潘欣， 殷家福， 高杰， 孔樹佳

(云南省腫瘤醫(yī)院 藥劑科， 云南 昆明 650118)

伊立替康(Irinotecan，CPT-11)是一種半合成水溶性喜樹堿衍生物，除廣泛用于晚期結(jié)直腸癌和小細(xì)胞肺癌的治療外，在婦科腫瘤、胃癌等實(shí)體腫瘤的治療中也取得了較好的療效[1]。CPT-11的劑量限制性毒性主要為遲發(fā)性腹瀉和中性粒細(xì)胞減少，兩者的發(fā)生率分別可達(dá)到46%和30%，嚴(yán)重可導(dǎo)致死亡[2]。臨床研究表明，CPT-11的不良反應(yīng)表現(xiàn)出明顯的個(gè)體差異，參與CPT-11代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)過程的酶的活性及基因多態(tài)性與不良反應(yīng)相關(guān)。目前研究最多的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1(uridine diphosphase glucuronosyl transferase 1A1, UGT1A1)是CPT-11代謝的關(guān)鍵酶，其編碼基因多態(tài)性與CPT-11導(dǎo)致的化療相關(guān)性毒副反應(yīng)密切相關(guān)[3]；而有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1B1(organic anion transport protein 1B1, OATP1B1)參與了CPT-11的轉(zhuǎn)運(yùn)過程，其編碼基因是溶質(zhì)載體有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員1B1基因(solutecarrierorganicaniontransporterfamilymember1B1,SLCO1B1)。近年來SLCO1B1基因多態(tài)性也日漸成為研究的熱點(diǎn)。另有研究顯示，UGT1A1和SLCO1B1基因多態(tài)性的分布在不同種族間存在明顯差異[4-5]。本研究分析UGT1A1*6和SLCO1B1(388A>G) 兩個(gè)基因多態(tài)性位點(diǎn)在云南漢族腫瘤患者中的分布頻率，以期為CPT-11的個(gè)體化用藥劑量提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2016年8月-2018年8月在云南省腫瘤醫(yī)院應(yīng)用CPT-11進(jìn)行治療的云南漢族腫瘤患者122例，其中男69例、女53例，25～89歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：云南籍漢族患者，相互間3代無血緣關(guān)系。所有入選患者均簽署《知情同意書》，該項(xiàng)目通過醫(yī)院倫理委員會(huì)審批。

1.2 主要儀器與試劑

TL998A型熒光檢測(cè)儀(西安天隆科技有限公司)，低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf)。核酸純化試劑(耀金寶)、基因檢測(cè)通用試劑(耀金分)、10×氯化銨溶液均由北京華夏時(shí)代基因科技發(fā)展有限公司提供。

1.3 方法

選用乙二胺四乙酸二鈉抗凝采血真空管采集患者用藥前外周靜脈血3 mL，采用1×NH4Cl溶液提取血液白細(xì)胞，在白細(xì)胞沉淀中加入核酸純化試劑40 μL，混勻后靜置30 min，向相應(yīng)的測(cè)序反應(yīng)通用試劑中加入白細(xì)胞混懸液1.5 μL，置于TL998A熒光檢測(cè)儀中，采用數(shù)字熒光分子雜交的方法對(duì)其進(jìn)行基因分型，該方法是在原位分子雜交基礎(chǔ)上，用熒光標(biāo)記探針，對(duì)標(biāo)本DNA進(jìn)行原位雜交，若有待測(cè)SNP位點(diǎn)堿基，則報(bào)告熒光信號(hào)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)、率或比(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 UGT1A1*6和SLCO1B1(388A>G)等位基因和基因型的分布

UGT1A1*6基因分型位點(diǎn)的基因型分為野生型GG、突變雜合子GA及突變純合子AA。SLCO1B1(388A>G)基因分型位點(diǎn)的基因型分為野生型AA、突變雜合子AG及突變純合子GG。在云南漢族腫瘤患者中，UGT1A1*6和SLCO1B1(388A>G)兩個(gè)基因位點(diǎn)的突變頻率較高，UGT1A1*6等位基因的頻率為G(77.87%)和A (22.13%)，SLCO1B1(388A>G)等位基因的頻率為A(27.05%)和G(72.95%)。基因型分布見表1。

