劉 然 曲亮璠 王祥河 許勤虎 史連生

1（天津量信檢驗認(rèn)證技術(shù)有限公司，天津 300462）2（天津市工業(yè)微生物研究所有限公司，天津 300462）3（天津?qū)嵃l(fā)中科百奧工業(yè)生物技術(shù)有限公司，天津 300462）

蛹蟲草（Cordyceps militaris）營養(yǎng)價值豐富，高蛋白，低脂肪，維生素和礦物質(zhì)含量較高，是藥食同源性真菌，在我國分布廣泛。蛹蟲草與冬蟲夏草的功效成分和藥理作用類似，其中多糖類、蟲草酸、蟲草素、超氧化物歧化酶（SOD）等功能性物質(zhì)具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等功能，近年來逐漸成為國內(nèi)外的研究熱點。蛹蟲草菌絲體液體發(fā)酵方法與傳統(tǒng)的人工培養(yǎng)方法不同，具有速度快、周期短、產(chǎn)量高、條件易于控制等特點，是一種新的產(chǎn)業(yè)化途徑，具有良好的商業(yè)價值和廣闊的市場空間。液體培養(yǎng)基的組分和配比以及發(fā)酵過程中pH 值、接種量、轉(zhuǎn)速、溫度等各個條件的控制對微生物菌絲體的繁殖和代謝產(chǎn)物的累積有直接的聯(lián)系。因此，若要提高蛹蟲草菌絲體的產(chǎn)量，首先要篩選出適宜發(fā)酵的培養(yǎng)基組成，再對發(fā)酵的工藝條件進行優(yōu)化。本文通過單因素、響應(yīng)面試驗，優(yōu)化了蛹蟲草液體發(fā)酵生產(chǎn)菌絲體的工藝，旨在為其工業(yè)化生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)，也為開發(fā)新的保健食品、尋找新的藥食來源提供科學(xué)依據(jù)和新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試菌株蛹蟲草（Cordyceps militaris），菌種編號：CICC 14013。

蔗糖、蛋白胨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、維生素B1、維生素B12均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

METTLER AE200 分析天平；METTLER Seven Multi pH 計；蘇州凈化SW-CJ-2F 型雙人雙面凈化工作臺；日本三洋MLS-3750 高壓滅菌鍋；上海安亭GL-20G-II 高速冷凍離心機；博迅GZX-9146 MBE 數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱。

1.3 方法

1.3.1 蛹蟲草液體發(fā)酵試驗

1.3.1.1 液體種子的制備

斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L。

液體種子培養(yǎng)基：蔗糖40 g/L，蛋白胨20 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，硫酸鎂1 g/L。

采用500 mL 三角瓶用于液體種子培養(yǎng)，接入1 cm2的斜面菌種，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min，裝液量為200 mL，溫度22 ℃，培養(yǎng)5 d。

1.3.1.2 發(fā)酵單因素試驗

發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖40 g/L、蛋白胨30 g/L、硫酸鎂1.5 g/L、磷酸二氫鉀1.5 g/L、維生素B1適量、維生素B12適量。選擇常見的蛋白胨和酵母膏作為氮源，葡萄糖、蔗糖和麥芽糖作為碳源，篩選出最佳液體培養(yǎng)基成分；分別選取不同pH 值（5、6、7、8、9），不同發(fā)酵溫度（19 ℃、22 ℃、25 ℃、28 ℃、31 ℃），不同搖床轉(zhuǎn)速（130 r/min、150 r/min、170 r/min、190 r/min、210 r/min），不同接種量（2.5%、5.0%、7.5%、10.0%），不同裝液量（60 mL、80 mL、100 mL、120 mL、140 mL），以蛹蟲草發(fā)酵產(chǎn)物中的菌絲體生物量為指標(biāo)，發(fā)酵過程中保證其他條件不變，搖床振蕩培養(yǎng)6 d，進行單因素試驗。

1.3.1.3 發(fā)酵響應(yīng)面試驗

在上述單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，進行三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗，以獲得最佳發(fā)酵條件和最大菌絲體產(chǎn)量。

1.3.2 菌絲體產(chǎn)量測定方法

發(fā)酵產(chǎn)物中菌絲體的產(chǎn)量采用細(xì)胞干重法測定，取發(fā)酵產(chǎn)物于6 000 r/min 冷凍離心20 min，棄去上清液，用蒸餾水將菌絲體洗凈后，重復(fù)上述試驗操作，將得到的菌絲體置于60 ℃干燥箱中烘干至恒重。菌絲體產(chǎn)量按下式計算：

式中：X——菌絲體生物量，g/L；

W——菌絲體干重，g；

V——取樣體積，mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 蛹蟲草發(fā)酵最適碳、氮源種類篩選

