因子和核因子KB(nuclear factor-kappa B,NF-KB)p50亞基誘導(dǎo)胎盤miR-210上調(diào)，導(dǎo)致信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白6和白介素-4水平降低，提示缺氧/NF-kB/miR-210通路在PE的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了重要作用[12]。此外，ISCU可以促進(jìn)PE的發(fā)生，miR-210與ISCUmRNA 3′UTR結(jié)合可擾亂滋養(yǎng)細(xì)胞鐵代謝，ISCU下調(diào)又與胎盤缺陷有關(guān)[11]；miR-210的異常過表達(dá)也會(huì)通過干擾人胎盤中KCMF1介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)，從而促成PE的發(fā)生[13]。本研究結(jié)果顯示，PE孕婦血清miR-210水平比健康孕婦上調(diào)，與上述研究結(jié)果相符，提示血清miR-210指標(biāo)可作為PE診斷的參考指標(biāo)。

本研究結(jié)果還顯示,PE孕婦血清miR-155較對照組孕婦上調(diào)，這可能是因?yàn)閙iR-155是內(nèi)皮依賴性血管舒張的重要調(diào)節(jié)因子[14]，可通過下調(diào)富半胱氨酸61參與PE的發(fā)生發(fā)展[15]。已有研究證實(shí)，PE重癥孕婦胎盤miR-155水平顯著增加，內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)表達(dá)降低[16]。最新研究還表明miR-155涉及eNOS通路在PE的發(fā)病機(jī)制中的作用，miR-155可抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞中的細(xì)胞侵襲，而eNOS的過表達(dá)時(shí)miR-155的抑制作用被抵消，揭示了miR-155通過負(fù)調(diào)節(jié)eNOS在減弱細(xì)胞遷移行為[17]。因此，本研究有理由認(rèn)為，PE孕婦血清miR-155水平上調(diào)參與了PE的發(fā)展，血清miR-155水平也可作為PE診斷的參考指標(biāo)。

此外，本研究ROC曲線結(jié)果表明，miR-210用作預(yù)測PE的ROC曲線下面積大于miR-155, 且臨界值取最佳時(shí)，miR-210預(yù)測PE的敏感度和特異性均高于miR-155，表明miR-210用于預(yù)測PE的臨床價(jià)值高于miR-155。

綜上所述，本研究提示孕婦血清miR-210和miR-155表達(dá)上調(diào)與PE的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，可作為PE診斷的潛在標(biāo)志物，且miR-210用于預(yù)測PE的臨床價(jià)值高于miR-155。臨床上對于血清miR-210和miR-155表達(dá)過高的患者，應(yīng)予以重視，預(yù)防PE的發(fā)生。