王文聰，張超，劉利元,3，陳楊，張銘，易斌，魯開智，楊明友**

(1.陸軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院 手術(shù)麻醉科， 重慶 400038； 2.重慶三博江陵醫(yī)院 麻醉科， 重慶 400021； 3.中國人民解放軍77611部隊， 西藏 拉薩 850000)

臨床上，丙泊酚是常用全身麻醉的誘導(dǎo)和維持藥物[1]。臨床實踐和動物實驗表明，丙泊酚麻醉具有起效快、無殘留及醒后無宿醉感的優(yōu)點[2-4]。丙泊酚產(chǎn)生麻醉效應(yīng)的神經(jīng)機理尚不完全清楚，研究認為丙泊酚可調(diào)控學習記憶相關(guān)的海馬活動，抑制海馬錐體神經(jīng)元放電，抑制突觸傳遞和可塑性，并減少各種興奮性遞質(zhì)的釋放，進而引起麻醉中認知功能下調(diào)[5-6]，丙泊酚也可直接抑制額葉皮層和內(nèi)嗅皮層等腦區(qū)活動[7]。已有研究揭示，外側(cè)下丘腦與覺醒、意識高度相關(guān)[8]。腦炎病毒感染損害外側(cè)下丘腦后，可引起嚴重嗜睡、覺醒及警覺水平下降。近來，采用毀損實驗、光遺傳和神經(jīng)藥理實驗，發(fā)現(xiàn)毀損或抑制外側(cè)下丘腦可抑制覺醒產(chǎn)生，相反激活外側(cè)下丘腦則可誘發(fā)睡眠向覺醒的轉(zhuǎn)換[8]。本研究將探討丙泊酚是否對作用下丘腦對覺醒與警覺功能產(chǎn)生影響。

1 材料與方法

1.1 動物、主要試劑及儀器

20只C57小鼠，動物由陸軍軍醫(yī)大學動物中心提供，體質(zhì)量25 g，雄性；試劑丙泊酚，多聚甲醛及DAPI購置于Tocris公司；微量注射泵(IVM-1000,英國Scientifica)，德國Leica冰凍切片機，生理采集處理系統(tǒng)(AWG5200，泰盟)，腦立體定位儀(中國瑞沃德)，腦電與肌電記錄電極(中國瑞沃德)。

1.2 方法

1.2.1給藥導(dǎo)管和腦電(EEG)與肌電(EMG)電極埋置 將小鼠用1%戊巴比妥鈉麻醉，固定于腦立體定位儀上，用碘伏、酒精依次消毒，除去顱骨表面軟組織，暴露顱骨及前囟和后囟點。記錄EEG的不銹鋼螺絲(直徑1 mm)電極埋置于分別埋置于額葉(以前囟為標志，向前1 mm，中線旁開1.5 mm，深0.8 mm)與頂葉(以前囟為標志，向后2 mm，中線旁開1.5 mm，深0.8 mm)。兩根采集EMG的電極埋置于左右頸部肌肉。通過記錄動物的EEG與EMG檢測睡眠覺醒狀態(tài)。以前囟為標志，外側(cè)下丘腦給藥導(dǎo)管定位坐標前囟后1.65 mm，中線旁開1.2 mm，深4.8 mm，用牙科鉆在顱骨表面鉆孔。用牙科水泥將EEG與EMG記錄電極和導(dǎo)管固定于顱骨表面。完成手術(shù)后，將小鼠放置于養(yǎng)籠中恢復(fù)。

1.2.2分組及微量給藥 20只小鼠隨機均分為對照組和丙泊酚組，對照組在小鼠外側(cè)下丘腦微量注射0.9% NaCl 0.3 μL，參照文獻[7-9]丙泊酚組在小鼠外側(cè)下丘腦微量注射丙泊酚0.3 μL，微量給藥速度為0.15 μL/min，給藥后留針1 min。

