聶曉博，馬怡坤，趙娜，胡彬，劉姣，劉曉蘭△

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMS）是一種常見的婦科慢性疾病，發(fā)病率約占所有育齡期婦女的10%［1-2］。該病因發(fā)病率高，對(duì)患者的工作、學(xué)習(xí)和生活影響大而引起廣泛關(guān)注。雖然EMS 已成為一個(gè)日益嚴(yán)重的社會(huì)健康問題，但至今仍缺乏明確的診斷生物標(biāo)志物和更有效的治療方法［3］?，F(xiàn)代研究已證實(shí)，腹腔微環(huán)境中慢性炎癥的長期存在可誘導(dǎo)免疫抑制，并促進(jìn)疾病進(jìn)展。抗炎和（或）免疫調(diào)節(jié)也成為治療本病的新方向。莪術(shù)醇又名姜黃環(huán)奧醇，為臨床治療EMS常用中藥莪術(shù)中的主要有效成分，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎等作用。本研究通過觀察莪術(shù)醇的抗EMS作用，從抑制炎癥因子角度對(duì)可能的作用機(jī)制進(jìn)行探討。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD 大鼠，SPF 級(jí)，雌性，體質(zhì)量180～200 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK（冀）2016-0047。飼養(yǎng)于獨(dú)立通風(fēng)籠盒中，恒溫恒濕，喂飼滅菌大鼠飼料，飲用重蒸水。

1.1.2 主要試劑及儀器 莪術(shù)醇（CAS：4871970），純度≥98%購自上海吉至生化科技有限公司；戊酸雌二醇（1 mg/片，批號(hào)：433A）購自德國拜耳；頭孢呋辛鈉（1.5 g/瓶，批號(hào)：18101601）購自深圳立健藥業(yè)有限公司；巨噬細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）試劑盒（貨號(hào)：SXR043）購自上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司；巨噬細(xì)胞游走抑制因子（MIF）試劑盒（貨號(hào)：SXR044）購自森雄科技實(shí)業(yè)有限公司；腫瘤壞死因子α（TNF-α）試劑盒（貨號(hào)：C06PZB）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）試劑盒（貨號(hào)：C09PDB）、白細(xì)胞介素6（IL-6）試劑盒（貨號(hào)：C12PDB）購自北京北方生物技術(shù)研究所；羊抗兔TNF-α（貨號(hào)：ab6671）多克隆抗體購自艾博抗有限公司；FGF-2 和GAPDH 的PCR 引物購自生工生物工程（上海）股份有限公司；Trizol試劑（批號(hào)：K26LG）、SYBR Green Master Mix（批號(hào)：00684721）購自賽默飛世爾科技（美國）有限公司。C1000 Touch thermal cycler PCR 儀購自美國Bio-Rad 公司。酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 模型制備 雌性SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，戊酸雌二醇（0.2 mg/kg體質(zhì)量）灌胃，每日1次，連續(xù)3 d，使各組大鼠動(dòng)情期趨于一致（進(jìn)行陰道涂片，可見大量無核角化細(xì)胞）。末次給戊酸雌二醇后禁食12 h，腹腔注射水合氯醛麻醉，備皮后開腹，結(jié)扎并剪取大鼠左側(cè)子宮約0.5 cm，將子宮于無菌生理鹽水中縱向剪開，以可吸收手術(shù)絲線訂于腹壁上（內(nèi)膜貼向腹壁），關(guān)腹。術(shù)后腹腔注射頭孢呋辛鈉抗感染，每日1次，連續(xù)5 d。4周后，大鼠麻醉再次開腹，觀察子宮內(nèi)膜移植部位，若見到內(nèi)膜生長為透明囊泡，內(nèi)有液體積聚，則為造模成功。另設(shè)假手術(shù)組，僅開腹后剪去子宮周圍脂肪組織，關(guān)腹。

1.2.2 分組及給藥 將造模成功的大鼠利用隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為2組，分別為模型組及莪術(shù)醇組，每組10 只。另設(shè)假手術(shù)組大鼠10 只。各組大鼠每日灌胃給藥（或蒸餾水）10 mL/kg，連續(xù)4周。

1.3 指標(biāo)檢測(cè) 末次給藥后，大鼠禁食12 h，麻醉后開腹，以1 mL蒸餾水沖洗腹腔并收集清洗液。剪取EMS大鼠的異位內(nèi)膜組織，假手術(shù)組大鼠的正常在位子宮組織，部分組織以4%甲醛固定，石蠟包埋，切片后HE染色；剩余組織-80 ℃凍存。

