阮洪訓，秦曉寧，黃煒，李猛，趙晶，任鵬濤，郝英豪，林林

近年來，結(jié)直腸癌在全球的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢，是常見的消化道腫瘤之一，威脅著人類的健康。2014 年WHO 在《世界癌癥報告》中公布，結(jié)直腸癌發(fā)病率位居第3 位，死亡率位居第4位［1］。在我國，結(jié)直腸癌發(fā)病率僅次于肺癌和胃癌位居第3 位，死亡率僅次于肺癌、肝癌、胃癌和食管癌位居第5位［2］。近年來，結(jié)直腸癌的危險因素及其發(fā)生發(fā)展機制已引起人們的高度重視。有研究報道轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）和白細胞介素-22（IL-22）與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，并在結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用，TGF-β1可能通過間接或直接刺激腫瘤血管形成進而促進腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移［3］；IL-22可能通過調(diào)控信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）信號通路進而促進腫瘤細胞的增殖和遷移［4］。本研究以結(jié)直腸癌HCT116 細胞株為研究對象，探討TGF-β1對結(jié)直腸癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移和IL-22蛋白表達的影響及其作用機制，為結(jié)直腸癌的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料 結(jié)直腸癌HCT116 細胞株購自上海中喬新舟生物科技有限公司；TGF-β1 人重組蛋白購自北京義翹神州生物技術(shù)有限公司；IL-22 抗體、TGF-β1 抗體、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）抗體購自英國Abcam 公司；STAT3 抗體購自美國Antibody revolution 公司；內(nèi)參GAPDH 抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；CCK-8 試劑盒購自日本Dojindo Laboratories 公司；Transwell 小室購自美國Corning 公司；Matrigel 基質(zhì)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；1%結(jié)晶紫染液購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 細胞培養(yǎng)條件：用含90%DMEM 高糖+10%FBS+1%雙抗的培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次。實驗用細胞均處于對數(shù)生長期。

1.2.2 CCK-8法測定HCT116細胞增殖情況 通過倒置顯微鏡觀察HCT116 細胞生長狀態(tài)并放置超凈工作臺內(nèi)，經(jīng)過無菌PBS沖洗、0.25%胰酶消化、離心，按照35個孔計算細胞數(shù)量，接種于96 孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL約5 000 個細胞，37 ℃、5%CO2孵育過夜；每個板分別設置對照孔及5、10、15、20、30、50 μg/L TGF-β1 處理孔，每組設定5 個復孔，37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱孵育24、48 h；每孔加入10 μL CCK-8 溶液，37 ℃孵育3 h；采用酶標儀檢測450 nm 波長下光密度（OD）值。

1.2.3 實驗分組 將實驗對象分為對照組（DMEM培養(yǎng)液）、TGF-β1處理組（DMEM+10 μg/L TGF-β1），各組加藥處理48 h后，收集細胞進行檢測。

1.2.4 Transwell 檢測HCT116 細胞侵襲、遷移能力 在Transwell 侵襲小室底部鋪一層Matrigel 基質(zhì)膠，放入24 孔培養(yǎng)板中，上室中加入5×104個細胞稀釋于200 μL無血清培養(yǎng)基中，下室加入600 μL 含10%血清的完全培養(yǎng)基；放入37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育48 h，小心用棉簽擦拭基質(zhì)膠和上室細胞，使用結(jié)晶紫染色下室細胞，顯微鏡下隨機取中央及四周5 個400 倍視野，觀察并計數(shù)穿透Transwell 膜的細胞數(shù)，實驗重復3 次。Transwell 遷移實驗除小室底部不需鋪Matrigel基質(zhì)膠外，其他實驗方法同Transwell侵襲實驗，實驗亦重復3次。

