胡曉璇，于丹，謝劍煒，許德鳳，鐘玉緒△

芥子氣（sulfur mustard，SM）是一種具有烷化和糜爛特性的化學(xué)毒物［1］。純SM黏稠無味，具有疏水性和較強(qiáng)的親脂性。SM 通常經(jīng)眼睛、皮膚、呼吸道及胃腸道等上皮和黏膜屏障侵入機(jī)體，觸發(fā)全身不同器官的急性和遲發(fā)性毒性作用［2］。研究表明，SM可耗竭細(xì)胞內(nèi)抗氧化劑如谷胱甘肽（glutathione，GSH）和硫氧還蛋白，導(dǎo)致線粒體膜改變，促使活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生過剩［3］。與此同時，誘導(dǎo)抗氧化酶如超過氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathion peroxidase，GSH-Px)、硫氧還蛋白還原酶（thioredoxin reductase，TrxR）及谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferases，GST）活性喪失，由此引發(fā)肺的氧化應(yīng)激反應(yīng)［4］。SM誘導(dǎo)的炎癥和氧化應(yīng)激機(jī)制相互關(guān)聯(lián)，互為因果，在肺損傷機(jī)制中起著關(guān)鍵的作用［5］。本研究在預(yù)實(shí)驗(yàn)獲取SM 等毒性劑量（1LD50）基礎(chǔ)上，建立SM 經(jīng)腹腔和氣管途徑誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠模型，比較2 種模型血清抗氧化酶譜水平和肺泡間隔相關(guān)蛋白表達(dá)的差異性，并探討SM誘導(dǎo)急性肺損傷的分子機(jī)制，為其治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 SM（液態(tài)，純度96%）由中國人民解放軍軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所提供。1，2-丙二醇溶液購自天津致遠(yuǎn)化學(xué)有限公司。SOD、CAT、GSH-Px 酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司。銅鋅超過氧化物歧化酶（CuZn-superoxide dismutase，CuZn-SOD）、錳超過氧化物歧化酶（Mn-superoxide dismutase，Mn-SOD）、對氧磷酶-1（paraoxonase-1，PON-1）、載脂蛋白-1（apolipoprotein-1，ApoA-1）免疫組化試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。全自動生化免疫一體機(jī)COBAS 8000型（瑞士羅氏公司）；冷光源AXEL-300 型（德國歐司朗公司）；光學(xué)顯微鏡BX51型（日本奧林巴斯公司）；Image Pro Plus 6.0病理細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)（美國Media Cybernetics公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物與分組 SPF級健康雄性Sprague Dawley（SD）大鼠（中國人民解放軍軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動物中心，合格證號：11401500045809）226 只，體質(zhì)量280～300 g，15周齡。隨機(jī)抽取50只SD大鼠行預(yù)實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過霍恩氏法計(jì)算不同給藥途徑下的半數(shù)致死量（median lethal dose，LD50），依預(yù)實(shí)驗(yàn)情況將正式實(shí)驗(yàn)中給藥劑量調(diào)整為0.96 LD50=8 mg/kg（腹腔途徑）和0.98 LD50=2 mg/kg（氣管途徑），然后以1LD50的SM 染毒。將大鼠分為腹腔SM 組（40 只）、腹腔丙二醇組（32只）、氣管SM組（40只）、氣管丙二醇組（32只）、正常對照組（32 只）。腹腔SM 組和氣管SM 組各取40 只，目的是SM（1LD50）染毒后，排除大鼠死亡數(shù)，保證每組每時間段樣本量（n=8）。SM臨用前用丙二醇稀釋至所需濃度。

1.3 建模 （1）大鼠氣管途徑染毒模型建立：實(shí)驗(yàn)前氣管SM組和氣管丙二醇組皮下注射阿托品（0.05 mg/kg），30 min后腹腔內(nèi)注射鹽酸氯胺酮（100 mg/kg）實(shí)施麻醉，氣管內(nèi)注入稀釋的SM 0.1 mL，氣管丙二醇組注入丙二醇0.1 mL。（2）大鼠腹腔途徑染毒模型建立：同氣管途徑方法實(shí)施麻醉。大鼠腹腔SM組腹腔內(nèi)注入稀釋的SM 0.1 mL，腹腔丙二醇組注入丙二醇0.1 mL。正常對照組不做任何處理。分別在注射后6、24、48、72 h每組隨機(jī)選取8只動物抽取血樣和獲取組織標(biāo)本。