在液體培養(yǎng)發(fā)酵中，碳源是除水分外細(xì)胞生長需要量最多的營養(yǎng)物質(zhì)，為蛹蟲草生長、合成物質(zhì)提供能量，約占細(xì)胞干重的50%。氮源的基本作用是為微生物生長過程中蛋白質(zhì)以及核酸的合成提供原料。由于微生物種類不同，生理特性有所差異，所能利用的碳源、氮源品種亦不相同。采用常見的單糖、雙糖、低聚糖分別與蛋白胨和酵母膏組合，以菌絲體產(chǎn)量為判斷標(biāo)準(zhǔn)，篩選出蛹蟲草發(fā)酵的最適碳氮源。不同碳源、氮源組合對蛹蟲草發(fā)酵菌絲體產(chǎn)量的影響見表1。由表1 可知，碳源對蛹蟲草菌絲體產(chǎn)量的影響高于氮源。當(dāng)蔗糖被用作發(fā)酵碳源時，菌體的生長速度更快，產(chǎn)量更高，所得菌絲體生物量高于利用葡萄糖和麥芽糖發(fā)酵所得。這可能是因為蔗糖更適合蛹蟲草生長，更容易被菌體細(xì)胞吸收和轉(zhuǎn)化。此時以蔗糖- 蛋白胨為培養(yǎng)基的蛹蟲草發(fā)酵6 d，生物量達(dá)到最大值，為25.2 g/L。

表1 不同碳源、氮源組合對蛹蟲草發(fā)酵菌絲體產(chǎn)量的影響

2.1.2 溫度對菌絲體產(chǎn)量的影響

蛹蟲草菌絲體的合成和各種功效成分的累積是在菌體內(nèi)各種酶的催化條件下進行的，而酶的活性與溫度密切相關(guān)。為了達(dá)到菌絲體生長速率快、代謝速度高的目的，在發(fā)酵過程中對于溫度的控制尤為重要。不同溫度對蛹蟲草發(fā)酵菌絲體產(chǎn)量的影響如圖1 所示。

圖1 不同溫度對蛹蟲草發(fā)酵菌絲體產(chǎn)量的影響

由圖1 可知，蛹蟲草菌絲體在19 ℃～31 ℃范圍內(nèi)均可生長。當(dāng)溫度處于19 ℃～25 ℃，菌絲體產(chǎn)量較為理想；溫度高于28 ℃，菌體產(chǎn)量顯著下降。當(dāng)溫度為22 ℃時，菌絲體產(chǎn)量達(dá)到最高，為25.0 g/L。溫度過低、過高都會使菌體內(nèi)酶的活力降低、蛋白質(zhì)合成速度減慢，因此將蛹蟲草的液體發(fā)酵溫度定為22 ℃。

2.1.3 裝液量對菌絲體產(chǎn)量的影響

裝液量的多少可以反應(yīng)出搖瓶中的通氣量，從而影響菌體生長所需氧氣的供給和發(fā)酵過程中廢氣的排放，發(fā)酵搖瓶內(nèi)培養(yǎng)基裝液量過高或過低，都不利于蛹蟲草菌絲體的富集培養(yǎng)，影響發(fā)酵結(jié)果。不同裝液量對蛹蟲草發(fā)酵菌絲體產(chǎn)量的影響如圖2所示。

由圖2 可知，當(dāng)發(fā)酵搖瓶的裝液量為100 mL時，蛹蟲草的生長情況最好，獲得的菌絲體最多，此時菌絲體產(chǎn)量達(dá)到25.4 g/L。

2.1.4 pH 對菌絲體產(chǎn)量的影響

過高、過低的pH 值都會影響真菌體內(nèi)多糖和蛋白質(zhì)合成過程中相關(guān)酶的活性，不利于其菌體生長。不同pH 值對蛹蟲草發(fā)酵菌絲體產(chǎn)量的影響如圖3 所示。

由圖3 可知，隨pH 值在5～9 范圍內(nèi)變化，菌絲體的產(chǎn)量呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，當(dāng)pH 值為7 時，其產(chǎn)量達(dá)到最大值24.6 g/L。

圖2 不同裝液量對蛹蟲草發(fā)酵菌絲體產(chǎn)量的影響

圖3 不同pH 值對蛹蟲草發(fā)酵菌絲體產(chǎn)量的影響

2.1.5 接種量對菌絲體產(chǎn)量的影響

通過接種，可以在蛹蟲草發(fā)酵過程中為其提供生命力強、生長旺盛的種子。不同接種量對蛹蟲草發(fā)酵菌絲體產(chǎn)量的影響如圖4 所示。

圖4 不同接種量對蛹蟲草發(fā)酵菌絲體產(chǎn)量的影響

由圖4 可知，隨著接種量的增加，菌絲體產(chǎn)量呈先上升后下降的趨勢。其原因可能是菌株在有限的營養(yǎng)條件下，適宜的接種量可使菌絲體生長旺盛，各營養(yǎng)物質(zhì)的代謝與轉(zhuǎn)化主要流向菌絲體生長。隨后，培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分幾乎被利用完全，菌絲體達(dá)到最大生長限度，開始產(chǎn)生或外溢一些代謝副產(chǎn)物和中間體，其蛋白水解酶的活力逐漸升高，并伴隨著菌絲體自溶現(xiàn)象的產(chǎn)生，菌體產(chǎn)量降低。當(dāng)接種量達(dá)到10.0%時，菌絲體產(chǎn)量略有下降。因此，蛹蟲草發(fā)酵的最佳接種量為7.5%，此時生物量為25.1 g/L。