表1 云南漢族腫瘤患者UGT1A1*6和SLCO1B1(388A>G)基因多態(tài)性分布Tab.1 Polymorphism distribution of UGT1A1*6 and SLCO1B1 (388A>G) in cancer patients of Yunnan Han people

2.2 UGT1A1*6和SLCO1B1(388A>G)位點(diǎn)基因型分布的哈迪-溫伯格平衡分析

UGT1A1*6位點(diǎn)的基因型分布符合哈迪-溫伯格平衡(P=0.117)，雜合度和期望雜合度分別為0.295和0.345；SLCO1B1(388A>G)位點(diǎn)的基因型分布也符合哈迪-溫伯格平衡(P=0.647)，雜合度和期望雜合度分別為0.377和0.395。

2.3 不同臨床特征腫瘤患者UGT1A1*6基因型分布

不同性別和年齡的腫瘤患者UGT1A1*6基因型分布比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，且不同腫瘤發(fā)生部位的患者UGT1A1*6基因型分布差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 云南漢族不同臨床特征腫瘤患者UGT1A1*6基因型分布Tab.2 Genotypic distribution of UGT1A1*6 in cancer patients with different clinical characters

2.4 不同臨床特征腫瘤患者SLCO1B1(388A>G)基因型分布

SLCO1B1(388A>G)的基因型頻率在不同性別、年齡、腫瘤發(fā)生部位等分組中的分布比較結(jié)果顯示，不同性別及年齡腫瘤患者SLCO1B1(388A>G)基因型比較，差異無統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05)，且不同部位腫瘤患者SLCO1B1(388A>G)基因型分布比較，差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 云南漢族不同臨床特征腫瘤患者SLCO1B1(388A>G)基因型分布Tab.3 Genotypic distribution of SLCO1B1 (388A>G)in cancer patients with different clinical characters

2.5 不同腫瘤人群UGT1A1*6和SLCO1B1(388A>G)等位基因頻率分布

UGT1A1*6在云南漢族中的等位基因頻率分別與中國(guó)河南腫瘤患者[6]、日本腫瘤患者[7]的等位基因頻率進(jìn)行比較后結(jié)果顯示，中國(guó)云南漢族、中國(guó)河南和日本腫瘤患者人群中UGT1A1*6等位基因頻率比較相似，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表4；將中國(guó)云南漢族SLCO1B1(388A>G)的等位基因頻率分別與中國(guó)上海腫瘤患者[8]、日本腫瘤患者[7]的等位基因頻率進(jìn)行比較后結(jié)果顯示，云南漢族腫瘤患者SLCO1B1(388A>G)等位基因頻率與中國(guó)上海、日本腫瘤患者的頻率均相似，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

3 討論

CPT-11是一種無活性前體藥，在體內(nèi)主要由羧酸酯酶Ⅱ代謝為活性化合物7-乙基-10-羥基喜樹堿(7-ethyl-10-hydroxycamptothecin, SN-38)，SN-38是DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ(Topo Ⅰ)抑制劑，通過與細(xì)胞DNA形成裂解復(fù)合物導(dǎo)致DNA鏈斷裂，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡而發(fā)揮抗腫瘤活性[9]。SN-38在發(fā)揮抗腫瘤活性的同時(shí)，也可引起遲發(fā)性腹瀉和粒細(xì)胞減少等不良反應(yīng)；隨后SN-38在SLCO1B1基因編碼的OATP1B1協(xié)助下轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟細(xì)胞，經(jīng)UGT1A1醛酸化為無活性的SN-38葡糖苷酸(SN-38G)而排出體外，CPT-11的體內(nèi)分布和不良反應(yīng)有明顯的個(gè)體差異。目前研究認(rèn)為，UGT1A1基因突變可引起UGT1A1酶活性降低或缺失，細(xì)胞毒性產(chǎn)物SN-38蓄積，導(dǎo)致不良反應(yīng)的發(fā)生。UGT1A1基因位于人類2號(hào)染色體2q37，已知該基因的突變位點(diǎn)多達(dá)50多種，目前研究較多的是位于該基因啟動(dòng)子區(qū)的UGT1A1*28和UGT1A1*6兩個(gè)基因多態(tài)性位點(diǎn)。UGT1A1基因啟動(dòng)子區(qū)存在大量TA堿基重復(fù)序列，最常見的為6個(gè)TA重復(fù)序列，即TA6/TA6或*1/*1；UGT1A1*28為7個(gè)TA重復(fù)序列，包括純合突變型(TA7/TA7或*28/*28)和雜合突變型(TA6/TA7或*1/*28)。UGT1A1*6的多態(tài)性表現(xiàn)為211G>A，形成G/G、A/G和A/A這3種基因型[7]。研究顯示，UGT1A1基因多態(tài)性在高加索人、非洲人和亞洲人群之間存在明顯的人種差異，UGT1A1*28純合突變?cè)诟呒铀魅巳汉头侵奕巳褐蟹植驾^高，分別占人群的10%～15%和12%～27%，在亞洲人群中突變率僅為1.2%～4.7%[10]；UGT1A1*6在亞洲人群中的突變頻率可達(dá)13%～23%，且目前只在亞洲人群中發(fā)現(xiàn)[11]。本研究中UGT1A1*6位點(diǎn)A等位基因發(fā)生頻率為22.13%，突變頻率與中國(guó)河南、日本腫瘤患者人群中UGT1A1*6等位基因頻率比較相似，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。來向陽等[12]研究認(rèn)為，不同性別、年齡的腫瘤患者UGT1A1*6位點(diǎn)基因型分布無差異，但不同腫瘤部位的基因型分布有差異。在本研究中，未發(fā)現(xiàn)UGT1A1*6位點(diǎn)在性別、年齡及不同腫瘤部位的基因型分布差異。

