高飛，曾瑞霞，姜東△

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）以腎小球病變?yōu)榛A(chǔ)，可引起腎功能損害和障礙［1-2］。氧化應(yīng)激為DN 的重要發(fā)病機(jī)制之一，核因子NF-E2 相關(guān)因子（nuclear factor erythroid-2-related factor-2，Nrf2）與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，激活Nrf2/HO-1 信號可以防治DN［3-4］。番石榴葉提取物之一番石榴葉總黃酮（total flavones of psidium guajava leaves，TFPGL）因具有降低血糖及強(qiáng)大的抗氧化應(yīng)激的作用被逐步應(yīng)用于糖尿病合并癥的防治［5-6］。然而，TFPGL 對DN的作用機(jī)制尚不清楚。本研究擬觀察TFPGL 對DN的影響，為DN的防治提供新的可能藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物分組及模型制備 SPF 級雄性SD 大鼠24 只，體質(zhì)量180～220 g，購自錦州醫(yī)科大學(xué)。將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成對照組、糖尿病組、TFPGL 治療組，每組8 只。后2組大鼠正常飲食3 d 后，隔夜禁食水，配制1.5 g/L 鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）溶液（55 mg/kg）腹腔給藥。給藥3 d 后檢測血糖，將血糖大于16.7 mmol/L的大鼠定為糖尿病大鼠模型，造模成功率為93.8%，造模未成功者于3 d 后小劑量（30 mg/kg）STZ 再次注射直到造模成功。模型誘導(dǎo)成功后，依據(jù)文獻(xiàn)［7］，TFPGL 治療組給予TFPGL 灌胃治療（200 mg/kg），將TFPGL 溶于2 mL PBS 中，每日2 次。對照組、糖尿病組給予等劑量PBS。12 周后，進(jìn)行各項指標(biāo)檢測，實驗遵循國家《實驗動物管理條例》。

1.1.2 試劑及儀器 STZ（美國Sigma 公司）；TFPGL（純度98%，西安瑞恩生物科技有限公司）；Nrf2一抗（兔抗大鼠）、血紅素氧合酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）一抗（兔抗大鼠）、GAPDH（小鼠抗大鼠）一抗（英國Abcam 公司）；HE染色試劑盒、熒光二抗及Western blot 二抗（北京碧云天公司）；熒光倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；石蠟切片機(jī)（德國SLEE 公司）；水平電泳儀（美國BIO-RAD公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣本制備 12周后，每組取4只大鼠，4%多聚甲醛固定后摘除腎臟，石蠟包埋、切片，常溫保存，用于HE 染色、免疫熒光、免疫組織化學(xué)染色。另每組取4只大鼠取腎臟，依據(jù)質(zhì)量加蛋白裂解液，冰上剪碎，4 ℃離心25 min 后取上清液，-20 ℃保存用于Western blot檢測。

1.2.2 大鼠血糖（BS）、血尿素氮（BUN）、尿蛋白/尿肌酐比值（ACR）及血清肌酐（SCr）指標(biāo)檢測 分別于實驗的第4、8、12周末采集尾靜脈血測定大鼠血糖，于12周末取材前心臟取血3 mL左右，離心后留取血清，用于檢測BUN、ACR及SC含量。

1.2.3 大鼠腎臟HE染色 切片脫蠟后浸于PBS洗滌3次，每次3 min；滴加蘇木素，2 min；PBS 中1 min，自來水沖洗；95%乙醇1 min；伊紅浸染，2 min，自來水沖洗；脫水透明后封片，拍照觀察。

1.2.4 免疫熒光檢測大鼠腎臟Nrf2表達(dá) 脫蠟步驟同上，切片浸于PBS 洗滌3 次，每次3 min；3%山羊血清+0.3% Triton X-100室溫孵育1 h；不洗，滴加兔抗大鼠Nrf2（1∶500），4 ℃過夜；PBS 洗滌4 次，每次3 min；滴加熒光二抗，室溫避光1 h；PBS洗滌4次，每次3 min；封片后熒光顯微鏡觀察。