1.2.3EEG與EMG數(shù)據(jù)采集和分析 小鼠手術(shù)后第7天開始采集數(shù)據(jù)，記錄時室溫保持22～23 ℃,6∶00-18∶00為光照時間，18∶00-次日6∶00為黑暗時間，小鼠自由由獲得食物和水。待小鼠適應(yīng)記錄場景后，記錄1 d的數(shù)據(jù)，評價EEG與EMG的質(zhì)量以及小鼠睡眠/覺醒節(jié)律是否正常。待小鼠適應(yīng)記錄系統(tǒng)后，開始外側(cè)下丘腦給藥。為排除睡眠節(jié)律的影響，給藥時間為18∶00，記錄藥后3 h(18∶00-21∶00)的數(shù)據(jù)用Neuroexplorer(5.0)軟件分析，解析出EEG與EMG的對應(yīng)關(guān)系，并經(jīng)過人工核對，校正結(jié)果中不合理的判定。

1.2.4導(dǎo)管埋置位點檢測 小鼠完成記錄后，采用0.9% NaCl(37 ℃)和4%多聚甲醛(4 ℃)進行心臟灌注、立即取腦置4%多聚甲醛中定，隨即轉(zhuǎn)移至30%蔗糖和4%多聚甲醛溶液中脫水；待腦組織沉底后，冰凍切片，厚度為50 μm；按冠狀面對外側(cè)下丘腦連續(xù)切片，DAPI染色、封片，在熒光顯微鏡下觀察導(dǎo)管埋置位點，導(dǎo)管埋置不準的動物不納入統(tǒng)計。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 EEG與EMG監(jiān)測判斷小鼠腦功能狀態(tài)

如圖1所示，通過分析各組小鼠EEG與EMG，小鼠大腦EEG分為覺醒期、非快眼動睡眠(NREM)和快眼動睡眠(REM)，覺醒期EEG主要表現(xiàn)為高頻、低幅度，此時較大幅度的EMG；NREM睡眠期EMG幅度較小，EEG；表現(xiàn)為低頻、高幅度；REM睡眠期；EMG幅度較小，EEG出現(xiàn)特征性規(guī)律的θ振蕩。見圖1。

圖1 EEG與EMG監(jiān)測動物NREM睡眠、REM睡眠及覺醒狀態(tài)結(jié)果Fig.1 Monitoring of NREM sleep, REM sleep and arousal status by EEG and EMG

2.2 丙泊酚對小鼠大腦覺醒時間、NREM和REM睡眠時間的影響

結(jié)果顯示，外側(cè)下丘腦微量注射丙泊酚后，與對照組比較，小鼠覺醒時間顯著減少、NREM和REM睡眠時間顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，見圖2；表明丙泊酚作用于小鼠外側(cè)下丘腦可引起睡眠樣行為，提示外側(cè)下丘腦可能是丙泊酚發(fā)揮麻醉效應(yīng)重要的靶區(qū)。

注：(1)與對照組比較，P<0.001。圖2 丙泊酚作用外側(cè)下丘腦對小鼠覺醒時間、NREM和REM睡眠時間的影響Fig.2 Effects of propofol on arousal time, NREM and REM sleep time in lateral hypothalamus of mice

注：(1)與對照組比較，P<0.001。圖3 外側(cè)下丘腦微注射丙泊酚后誘導(dǎo)出睡眠樣EEG 能量譜Fig.3 Sleep-like EEG energy spectrum induced by microinjection of propofol into lateral inferior colliculus

2.3 外側(cè)下丘腦微注射丙泊酚后誘導(dǎo)出睡眠樣EEG 能量譜

EEG的能量譜可反映大腦功能狀態(tài)。覺醒和警覺性高的時期，神經(jīng)元興奮性高、神經(jīng)元集群電活動去同步化，表現(xiàn)出高頻θ(4～10 Hz)振蕩強，低頻δ(0.5～4 Hz)振蕩弱；相反，NREM睡眠期神經(jīng)元興奮性下降，出現(xiàn)高幅度同步化的δ振蕩。如圖3所示，外側(cè)下丘腦微注射丙泊酚后可引起低頻的δ振蕩(0.5～2 Hz)顯著增加(P<0.001)，與警覺密切相關(guān)的θ(4～10 Hz)振蕩能量下降(P<0.001)，但不影響更高頻的α(10～20 Hz)振蕩能量。結(jié)果表明，外側(cè)下丘腦微注射丙泊酚可降低皮層興奮性、引起皮層神經(jīng)元集群同步化活動、降低小鼠覺醒和警覺水平。