1.3.1 腹腔液中MCP-1、MIF、TNF-α、IL-1β 及IL-6 含量檢測(cè) 以ELISA法檢測(cè)腹腔液中MCP-1和MIF含量；放免法檢測(cè)腹腔液中TNF-α、IL-1β和IL-6含量。

1.3.2 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)異位內(nèi)膜組織中TNF-α 表達(dá) 取包埋異位內(nèi)膜組織的蠟塊，切片，65 ℃烤片，以二甲苯、乙醇梯度脫蠟，水洗，山羊血清封閉15 min，滴加一抗，4 ℃過夜，滴加二抗，顯色，封片后顯微鏡下觀察，以出現(xiàn)明顯棕色或黃色顆粒為陽性信號(hào)。利用Image J 軟件對(duì)顯微鏡下圖片的陽性信號(hào)進(jìn)行分析。

1.3.3 Real-time PCR 檢測(cè)內(nèi)膜組織中FGF-2 mRNA 水平 分別取100 mg 左右的異位內(nèi)膜組織或子宮組織，加入Trizol RNA-solv Reagent 勻漿，取上清，采用Trizol 法提取總RNA，測(cè)定提取液中RNA濃度。以M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后得到cDNA，加入下列引物。FGF-2 引物序列：上游5′- CGAACCGGTACCTGGCTATG - 3′ ，下游5′- ACTGCCCAGTTCGTTTCAGT-3′，擴(kuò)增片段長度162 bp。GAPDH引物序列：上游5′-AGGAAATGATGACCTCCTGA-3′，下游5′-CAGGCATTGTCTGAGAGGCA-3′，擴(kuò)增片段長度605 bp。在熒光定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件：50 ℃2 min；95 ℃2 min，95 ℃15 s，60 ℃15 s，72 ℃1 min，循環(huán)40次。計(jì)算2-ΔΔCt值，表示組織中FGF-2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0分析數(shù)據(jù)，結(jié)果采用±s表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)膜組織的病理觀察 結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠在位子宮內(nèi)膜為單層柱狀上皮（箭頭所示），排列整齊，形態(tài)完整（圖1A）。模型組大鼠異位內(nèi)膜形態(tài)與在位子宮內(nèi)膜相似，也呈柱狀整齊排列（箭頭所示），異位病灶囊泡內(nèi)有中性粒細(xì)胞集聚，周圍組織中血管較為豐富（圖1B）。莪術(shù)醇組大鼠異位內(nèi)膜剝脫，未見柱狀上皮細(xì)胞（圖1C）。

2.2 腹腔液中MCP-1、MIF、TNF-α、IL-1β 和IL-6含量比較 結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組和莪術(shù)醇組大鼠腹腔液中MCP-1、MIF、IL-1β和IL-6含量均顯著升高（P＜0.05），模型組大鼠腹腔液中TNF-α含量也顯著升高（P＜0.05）。與模型組相比，莪術(shù)醇組大鼠腹腔液中MCP-1、MIF、TNF-α、IL-1β和IL-6含量均顯著降低（P＜0.05），見表1。

Fig.1 Pathological observation of ectopic endometrium in rats(hematoxylin-eosin staining，×200)圖1 內(nèi)膜組織的病理觀察（HE染色，×200）

Tab.1 Comparison of contents of MCP-1,MIF,TNF-α,IL-1β and IL-6 in abdominal fluid of rats between three groups表1 各組大鼠腹腔液中MCP-1、MIF、TNF-α、IL-1β和IL-6含量比較（n=10，±s）

Tab.1 Comparison of contents of MCP-1,MIF,TNF-α,IL-1β and IL-6 in abdominal fluid of rats between three groups表1 各組大鼠腹腔液中MCP-1、MIF、TNF-α、IL-1β和IL-6含量比較（n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a與假手術(shù)組比較，b與模型組比較，P＜0.05

組別假手術(shù)組模型組莪術(shù)醇組F MCP-1（ng/L）320.426±57.031 1 166.426±258.312a 666.602±370.753ab 24.984＊＊MIF（μg/L）92.966±18.752 132.670±8.985a 107.950±13.357ab 20.847＊＊TNF-α（μg/L）0.907±0.195 1.307±0.317a 0.958±0.157b 7.560＊＊IL-1β（μg/L）0.148±0.005 0.198±0.017a 0.174±0.017ab 24.264＊＊IL-6（μg/L）89.939±10.044 109.703±4.065a 102.579±5.828ab 20.409＊＊