1.2.5 免疫組織化學(xué)染色檢測大鼠腎臟HO-1表達(dá) 脫蠟步驟同上，切片于PBS 洗滌3 次，每次5 min；3%H2O2室溫10 min，PBS洗滌3次，每次3 min；3%山羊血清室溫孵育30 min；不洗，滴加兔抗大鼠HO-1（1∶800），4 ℃過夜；PBS洗滌3次，每次3 min；滴加二抗，室溫30 min；PBS洗滌3次，每次3 min；滴加SABC試劑，室溫30 min；PBS洗滌3次，每次3 min；DAB顯色，復(fù)染、脫水、透明封片后顯微鏡拍照，并應(yīng)用Image J軟件分析HO-1表達(dá)陽性率。

1.2.6 Western blot 檢查大鼠腎臟Nrf2、HO-1 相對表達(dá)水平 BCA法測定蛋白濃度，確定電泳時加入10 μL樣品；電泳后半干轉(zhuǎn)膜后取目的條帶，1%BSA 室溫封閉2 h；加入一抗（兔抗大鼠Nrf2，1∶5 000；兔抗大鼠HO-1，1∶10 000），4 ℃孵育過夜；TBST 洗滌4 次，每次5 min；加入二抗室溫2 h，孵育后TBST洗滌4次，每次5 min；ECL試劑盒顯影，以GAPDH為內(nèi)參，Image J軟件分析灰度值，計算Nrf2、HO-1與GAPDH灰度值的比值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較用LSD-t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠BS、BUN、ACR 及SCr 的變化 與對照組相比，糖尿病組血糖明顯升高（P＜0.01），說明造模成功，BUN、ACR 和SCr 亦明顯升高（P＜0.05）。而與糖尿病組相比，TFPGL治療組BS、BUN、ACR和SCr均不同程度下降（均P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of BS,BUN,ACR and SCr values between the three groups表1 3組BS、BUN、ACR和SCr比較 （n=8，±s）

Tab.1 Comparison of BS,BUN,ACR and SCr values between the three groups表1 3組BS、BUN、ACR和SCr比較 （n=8，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組相比，b與糖尿病組相比，P＜0.01；表2同

組別對照組糖尿病組TFPGL治療組F BS（mmol/L）4.31±0.17 21.61±1.87a 17.82±0.68b 499.93＊＊BUN（mmol/L）6.22±0.55 17.68±0.76a 13.39±0.55b 675.07＊＊ACR（μg/mg）113.45±3.71 322.56±6.52a 189.40±6.84b 2 610.54＊＊SCr（μmol/L）27.45±0.93 46.40±1.18a 35.48±1.28b 559.34＊＊

2.2 HE染色檢測大鼠腎臟形態(tài)學(xué)變化 光鏡結(jié)果顯示，對照組腎組織基本正常；與對照組相比，糖尿病組腎小球體積增大，細(xì)胞外基質(zhì)增生，并可見腎小管上皮細(xì)胞水腫；而與糖尿病組相比，TFPGL治療組上述變化有所改善，見圖1。

Fig.1 Morphological observation of kidneys(HE staining,×400)圖1 腎臟形態(tài)學(xué)觀察（HE染色，×400）

2.3 免疫熒光染色檢測結(jié)果 將對照組大鼠腎臟Nrf2 熒光強(qiáng)度設(shè)定為100%，熒光強(qiáng)度分析結(jié)果顯示，與對照組比較，糖尿病組Nrf2熒光強(qiáng)度有所增加（P＜0.05）；而與糖尿病組比較，TFPGL 治療組明顯增加（P＜0.05），見表2、圖2。

Tab.2 Comparison of expressions of Nrf2 and HO-1 between the three groups表2 各組大鼠腎臟Nrf2、HO-1表達(dá)比較（n=4，%，±s）

Tab.2 Comparison of expressions of Nrf2 and HO-1 between the three groups表2 各組大鼠腎臟Nrf2、HO-1表達(dá)比較（n=4，%，±s）

組別對照組糖尿病組TFPGL治療組F Nrf2熒光強(qiáng)度100.00±0.00 125.25±1.77a 162.98±2.14b 1 566.87＊＊HO-1陽性率31.51±0.59 17.77±0.87a 38.90±0.67b 896.87＊＊Nrf2 12.94±0.70 15.95±0.61a 22.61±1.01b 155.06＊＊HO-1 23.47±0.37 18.00±0.60a 25.58±0.78b 167.517＊＊

Fig.2 The expressions of renal Nrf2(immunofluorescence staining，×400）圖2 腎臟Nrf2表達(dá)變化（免疫熒光染色，×400）