1.4 ELISA 法檢測血清酶譜變化 將腹腔SM 組、腹腔丙二醇組、氣管SM 組、氣管丙二醇組、正常對照組不同時間點(diǎn)獲取的大鼠血2 mL，37 ℃水浴1 h，4 ℃過夜，然后223.6×g離心10 min，取上清液，分裝在無菌小瓶中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩２捎萌詣由庖咭惑w機(jī)檢測血清SOD、CAT、GSH-Px 濃度。所有流程嚴(yán)格按說明書進(jìn)行操作。

1.5 免疫組化（SP 法）染色CuZn-SOD、Mn-SOD、PON-1、ApoA-1 的表達(dá) 收集各組大鼠肺組織標(biāo)本，石蠟包埋、切片、脫蠟、水化、枸櫞酸緩沖液抗原修復(fù)，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌，3%過氧化氫封閉，正常山羊血清封閉，滴加兔抗大鼠CuZn-SOD、Mn-SOD、PON-1、ApoA-1 單克隆抗體（20 μL/片），PBS 代替一抗作陰性對照，用已知陽性切片作陽性對照，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，中性樹膠封片。每張切片隨機(jī)抽取5個不重復(fù)視野，計(jì)算其肺泡間隔陽性細(xì)胞數(shù)（包括陽性和強(qiáng)陽性），取平均值。陽性指細(xì)胞漿或核出現(xiàn)棕黃色顆粒，強(qiáng)陽性細(xì)胞指細(xì)胞漿或核出現(xiàn)棕褐色顆粒。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用±s表示，多組間比較用重復(fù)測量的多因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q法，其中各時點(diǎn)組間比較用多元方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SM（1LD50）不同給藥途徑對大鼠抗氧化酶譜的影響 1LD50采用的是芥子氣染毒后7 d內(nèi)的數(shù)據(jù)，時間效應(yīng)與干預(yù)措施間對各組各指標(biāo)均有影響，且存在交互作用（P＜0.05）。（1）組間比較：在同一時間點(diǎn)，腹腔和氣管SM 組血清SOD、CAT、GSH-Px 水平與其他3組相比均升高（P＜0.05）；腹腔SM 組較氣管SM 組各指標(biāo)水平亦升高（P＜0.05）。（2）組內(nèi)比較：腹腔SM組和氣管SM組血清SOD、CAT、GSH-Px水平均24 h 達(dá)高峰，然后逐漸下降（P＜0.05），見表1、2。

2.2 SM（1LD50）不同給藥途徑對大鼠肺泡間隔CuZn-SOD、Mn-SOD、PON-1、ApoA1 蛋白表達(dá)的影響 腹腔SM 組和氣管SM 組6 h 肺泡間隔CuZn-SOD、Mn-SOD、PON-1、ApoA-1蛋白陽性表達(dá)呈帶狀分布，24 h聚集成簇，48 h和72 h呈團(tuán)簇狀。腹腔和氣管丙二醇組、正常對照組呈零星分布，見圖1～4。

時間效應(yīng)與干預(yù)措施間對各指標(biāo)均有影響，且存在交互作用（P＜0.05）。（1）組間比較：在同一時間點(diǎn)，腹腔SM 組和氣管SM 組肺泡間隔CuZn-SOD、Mn-SOD、PON-1、ApoA-1蛋白陽性表達(dá)率與其他3組相比均升高（P＜0.05）；腹腔SM組較氣管SM組亦升高（P＜0.05）。（2）組內(nèi)比較：隨時間延長，腹腔SM組肺泡間隔CuZn-SOD、Mn-SOD、PON-1、ApoA-1蛋白陽性表達(dá)率相均呈升高趨勢（P＜0.05）；氣管SM組肺泡間隔CuZn-SOD、Mn-SOD、PON-1、ApoA-1 蛋白陽性表達(dá)率均呈升高趨勢（P＜0.05），見表3、4。