1.2.5 劃痕實驗檢測HCT116細胞遷移能力 取對數(shù)生長期HCT116 細胞，消化離心（1 000 r/min，5 min），重懸至2×105mL，將細胞接種于6孔板中，培養(yǎng)過夜后用200 μL槍頭在培養(yǎng)板孔內(nèi)劃橫線，PBS沖洗3次，加入無血清培養(yǎng)基和10 μg/L TGF-β1，每組設置3個復孔，培養(yǎng)48 h后在顯微鏡下觀察拍照，使用Image-pro Plus 6.0軟件分別測量處理前和處理后細胞劃痕邊界的距離，細胞遷移率=（0 h劃痕寬度-48 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。

1.2.6 RT-PCR 檢測HCT116 細胞中TGF-β1、IL-22 mRNA表達 收集實驗組和對照組細胞，采用Trizol 一步法從HCT116 細胞中提取總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μL 作為模板，以GAPDH 為內(nèi)參進行PCR 擴增。TGF-β1 和IL-22 部分片段的引物采用Premier 5.0 軟件進行設計。GAPDH 引物：上游5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游5′-AGCCAGTTGTAGGCTCATCCA-3′，擴增片段452 bp。TGF-β1 引物：上游5′-GGACACCAACTATTGCTTCAG-3′ ，下游5′-TCCAGGCTCCAAATGTAGG-3′，擴增片段160 bp。IL-22 引物：上游5′-AGCTCCAGGTCAACCGCACCTA-3′，下游5′-GCCCAGGTGGGAACGCAAATCA-3′，擴增片段124 bp。反應條件：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃復性30 s，72 ℃延伸60 s，共40個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃、-20 ℃保存；1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結(jié)果。應用Image J 圖像分析軟件計算各樣本條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比值。

1.2.7 免疫細胞化學染色檢測HCT116 細胞中TGF-β1、IL-22、E-cadherin 蛋白表達 各組細胞爬片，PBS 清洗3 次，4%多聚甲醛固定10 min，Triton X-100孵育20 min，3%過氧化氫溶液室溫孵育15 min，血清工作液封閉30 min，一抗孵育4 ℃過夜，PBS代替一抗作陰性對照，二抗孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復染，封片。陽性反應為棕黃色或黃色顆粒。采用Image-ProPlus 6.0 圖像分析軟件，檢測TGF-β1、IL-22 和E-cadherin 陽性細胞平均吸光度（A）值，以間接反映TGF-β1、IL-22和E-cadherin蛋白的表達量，并取其均值。

1.2.8 Western blot 檢測HCT116 細胞中TGF-β1、IL-22、STAT3、E-cadherin 蛋白表達 細胞培養(yǎng)皿棄上清，PBS 清洗4 遍，刮取細胞；加入蛋白裂解液，震蕩離心30 s，冰上靜置5 min，重復4 次，12 000 r/min 離心15 min 后取上清液，BCA 法測定總蛋白濃度。100 ℃、10 min 煮蛋白變性、電泳、轉(zhuǎn)膜，10%脫脂奶粉封閉1.5 h，加一抗4 ℃過夜，次日復溫1 h，加二抗37 ℃震蕩孵育1 h，TBST漂洗3次，加入超敏ECL化學發(fā)光劑顯影。以GAPDH 為內(nèi)參，采用Image J 圖像處理系統(tǒng)計算各樣本條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比值。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0 進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，2組間樣本均數(shù)比較采用t檢驗，多組間樣本均數(shù)的比較采用方差分析。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度TGF-β1 對HCT116 細胞增殖情況的影響 結(jié)果顯示，不同濃度的TGF-β1 作用于HCT116 細胞24、48 h 后，各處理組OD 值差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表1。

Tab.1 Effects of different concentrations of TGF-β1 on proliferation of HCT116 cells表1 不同TGF-β1濃度對HCT116細胞增殖情況的影響（±s）

Tab.1 Effects of different concentrations of TGF-β1 on proliferation of HCT116 cells表1 不同TGF-β1濃度對HCT116細胞增殖情況的影響（±s）