3 討論

靜脈注射丙泊酚導(dǎo)致覺醒和警覺水平下降，引起麻醉效應(yīng)。目前，丙泊酚麻醉的神經(jīng)機制尚不完全清楚。本研究發(fā)現(xiàn)在外側(cè)下丘腦局部微注射丙泊酚，可引起睡眠樣行為改變。通過EEG能量譜分析，發(fā)現(xiàn)丙泊酚引起EEG低頻δ振蕩能量增加，而減少腦電高頻的θ振蕩。上述結(jié)果表明，丙泊酚可直接作用于外側(cè)下丘腦，降低皮層興奮性、引起皮層神經(jīng)元集群同步化活動、進而降低小鼠覺醒和警覺水平。該結(jié)果為丙泊酚產(chǎn)生麻醉效應(yīng)提供了新的神經(jīng)機理。

外側(cè)下丘腦接受前額葉錐體神經(jīng)元、背縫核五羥色胺能神經(jīng)元、中腦多巴胺能神經(jīng)元和基底前腦乙酰膽堿能神經(jīng)元輸入，廣泛投射至前額葉、丘腦以及基底前腦[8,10]。大量文獻報道，外側(cè)下丘腦與覺醒與警覺程度高度相關(guān)。毀損或抑制外側(cè)下丘腦可引起昏睡樣行為表現(xiàn)，相反光/藥物遺傳激活外側(cè)促覺醒神經(jīng)元可快速誘導(dǎo)動物從睡眠向覺醒轉(zhuǎn)換[8]。本研究發(fā)現(xiàn)外側(cè)下丘腦微注射丙泊酚可使覺醒時間減少，EEG能譜出現(xiàn)睡眠樣變化，該結(jié)果表明外側(cè)下丘腦可能丙泊酚發(fā)揮麻醉作用重要的靶區(qū)。

在新皮層及皮層下海馬區(qū)域，一方面丙泊酚直接作用于興奮性神經(jīng)元的胞體，增強鉀通道或抑制超極化激活非選擇性陽離子通道，使神經(jīng)元發(fā)生超極化，引起興奮性下調(diào)。另一方面，丙泊酚亦可增強抑制性輸入，進而抑制這些腦區(qū)的興奮性[7,9,11-13]。因此，推測丙泊酚也可通過上述的方式引起外側(cè)下丘腦神經(jīng)元興奮性下降，進而促進睡眠樣行為的發(fā)生，覺醒和警覺水平下降。

外側(cè)下丘腦具有多種不同神經(jīng)元類型，主要包括食欲素(Orexin)神經(jīng)元、γ-氨基丁酸(GABA)神經(jīng)元、谷氨酸能神經(jīng)元以及黑色素聚集激素(MCH)神經(jīng)元。近來，神經(jīng)元特異性操控技術(shù)發(fā)現(xiàn)這些神經(jīng)元具有不同功能，orexin神經(jīng)元與GABA能神經(jīng)元具有強烈的促覺醒作用，而MCH神經(jīng)元則主要參與REM睡眠的發(fā)生[14]。本研究側(cè)重于睡眠/覺醒行為學的觀察，丙泊酚是否特異性抑制外側(cè)下丘腦促覺醒神經(jīng)元(orexin與GABA能神經(jīng)元)及其分子機制尚不清楚，將來還需進一步研究。

綜上，丙泊酚作為臨床上常用的麻醉藥物，具有起效迅速、殘留少，但其關(guān)鍵性的作用機制并不清楚，并阻礙了選擇性達到麻醉理想效應(yīng)而較少產(chǎn)生呼吸與神經(jīng)心理不良反應(yīng)的新麻醉藥的開發(fā)。本研究發(fā)現(xiàn)外側(cè)下丘腦是丙泊酚發(fā)揮麻醉效應(yīng)重要的靶區(qū)，該發(fā)現(xiàn)有望為理想麻醉藥物的開發(fā)提供重要的理論依據(jù)。