3 討論

SM是一種親脂的和損傷細(xì)胞的烷化劑，可誘導(dǎo)血液、肝、肺組織細(xì)胞內(nèi)抗氧化劑（GSH）和抗氧化酶減少，脂過氧化反應(yīng)和氧化型GSH 增加，ROS 蓄積，導(dǎo)致脂類、蛋白、核酸損傷［6］。ROS可直接影響肺細(xì)胞凋亡與增殖、細(xì)胞外基質(zhì)代謝、線粒體呼吸系統(tǒng)、表面活性物質(zhì)維持及肺泡修復(fù)和免疫調(diào)節(jié)的重塑。一旦細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS 增加，則會出現(xiàn)線粒體的損傷或功能不全，誘發(fā)細(xì)胞凋亡。氧化與抗氧化的平衡是機(jī)體維持正常細(xì)胞生理代謝的重要環(huán)節(jié)，一旦失衡即可轉(zhuǎn)為病理狀態(tài)。細(xì)胞的抗氧化系統(tǒng)包括抗氧化酶（SOD、CAT、GSH-Px、GST）和抗氧化劑（GSH、維生素E、A、C）。SOD 能將過剩的超氧化物陰離子轉(zhuǎn)化為水；CAT 和GSH-Px 則將過氧化氫轉(zhuǎn)化為水［7］。研究顯示，SM誘導(dǎo)慢性肺損傷患者抗氧化酶和抗氧化劑明顯減少，說明機(jī)體內(nèi)ROS 產(chǎn)生與細(xì)胞抗氧化防御系統(tǒng)之間處于嚴(yán)重的失調(diào)狀態(tài)［5］。本研究發(fā)現(xiàn)，暴露SM（1LD50）后，腹腔SM 組和氣管SM 組大鼠血清SOD、CAT、GSH-Px 水平逐漸升高，24 h 達(dá)高峰，然后呈遞減趨勢，呈一過性升高，且腹腔SM 組不同時間段的血清抗氧化酶譜的變化更為明顯，提示SM 無論經(jīng)何種途徑染毒均可吸收入血，引起大鼠全身性氧化應(yīng)激反應(yīng)。本結(jié)果與Jafari等［7］報(bào)道的結(jié)果一致，分析可能與大鼠自身通過酶升高產(chǎn)生一種保護(hù)性作用來對抗SM 誘導(dǎo)急性肺損傷有關(guān)，這樣可能有利于肺泡和血液中產(chǎn)生足量的超氧化物陰離子來拮抗氧化應(yīng)激反應(yīng)。因此，筆者認(rèn)為，短時間血清SOD、CAT、GSH-Px 水平的升高，可能是機(jī)體對氧化與抗氧化失衡的一種代償反應(yīng)；出現(xiàn)逐漸遞減，提示這種代償反應(yīng)屬于一過性。一旦出現(xiàn)抗氧化酶和抗氧化劑失代償，將會導(dǎo)致機(jī)體的SM 中毒反應(yīng)。在相應(yīng)的時間段補(bǔ)充外源性抗氧化酶和抗氧化劑治療，有可能成為阻止SM誘導(dǎo)肺損傷發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一［8］。

Tab.1 Changes of serum levels of SOD,CAT and GSH-Px levels in five groups of rats表1 各組大鼠血清SOD、CAT及GSH-Px水平變化（n=8，U/mL，±s）

Tab.1 Changes of serum levels of SOD,CAT and GSH-Px levels in five groups of rats表1 各組大鼠血清SOD、CAT及GSH-Px水平變化（n=8，U/mL，±s）

a與正常組比較，b與腹腔SM組比較，均P＜0.05；腹腔丙二醇組和氣管丙二醇組不做比較；A與6 h比較，B與24 h比較，C與48 h比較，P＜0.05；表3同

組別正常組腹腔SM組氣管SM組腹腔丙二醇組氣管丙二醇組SOD 6 h 261.67±5.76 803.54±13.76a 620.95±7.49ab 263.10±4.71 263.62±3.68 24 h 261.19±8.50 1 326.81±18.23aA 1 060.60±9.30abA 262.36±4.07 263.84±3.70 48 h 262.66±5.41 1 037.24±19.82aAB 891.80±4.57abAB 261.61±4.07 264.98±3.08 72 h 261.93±7.79 839.05±18.07aABC 735.76±11.21abABC 264.05±3.97 262.83±2.17組別正常組腹腔SM組氣管SM組腹腔丙二醇組氣管丙二醇組CAT 6 h 8.80±1.97 30.08±4.78a 23.14±3.22ab 8.50±1.70 8.29±9.64 24 h 8.82±1.79 51.58±7.13aA 42.89±6.44abA 9.53±1.53 9.78±8.41 48 h 8.47±1.77 40.98±2.38aAB 33.67±4.62abAB 9.15±1.17 6.77±8.42 72 h 8.89±1.09 35.97±1.23aABC 28.53±4.45abABC 8.00±1.78 10.15±8.20組別正常組腹腔SM組氣管SM組腹腔丙二醇組氣管丙二醇組GSH-Px 6 h 101.50±8.11 302.92±10.09a 207.23±11.92ab 109.00±10.52 108.30±11.54 24 h 100.78±7.34 518.32±22.02aA 316.38±8.14abA 106.02±9.82 107.57±10.15 48 h 99.28±5.53 280.88±9.04aAB 188.39±8.71abAB 108.80±8.98 107.46±12.23 72 h 100.58±6.29 189.30±2.66aABC 138.24±9.36abABC 117.95±4.51 109.65±9.69