均P＞0.05

TGF-β1濃度0 μg/L 5 μg/L 10 μg/L 15 μg/L 20 μg/L 30 μg/L 50 μg/L F n5 5 5 5 5 5 5 OD值24 h 0.598±0.012 0.590±0.023 0.587±0.032 0.570±0.008 0.568±0.009 0.589±0.024 0.553±0.019 1.916 48 h 0.606±0.013 0.600±0.019 0.599±0.033 0.578±0.007 0.579±0.012 0.598±0.022 0.566±0.018 1.819

2.2 Transwell 實驗檢測TGF-β1 對HCT116 細胞侵襲、遷移能力的影響 侵襲實驗結(jié)果顯示，TGF-β1處理組穿過Transwell小室的細胞數(shù)多于對照組（個/視野：162.00±18.33vs.98.00±13.98，n=5，t=6.207，P＜0.01），見圖1。遷移實驗結(jié)果顯示，TGF-β1處理組穿過Transwell 小室的細胞數(shù)多于對照組（個/視野：232.40±25.62vs.99.40±12.78，n=5，t=10.388，P＜0.01），見圖2。

Fig.1 Effects of 10 μg/L TGF-β1 on invasion of HCT116 cells by Transwell invasion assay(×400)圖1 Transwell侵襲實驗檢測10 μg/L TGF-β1對HCT116細胞侵襲情況的影響（×400）

Fig.2 Effects of 10 μg/L TGF-β1 on migration of HCT116 cells by Transwell migration assay(×400)圖2 Transwell遷移實驗檢測10 μg/L TGF-β1對HCT116細胞遷移情況的影響（×400）

2.3 劃痕實驗檢測TGF-β1 對HCT116 細胞遷移能力的影響 結(jié)果顯示，0 h 時對照組與TGF-β1 處理組劃痕距離差異無統(tǒng)計學意義［（759.897±15.612）μmvs.（735.192±4.318）μm，n=3，t=2.642，P＞0.05］。48 h 時對照組劃痕距離大于TGF-β1 處理組［（580.625±4.920）μmvs.（403.688±7.587）μm，t=33.891，P＜0.01］，TGF-β1 處理組細胞遷移率明顯高于對照組（45.09%±0.72%vs.23.58%±1.06%，t=28.978，P＜0.01），表明TGF-β1促進HCT116細胞遷移能力，見圖3。

2.4 RT-PCR檢測TGF-β1對HCT116細胞TGF-β1、IL-22 mRNA 表達情況的影響 結(jié)果顯示，TGF-β1處理組TGF-β1 mRNA 表達水平明顯高于對照組（P＜0.01），而IL-22 mRNA 表達水平明顯低于對照組（P＜0.01），見表2、圖4。

2.5 免疫細胞化學染色檢測TGF-β1 對HCT116 細胞TGF-β1、IL-22、E-cadherin 蛋白表達的影響 結(jié)果顯示，TGF-β1處理組TGF-β1蛋白表達水平明顯高于對照組（P＜0.01），而IL-22、E-cadherin 蛋白表達水平明顯低于對照組（均P＜0.05），見表3、圖5。

2.6 Western blot 法檢測TGF-β1 對HCT116 細胞TGF-β1、IL-22、STAT3、E-cadherin 蛋白表達的影響 結(jié)果顯示，TGF-β1處理組TGF-β1、STAT3蛋白表達水平明顯高于對照組，而IL-22、E-cadherin 蛋白表達水平明顯低于對照組（均P＜0.01），見表4、圖6。

Fig.3 Effects of 10 μg/L TGF-β1 on migration of HCT116 cells by scarification text(×200)圖3 劃痕實驗檢測10 μg/L TGF-β1對HCT116細胞遷移情況的影響（×200）

Tab.2 The expressions of TGF-β1and IL-22 mRNA in cells detected by RT-PCR表2 RT-PCR檢測細胞中TGF-β1、IL-22 mRNA表達情況（±s）