2.1.6 搖床轉(zhuǎn)速對菌絲體產(chǎn)量的影響

使用搖瓶進行發(fā)酵培養(yǎng)時，搖床轉(zhuǎn)速的大小間接影響著發(fā)酵液中氧氣溶解量的多少。蛹蟲草是好氧型微生物，振蕩培養(yǎng)可以解決其發(fā)酵過程中的缺氧問題，氧氣的供應(yīng)影響著菌體生長的快慢及質(zhì)量。若轉(zhuǎn)速過快，則通氧量過大，在搖瓶相同的裝液量條件下，對蛹蟲草菌絲體的剪切力也相對較大，不利于菌體的快速增殖和延伸；若轉(zhuǎn)速過慢，則通氧量不足，剪切力過小，造成菌絲生長遲緩，菌絲體產(chǎn)量低。不同搖床轉(zhuǎn)速對蛹蟲草發(fā)酵菌絲體產(chǎn)量的影響如圖5 所示。

圖5 不同搖床轉(zhuǎn)速對蛹蟲草發(fā)酵菌絲體產(chǎn)量的影響

由圖5 可知，當(dāng)轉(zhuǎn)速為170 r/min 時，蛹蟲草菌絲體生長速度最快，生物量達(dá)到24.9 g/L。

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取pH 值、接種量、搖床轉(zhuǎn)速3 個因素，以發(fā)酵產(chǎn)物中菌絲體產(chǎn)量為指標(biāo)，利用中心組合（Box-Benhnken）試驗設(shè)計原理，進行三因素三水平的響應(yīng)面試驗，其因素與水平見表2，試驗結(jié)果見表3，方差分析見表4。

表2 響應(yīng)面試驗因素與水平

表3 響應(yīng)面試驗結(jié)果

表4 方差分析結(jié)果

由表4 可知，此模型P＜0.000 1，具有高度的顯著性，其決定系數(shù)R2為0.986 4，表明所建立的模型擬合性良好。失擬項P=0.697 9＞0.05，沒有顯著性，說明試驗的誤差較小。在選擇試驗范圍內(nèi)，由F 值大小確定3 個因素對蛹蟲草菌絲產(chǎn)量影響程度排序：pH（A）＞轉(zhuǎn)速（C）＞接種量（B）。在二次項中，AC、BC 對蛹蟲草菌絲產(chǎn)量有顯著的影響，說明AC、BC 之間存在交互作用；AB 對蛹蟲草的菌絲產(chǎn)量沒有顯著影響，表明2種因素之間沒有相互作用。響應(yīng)值的變異系數(shù)CV值為0.96%，表明試驗操作可信。根據(jù)所得數(shù)據(jù)進行回歸分析，擬合得到蛹蟲草發(fā)酵菌絲產(chǎn)量的預(yù)測值對各因素的回歸方程為：Y=28.78-1.39A- 0.31B+ 0.48C + 0.05AB - 0.48AC - 0.33BC - 1.31A2-0.66B2- 1.09C2。

經(jīng)Design-Expert 分析，給出的最優(yōu)工藝參數(shù)如表5 所示。為了驗證模型的適用性，結(jié)合實際操作的便捷性，將上述條件調(diào)整為pH 值6.40，接種量6.50%，搖床轉(zhuǎn)速180.00 r/min，得到菌絲體產(chǎn)量為29.30 g/L，與預(yù)測可獲得的菌絲體產(chǎn)量29.4 g/L 較為接近，說回歸明模型與真實試驗值擬合度較高，能夠有效的提高蛹蟲草菌絲體產(chǎn)量。

表5 Design-Expert 預(yù)測最優(yōu)工藝及驗證

3 結(jié) 論

采用常見的單糖、雙糖、低聚糖分別與蛋白胨和酵母膏組合，篩選出蛹蟲草發(fā)酵的最適碳氮源分別為蔗糖和蛋白胨。以蛹蟲草發(fā)酵產(chǎn)物中的菌絲體產(chǎn)量為指標(biāo)，選取pH 值、接種量、搖床轉(zhuǎn)速3 個因素，通過中心組合（Box-Benhnken）試驗原理進行三因素三水平的響應(yīng)面試驗優(yōu)化發(fā)酵條件，得到最佳發(fā)酵工藝為pH 值6.39，接種量6.61%，搖床轉(zhuǎn)速178.07 r/min，此時菌絲體產(chǎn)量為29.40 g/L。