2.4 免疫組織化學(xué)染色檢測結(jié)果 與對照組相比，糖尿病組HO-1 表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；與糖尿病組相比，TFPGL 治療組明顯增加（P＜0.05），見表2、圖3。

Fig.3 The expressions of renal HO-1(Immunohistochemical staining，×400)圖3 腎臟HO-1表達(dá)變化（免疫組織化學(xué)染色，×400）

2.5 Western blot檢測結(jié)果 與對照組相比，糖尿病組Nrf2 表達(dá)有所增加，HO-1 表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；與糖尿病組相比，TFPGL 治療組Nrf2 表達(dá)明顯增加，HO-1 表達(dá)明顯增加（P＜0.05），見表2、圖4。

Fig.4 The relative expressions of renal Nrf2 and HO-1 detected by Western blot assay圖4 Western blot 檢測Nrf2、HO-1蛋白相對表達(dá)

3 討論

Diabetes Atlas 第七版中國區(qū)統(tǒng)計數(shù)據(jù)得出，2015年中國糖尿?。?0～79歲）患者數(shù)量較2013年增加1 120萬，達(dá)1.096億，已居全球首位［8］。隨糖尿病病程的延長，可引起DN。DN 狀態(tài)下，高血糖、炎癥因子等可引起活性氧族（ROS）堆積，進(jìn)而加重DN［9-10］，而外源性給予抗氧化應(yīng)激藥物可對DN 產(chǎn)生保護(hù)作用及減緩DN的發(fā)生發(fā)展［11-12］。

TFPGL為番石榴葉的提取物，具有調(diào)節(jié)血糖、緩解氧化應(yīng)激損傷等多種生物學(xué)活性。蔡丹昭等［6］研究發(fā)現(xiàn)，TFPGL可有效降低STZ糖尿病小鼠血糖，且隨著給藥時間的延長，降血糖效果明顯增加。筆者推測TFPGL對DN會有一定的治療效果。本研究首先誘導(dǎo)建立糖尿病模型，12周后對反映腎功能的相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示糖尿病組BS、BUN、ACR、SCr 均明顯升高，而給予TFPGL 治療后，大鼠血糖有所下降，BUN、ACR、SCr 均有所降低，說明TFPGL 對DN 的防治效果明顯，這可能與TFPGL 的降血糖作用有關(guān)。

Nrf2 可與抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE）結(jié)合，上調(diào)HO-1的表達(dá)，進(jìn)而提高組織的抗氧化能力［13-14］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2 信號通路對包括DN 在內(nèi)的多種以氧化應(yīng)激為主要發(fā)病機(jī)制的疾病都具有保護(hù)作用。氧化應(yīng)激增強(qiáng)時，Kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（Kelchlike ECH associatedprotein 1，Keap1）發(fā)生構(gòu)象改變，Nrf2 與Keapl 解離，進(jìn)一步與ARE 靶向結(jié)合，啟動基因轉(zhuǎn)錄，可上調(diào)HO-1等的表達(dá)，從而拮抗體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)［15-16］。Tidke等［17］研究發(fā)現(xiàn)，激活Nrf2信號通路后可減輕四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小鼠腎功能不全、降低氧化應(yīng)激水平。而本研究結(jié)果顯示，DN 狀態(tài)下大鼠腎臟Nrf2 表達(dá)增加，這可能為DN 時腎臟對抗氧化應(yīng)激的適應(yīng)性反應(yīng)[18]，然而HO-1表達(dá)卻明顯下降，這可能與DN時氧化應(yīng)激反應(yīng)過度消耗了通過機(jī)體自身的Nrf2/HO-1通路激活而增加的HO-1，進(jìn)而引起氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。而給予TFPGL 治療后，大鼠腎臟Nrf2、HO-1表達(dá)明顯增加，提示TFPGL在一定程度上可以激活Nrf2 的表達(dá)，上調(diào)HO-1 的表達(dá)，進(jìn)而對抗大鼠DN狀態(tài)下氧化應(yīng)激損傷。

綜上所述，TFPGL 對糖尿病大鼠腎臟病變具有一定的治療效果，其機(jī)制可能與降低血糖和激活Nrf2/HO-1信號通路有關(guān)。當(dāng)然，DN發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，TFPGL對DN的防治效果有待進(jìn)行深入探討。