Tab.2 The expressions of TGF-β1and IL-22 mRNA in cells detected by RT-PCR表2 RT-PCR檢測細胞中TGF-β1、IL-22 mRNA表達情況（±s）

＊＊P＜0.01

組別對照組TGF-β1處理組t n3 3 TGF-β1 0.780±0.037 0.990±0.021 8.519＊＊IL-22 0.972±0.005 0.836±0.008 24.709＊＊

Fig.4 Effects of 10 μg/L TGF-β1 on expressions of TGF-β1 and IL-22 mRNA in HCT116 cells detected by RT-PCR圖4 RT-PCR檢測10 μg/LTGF-β1對HCT116細胞TGF-β1、IL-22 mRNA表達情況的影響

3 討論

3.1 TGF-β1、IL-22對結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展影響的研究現(xiàn)狀 近年來，隨著人們生活水平的改善和飲食結(jié)構(gòu)的變化，我國結(jié)直腸癌死亡率僅次于肺癌、肝癌、胃癌和食管癌，位居第5 位，發(fā)病率呈逐年上升趨勢［5］，已嚴重威脅到人們的健康。結(jié)直腸癌的發(fā)病機制較為復雜，且呈慢性階段性發(fā)展，可能是由多種因子共同作用的結(jié)果［6-7］。在影響結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的因子中，TGF-β1、IL-22 尤其受到人們的關(guān)注。結(jié)直腸癌細胞本身具有分泌TGF-β1 的功能，TGF-β1與結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，已有研究證實TGF-β1 與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在腫瘤的增殖、浸潤、遷移和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著巨大的作用［8-9］。IL-22作為腫瘤微環(huán)境中的細胞因子，與腫瘤細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等重要過程的調(diào)控密切相關(guān)［10-11］。有研究發(fā)現(xiàn)IL-22 可能參與結(jié)腸癌的發(fā)展過程，通過激活STAT和MAPK信號通路，促進腫瘤細胞的增殖和遷移［12］。因此，抑制腫瘤增殖和促進凋亡成為治療結(jié)直腸癌的關(guān)鍵。

Tab.3 Expressions of TGF-β1,IL-22 and E-cadherin protein in cells detected by immunocytochemical assay表3 免疫細胞化學檢測細胞中TGF-β1、IL-22、E-cadherin蛋白表達情況（A，±s）

Tab.3 Expressions of TGF-β1,IL-22 and E-cadherin protein in cells detected by immunocytochemical assay表3 免疫細胞化學檢測細胞中TGF-β1、IL-22、E-cadherin蛋白表達情況（A，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別對照組TGF-β1處理組t n3 3 TGF-β1 0.202±0.019 0.513±0.027 16.592＊＊IL-22 0.306±0.019 0.126±0.017 12.231＊＊E-cadherin 0.205±0.026 0.113±0.031 3.987＊

Fig.5 Effects of 10 μg/L TGF-β1 on expressions of TGF-β1,IL-22 and E-cadherin protein in HCT116 cells detected by immunocytochemical assay(×400)圖5 免疫細胞化學染色檢測10 μg/L TGF-β1對HCT116細胞TGF-β1、IL-22、E-cadherin蛋白表達的影響（×400）

Tab.4 Expressions of TGF-β1,IL-22,STAT3 and E-cadherin protein in cells detected by Western blot assay表4 Western blot 法檢測細胞中TGF-β1、IL-22、STAT3、E-cadherin蛋白表達情況（n=3，±s）

Tab.4 Expressions of TGF-β1,IL-22,STAT3 and E-cadherin protein in cells detected by Western blot assay表4 Western blot 法檢測細胞中TGF-β1、IL-22、STAT3、E-cadherin蛋白表達情況（n=3，±s）

＊＊P＜0.01

組別對照組TGF-β1處理組t TGF-β1 0.797±0.020 0.926±0.042 4.809＊＊IL-22 0.807±0.031 0.708±0.017 4.841＊＊STAT3 0.930±0.015 1.003±0.013 6.490＊＊E-cadherin 0.980±0.006 0.689±0.026 18.642＊＊