Tab.2 Comparison of SOD,CAT and GSH-Px repeated measures analysis of variance表2 SOD、CAT及GSH-Px重復(fù)測量方差分析比較結(jié)果

Fig.1 The positive expression of CuZn-SOD protein in alveolar septum of rats（×400）圖1 各組大鼠肺泡間隔CuZn-SOD蛋白陽性表達(dá)（×400）

Fig.2 The positive expression of Mn-SOD protein in alveolar septum of rats（×400）圖2 各組大鼠肺泡間隔Mn-SOD蛋白陽性表達(dá)（×400）

Fig.3 The positive expression of PON-1 protein in alveolar septum of rats（×400）圖3 各組大鼠肺泡間隔PON-1蛋白陽性表達(dá)（×400）

Fig.4 The positive expression of ApoA1 protein in alveolar septum of rats（×400）圖4 各組大鼠肺泡間隔ApoA1蛋白陽性表達(dá)（×400）

Tab.3 The positive expression ratios of CuZn-SOD,Mn-SOD,PON-1 and ApoA-1 proteins in the alveolar septum of rats表3 各組大鼠肺泡間隔CuZn-SOD、Mn-SOD、PON-1及ApoA-1蛋白陽性表達(dá)率 （n=8，個/視野，±s）

Tab.3 The positive expression ratios of CuZn-SOD,Mn-SOD,PON-1 and ApoA-1 proteins in the alveolar septum of rats表3 各組大鼠肺泡間隔CuZn-SOD、Mn-SOD、PON-1及ApoA-1蛋白陽性表達(dá)率 （n=8，個/視野，±s）

組別正常組腹腔SM組氣管SM組腹腔丙二醇組氣管丙二醇組CuZn-SOD 6 h 6.40±0.72 45.50±2.79a 34.98±3.57ab 6.20±0.51 5.87±0.47 24 h 5.76±0.84 52.72±1.88aA 46.59±3.03abA 5.61±0.34 5.43±0.87 48 h 6.22±0.88 59.91±3.54aAB 52.81±2.55abAB 5.93±0.70 5.59±0.42 72 h 6.13±0.84 73.27±3.09aABC 64.03±2.20abABC 6.05±0.60 5.40±0.64 Mn-SOD組別正常組腹腔SM組氣管SM組腹腔丙二醇組氣管丙二醇組6 h 26.17±2.50 73.20±4.68a 59.44±8.55ab 27.18±2.00 24.01±3.17 24 h 25.82±2.05 97.98±11.78aA 82.83±11.99abA 24.68±3.19 24.81±3.47 48 h 25.80±2.31 147.34±11.46aAB 113.28±16.17abAB 26.76±2.240 25.42±3.09 72 h 25.99±2.31 180.18±13.84aABC 152.62±17.37abABC 26.14±2.92 26.43±1.92組別正常組腹腔SM組氣管SM組腹腔丙二醇組氣管丙二醇組PON-1 6 h 37.33±4.38 49.16±5.41a 43.44±4.22ab 34.42±3.85 34.87±3.34 24 h 37.00±4.51 69.29±3.96aA 57.10±3.86abA 35.06±3.33 35.23±2.94 48 h 34.86±3.31 81.88±7.60aAB 63.28±3.82abAB 35.27±3.07 33.86±2.91 72 h 36.82±4.02 141.13±6.71aABC 88.76±4.26abABC 35.15±3.54 36.16±3.45組別正常組腹腔SM組氣管SM組腹腔丙二醇組氣管丙二醇組ApoA-1 6 h 3.61±0.32 8.80±0.58a 5.50±0.33ab 3.63±0.35 5.50±0.33 24 h 3.48±0.26 11.60±0.83aA 7.28±0.12abA 3.63±0.27 7.28±0.12 48 h 3.39±0.15 16.74±0.87aAB 8.76±0.30abAB 3.49±0.30 8.76±0.30 72 h 3.57±0.24 22.07±2.85aABC 12.84±0.76abABC 3.69±0.27 12.84±0.76