2.3 各組異位內(nèi)膜組織中TNF-α 及FGF-2 mRNA表達(dá)比較 結(jié)果顯示，與假手術(shù)組大鼠在位子宮相比，模型組和莪術(shù)醇組大鼠異位內(nèi)膜組織TNF-α及FGF-2 mRNA 表達(dá)均明顯增強(qiáng)（P＜0.05）。與模型組相比，莪術(shù)醇組大鼠異位內(nèi)膜組織TNF-α 及FGF-2 mRNA表達(dá)明顯減弱（P＜0.05），見表2、圖2。

Tab.2 Comparison of TNF-α and FGF-2 mRNA expression in endometrial tissues of rats between three groups表2 各組大鼠內(nèi)膜組織中TNF-α和FGF-2 mRNA表達(dá)量比較（±s）

Tab.2 Comparison of TNF-α and FGF-2 mRNA expression in endometrial tissues of rats between three groups表2 各組大鼠內(nèi)膜組織中TNF-α和FGF-2 mRNA表達(dá)量比較（±s）

＊＊P＜0.01；a與假手術(shù)組比較，b與模型組比較，P＜0.05

組別假手術(shù)組模型組莪術(shù)醇組F n3 3 3 TNF-α 0.213±0.013 0.290±0.006a 0.250±0.013ab 36.722＊＊FGF-2 mRNA 1.039±0.410 5.249±0.772a 4.054±1.169ab 51.411＊＊

3 討論

3.1 局部炎癥反應(yīng)在EMS 發(fā)病過程中的作用 近年來，EMS的發(fā)病率逐年升高，因常伴有慢性盆腔疼痛、粘連和不孕，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生殖能力，引起婦科界的廣泛關(guān)注。本病雖已研究多年，但其作用機(jī)制仍然不清。目前已有許多關(guān)于發(fā)病機(jī)制的理論，其中最為人接受的是Sampson 的月經(jīng)逆行理論［4］。Sampson認(rèn)為，子宮內(nèi)膜細(xì)胞在月經(jīng)期間通過輸卵管運(yùn)輸，植入腹膜表面，并異位種植、生長為病灶。大多數(shù)女性經(jīng)期存在經(jīng)血逆流，但僅有10%發(fā)展為EMS的原因值得深思。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，在EMS 發(fā)病的眾多機(jī)制中，局部炎癥反應(yīng)和免疫異?？赡馨l(fā)揮了重要作用［5］。多種證據(jù)表明，這些子宮內(nèi)膜植入物促進(jìn)慢性炎癥局部微環(huán)境及全身免疫的改變，進(jìn)而引起粘連、血管生成和增殖的發(fā)生［6-8］。腹水中的免疫細(xì)胞由巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和肥大細(xì)胞組成［2］。巨噬細(xì)胞是先天免疫系統(tǒng)中的主要免疫細(xì)胞，是EMS局部炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞，如MCP-1、FGF、纖溶酶原激活劑、黏附分子、細(xì)胞因子和環(huán)氧合酶的產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用。其中，MCP-1 是單核吞噬細(xì)胞的化學(xué)引誘劑，由白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、正常子宮內(nèi)膜組織和子宮內(nèi)膜異位組織分泌。MCP-1 結(jié)合趨化因子受體吸引單核細(xì)胞到靶組織，促進(jìn)單核細(xì)胞從外周血向腹腔遷移，轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞，并分泌多種炎性細(xì)胞因子，導(dǎo)致EMS常見的局部腹膜炎癥［9］。在活化的巨噬細(xì)胞分泌的眾多細(xì)胞因子中，TNF-α在EMS疾病進(jìn)程中發(fā)揮著重要的作用，除進(jìn)一步誘導(dǎo)其他炎性細(xì)胞因子的釋放，促進(jìn)病灶局部的炎性細(xì)胞浸潤外，還是血管活性因子之一，誘導(dǎo)異位內(nèi)膜細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的增殖及血管新生。巨噬細(xì)胞所分泌的IL-1 和IL-6 均為機(jī)體炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)，可以誘導(dǎo)T 淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的分化，具有免疫調(diào)節(jié)作用。其中IL-1家族細(xì)胞因子可能是導(dǎo)致EMS 患者腹腔免疫功能異常的因子。異常異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞黏附、種植和增殖的特性均與IL-1 水平異常升高有關(guān)。腹腔液中IL-6含量異常增多時(shí)，能增強(qiáng)單核細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞的功能，加劇腹腔粘連，促進(jìn)了EMS 的發(fā)生發(fā)展［10］。