Fig.6 Effects of 10 μg/LTGF-β1 on the expressions of TGF-β1,IL-22,STAT3 and E-cadherin protein in HCT116 cells detected by Western blot assay圖6 Western blot 法檢測10 μg/L TGF-β1對HCT116細胞TGF-β1、IL-22、STAT3、E-cadherin蛋白表達的影響

3.2 TGF-β1 對結(jié)直腸癌HCT116 細胞增殖、侵襲、遷移的影響 目前TGF-β1對腫瘤影響的研究存在很大分歧。有研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1可以抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖和促進凋亡，進而抑制結(jié)直腸癌的發(fā)展［13-14］。也有研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1可明顯促進結(jié)直腸癌細胞的增殖，進而促進其發(fā)展［3］。人們普遍認為，TGF-β1對腫瘤的作用具有雙面性：在惡性腫瘤發(fā)展的早期，TGF-β1作為抑癌因子抑制腫瘤細胞的增殖和促進腫瘤的凋亡；在腫瘤發(fā)展的晚期，TGF-β1 作為促癌因子促進腫瘤細胞的侵襲和遷移［15］。但TGF-β1 從抑癌作用到促癌作用的轉(zhuǎn)變機制尚不完全清楚。本研究采用CCK-8法測定不同濃度TGF-β1 對HCT116 細胞增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同濃度TGF-β1刺激HCT116細胞24、48 h后，HCT116細胞增殖差異不明顯，提示TGF-β1可能對HCT116細胞增殖影響不明顯。此外，本研究將10 μg/L TGF-β1刺激HCT116 細胞48 h 后，采用Transwell 侵襲遷移實驗和劃痕實驗測定TGF-β1 對HCT116 細胞侵襲和遷移能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TGF-β1 處理組HCT116細胞侵襲和遷移能力明顯高于對照組，表明TGF-β1 可能促進結(jié)直腸癌HCT116 細胞的侵襲和遷移，進而促進結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展，這與Tan等［16-17］的研究結(jié)果一致。

3.3 TGF-β1 對結(jié)直腸癌HCT116 細胞中IL-22 表達的影響 近年來研究發(fā)現(xiàn)，大腸癌患者血清和組織中TGF-β1、IL-22 水平明顯高于正常人，兩者與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［3-4］。本研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1 處理組TGF-β1 mRNA 和蛋白表達水平明顯高于對照組，但IL-22 mRNA 和蛋白表達水平明顯低于對照組。此外，STAT3 作為TGF-β1 和IL-22通路共同的下游分子，TGF-β1 處理組STAT3 蛋白表達水平明顯高于對照組，提示TGF-β1 可能與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，結(jié)直腸癌HCT116 細胞中TGF-β1可能抑制IL-22蛋白表達，但沒有抑制IL-22 通路下游因子STAT3 蛋白表達，TGF-β1 可能通過其他信號通路調(diào)控STAT3蛋白表達水平。Rutz等［18］研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1通過轉(zhuǎn)錄因子c-Maf可抑制Th17 細胞中IL-22 蛋白的表達，而在結(jié)直腸癌細胞中尚鮮見報道TGF-β1 和IL-22、STAT3 蛋白表達的關(guān)系。此外，本研究雖然發(fā)現(xiàn)TGF-β1能抑制IL-22蛋白的表達，但并沒有體現(xiàn)TGF-β/Smads 經(jīng)典信號通路及下游因子在其中的作用，今后將進一步深入研究。

綜上所述，TGF-β1可能促進HCT116細胞侵襲和遷移，但對HCT116 細胞的增殖影響不明顯。結(jié)直腸癌HCT116細胞中TGF-β1可能抑制IL-22蛋白的表達，但沒有抑制IL-22 通路下游因子STAT3 蛋白表達，這為如何防治結(jié)直腸腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移提供了一個新思考。