Tab.4 Comparison of CuZn-SOD,Mn-SOD,PON-1 and ApoA-1 repeated measures analysis of variance表4 CuZn-SOD、Mn-SOD、PON-1及ApoA-1重復(fù)測量方差分析比較結(jié)果

現(xiàn)已證實(shí)，SM可通過ROS和活性氮簇信號通路誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)（細(xì)胞色素C 釋放和ROS 蓄積），由此導(dǎo)致細(xì)胞的損傷［9］。PON-1是一種多功能抗氧化酶，能水解有機(jī)磷酸鹽、芳基酯、內(nèi)酯類、特異性氧化脂。SOD酶家族有3種亞型，包括細(xì)胞質(zhì)的CuZn-SOD、線粒體的Mn-SOD 和細(xì)胞外的（CuZn-SOD）。CuZn-SOD主要在肺纖維上皮高表達(dá)；Mn-SOD主要在呼吸道上皮、肺泡Ⅱ上皮細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞、肺間質(zhì)成纖維細(xì)胞適量表達(dá)［10］。研究表明，SM肺損傷急性期支氣管肺泡灌洗液和肺組織CuZn-SOD、Mn-SOD、PON-1、ApoA-1 mRNA 表達(dá)和蛋白含量增加［11］；而慢性期，其mRNA 表達(dá)和含量則明顯降低［12］。這可能與SM 誘導(dǎo)COPD 或毛細(xì)支氣管炎相關(guān)［13］。上述結(jié)果提示，SM急性肺損傷抗氧化標(biāo)記物升高，機(jī)體的抗氧化能力存在。本研究發(fā)現(xiàn)，SM（1LD50）經(jīng)腹腔和氣管途徑均能誘導(dǎo)肺泡間隔CuZn-SOD、Mn-SOD、PON-1、ApoA-1 蛋白呈高表達(dá)，且腹腔SM 組表達(dá)的陽性細(xì)胞亦明顯增加，提示在急性肺損傷期，肺氧化應(yīng)激反應(yīng)呈線性上升，符合SM 肺損傷的規(guī)律（隨時間延長損傷加重）。這與血清抗氧化酶譜的一過性升高變化不同，說明SM對靶器官肺組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)呈現(xiàn)持續(xù)性狀態(tài)。筆者推測，SM誘導(dǎo)肺損傷氧化應(yīng)激的機(jī)制可能與細(xì)胞內(nèi)GSH和硫氧還蛋白耗竭，線粒體膜改變，線粒體電子轉(zhuǎn)移鏈活性降低，ROS 細(xì)胞內(nèi)蓄積，抗氧化酶減少，氧化相關(guān)通道調(diào)節(jié)和氧化還原內(nèi)環(huán)境維持失調(diào)，氧化與抗氧化平衡紊亂，損傷細(xì)胞膜脂、蛋白、DNA，最終導(dǎo)致肺水腫、肺表面活性物質(zhì)損傷、肺氣腫、“芥子氣肺”有關(guān)［14］。因此筆者認(rèn)為，在SM（1LD50）條件下，經(jīng)腹腔途徑大鼠急性肺損傷氧化應(yīng)激指標(biāo)明顯升高，提示SM誘導(dǎo)肺損傷分子水平的氧化應(yīng)激指標(biāo)差異可能與染毒途徑有關(guān)。

綜上所述，SM 具有獨(dú)特的毒理特性，誘導(dǎo)肺損傷的細(xì)胞和分子機(jī)制復(fù)雜且尚不明確，但氧化應(yīng)激在SM 急性肺損傷機(jī)制中的確發(fā)揮著重要的作用。本研究經(jīng)2 種途徑建立等毒性劑量SM 急性肺損傷動物模型，發(fā)現(xiàn)腹腔SM 組和氣管SM 組急性肺損傷氧化應(yīng)激反應(yīng)存在差異性。同時，SM除經(jīng)氣管可直接導(dǎo)致肺損傷外，還可經(jīng)血路間接導(dǎo)致肺損傷。筆者認(rèn)為，氧化應(yīng)激可能是SM急性肺損傷的重要機(jī)制之一，這可為未來抗氧化劑的研制提供重要的理論依據(jù)。