表4 UGT1A1*6位點(diǎn)和SLCO1B1(388A>G)位點(diǎn)等位基因在各群體中的分布Tab.4 Allelic distribution of UGT1A1*6 and SLCO1B1(388A>G) sites in different populations

注：(1)與云南漢族比較。

SLCO1B1基因長(zhǎng)約109 kb，位于12號(hào)染色體短臂上，由14個(gè)外顯子和1個(gè)非編碼外顯子組成，主要負(fù)責(zé)編碼特異性分布于肝細(xì)胞基底膜外側(cè)的有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OATP1A1。近年來多個(gè)研究提出，OATP1A1參與了CPT-11活性代謝產(chǎn)物SN-38的運(yùn)輸，其編碼基因SLCO1B1的基因多態(tài)性可顯著影響OATP1B1的轉(zhuǎn)運(yùn)活性[12]，藥物代謝能力下降，CPT-11蓄積而導(dǎo)致不良反應(yīng)的發(fā)生。目前已發(fā)現(xiàn)40余個(gè)SLCO1B1的單核苷酸多態(tài)性[13]，其中SLCO1B1 388A>G和521T>C研究最多，在亞洲人種也最為常見。這兩個(gè)位點(diǎn)在不同種族人群中的分布存在很大差異。已有研究報(bào)道，SLCO1B1(388A>G)在高加索人、非洲人和亞洲人中的突變頻率分別為30%～45%、70%～80%、60%～90%[14-15]。本研究中，云南漢族患者SLCO1B1(388A>G)位點(diǎn)的G等位基因發(fā)生頻率為72.95%，突變頻率與中國(guó)河南、日本腫瘤患者人群中SLCO1B1(388A>G)等位基因頻率比較相似，未發(fā)現(xiàn)分布差異。另外，本研究未發(fā)現(xiàn)SLCO1B1(388A>G)位點(diǎn)在性別、年齡以及不同腫瘤部位的基因型分布差異。

綜上所述，本研究通過對(duì)122例云南漢族腫瘤患者的CPT-11代謝相關(guān)基因UGT1A1和SLCO1B1的研究發(fā)現(xiàn)，云南漢族腫瘤患者UGT1A1*6基因分布情況與我國(guó)河南、日本腫瘤患者的分布頻率一致。SLCO1B1(388A>G)基因分布情況與我國(guó)上海、日本腫瘤患者的分布頻率一致。另外，在本研究中，未發(fā)現(xiàn)UGT1A1*6和SLCO1B1(388A>G)位點(diǎn)在不同性別、年齡以及腫瘤部位的基因分布差異。本研究樣本量較小，尚需要大量樣本的臨床資料進(jìn)一步補(bǔ)充，且有必要進(jìn)一步在云南健康人群中進(jìn)行基因檢測(cè)，為我省日后更大樣本量UGT1A1和SLCO1B1相關(guān)位點(diǎn)突變頻率的研究以及建立基因數(shù)據(jù)庫提供有意義的數(shù)據(jù)積累。