Fig.2 Expression of TNF-α in uterine tissues of rats in three groups(immunohistochemical staining,×200)圖2 各組大鼠內(nèi)膜組織中TNF-α表達(dá)情況（免疫組化染色，×200）

成纖維細(xì)胞生長因子家族（Fibroblast growth factors，F(xiàn)GFs）是一類多肽生長因子，在人體中發(fā)揮著多種功能，通過與其受體結(jié)合調(diào)控胚胎發(fā)育并促進(jìn)多種器官修復(fù)。在FGFs 中，基礎(chǔ)FGF 又稱FGF-2，在炎癥反應(yīng)和血管新生、修復(fù)與再生過程中均發(fā)揮著重要作用。一方面，F(xiàn)GF-2 同樣參與了對(duì)巨噬細(xì)胞的吸引，使巨噬細(xì)胞在異位病灶處聚集，在促使各種相關(guān)炎癥因子和生長因子分泌的同時(shí)，又進(jìn)一步刺激異位的子宮內(nèi)膜細(xì)胞合成并釋放FGF-2，加劇腹腔病灶局部的炎癥反應(yīng)。另一方面，F(xiàn)GF-2 還是一種血管再生的調(diào)控因子，尤其是在炎癥反應(yīng)過程中促進(jìn)相關(guān)的病理血管生成。FGF-2通過刺激子宮內(nèi)膜粘連、細(xì)胞增殖以及血管新生，參與EMS 的發(fā)生和發(fā)展［11］。

以上研究證實(shí)，慢性炎癥及其誘導(dǎo)的免疫抑制在EMS 發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用?，F(xiàn)代臨床研究也證實(shí)，在EMS 患者腹腔局部微環(huán)境中FGF-2、MCP-1、MIF-2、IL-1β、IL-6 和TNF-α 含量顯著升高［3］。本研究采用自體子宮移植法復(fù)制大鼠EMS模型，發(fā)現(xiàn)腹腔液中MCP-1、MIF-2、IL-1β、IL-6 和TNF-α含量升高，同時(shí)異位子宮內(nèi)膜組織中TNF-α表達(dá)和FGF-2 mRNA 表達(dá)水平均明顯高于假手術(shù)組，這些異常與EMS患者的臨床改變相一致。

3.2 莪術(shù)醇通過抑制炎癥因子對(duì)EMS 的改善作用 EMS 不僅發(fā)病機(jī)制不清，臨床也缺乏安全有效的治療用藥。西醫(yī)多以激素類藥物進(jìn)行治療，但此類藥物存在不良反應(yīng)，患者耐受性差。近年來，中藥治療EMS 因?yàn)榀熜э@著且不良反應(yīng)輕微受到廣泛關(guān)注。EMS 屬中醫(yī)痛經(jīng)、不孕、癥瘕范疇，其病因多為瘀血阻滯，活血化瘀為常用治療法則。莪術(shù)為常用活血化瘀藥，善破血中之結(jié)，為臨床治療EMS 方劑中的主要藥物?，F(xiàn)代研究證實(shí)，莪術(shù)中主要活性成分莪術(shù)醇主要具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗血小板聚集、抗血栓形成等作用［12］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)莪術(shù)提取液能通過抑制JAK2/STAT3 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，拮抗EMS 的發(fā)展進(jìn)程，甚至使異位內(nèi)膜組織萎縮。筆者推測(cè)，莪術(shù)醇對(duì)EMS應(yīng)該具有改善作用，但目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道。鑒于EMS、炎癥和免疫之間的關(guān)系已被公認(rèn)［13］，本研究從對(duì)炎癥因子影響的角度對(duì)莪術(shù)醇治療EMS 的效果及可能的機(jī)制進(jìn)行探討。本研究顯示，莪術(shù)醇能使EMS模型大鼠腹腔液中MCP-1、MIF、TNF-α、IL-1β、IL-6 含量顯著降低，顯著下調(diào)異位內(nèi)膜組織中TNF-α 表達(dá)和FGF-2 mRNA 表達(dá)，具有明顯抑制腹腔微環(huán)境中炎癥反應(yīng)作用。