蔡僮，許修穎，方文

在發(fā)展中國家，宮頸癌是女性癌癥致死的第三大原因，2018 年全球大約有569 847 例宮頸癌新發(fā)病例及311 365例死亡病例［1］，而且晚期宮頸癌轉(zhuǎn)移患者預(yù)后較差，中位生存期僅為8～13個月［2］。在傳統(tǒng)治療手段效果不理想的情況下，利用當(dāng)前技術(shù)尋找與宮頸癌相關(guān)的新型分子標(biāo)志物及治療靶點變得迫在眉睫。核內(nèi)不均一核糖核蛋白A2/B1（Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2 / B1，hnRNP A2/B1）是一種RNA結(jié)合蛋白，由A2及B1兩種蛋白以適宜比例相結(jié)合，在細(xì)胞的胞質(zhì)和胞核中均可表達(dá)，但是在不同組織和不同類型細(xì)胞中表達(dá)水平不同［3］。作為一種新論證的致癌分子，hnRNP A2/B1在乳腺癌［4］、非小細(xì)胞肺癌［5］及食管鱗狀細(xì)胞癌[6]中均呈過表達(dá)狀態(tài)，且hnRNP A2/B1作為介導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤侵襲的關(guān)鍵分子，為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療提供了潛在的干預(yù)位點［7］。本課題組前期實驗也證實了在宮頸癌CaSki 細(xì)胞中，洛鉑處理細(xì)胞后hnRNP A2/B1 表達(dá)下降，凋亡增加［8］。本研究通過沉默hnRNP A2/B1基因后，探討宮頸癌細(xì)胞部分生物學(xué)的變化及其可能的相關(guān)機(jī)制，為臨床對宮頸癌的治療尋找可能的基因位點及實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 宮頸癌CaSki 細(xì)胞株購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫；胎牛血清購自美國Gibco公司；RPMI-1640培養(yǎng)液購自美國Hyclone 公司；流式凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物；SYBR Green PCR Master Mix 購自美國Biosystems 公司；Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）檢測試劑盒、苯甲基磺酰氟（Phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）、RIPA裂解液及BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司；磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffer saline，PBS）、二甲基亞砜（Dimethylsulphoxide，DMSO）購自北京索萊寶生物公司；兔抗hnRNP A2/B1抗體購自美國Invitrogen 公司，SDS-PAGE 凝膠試劑盒、兔抗Bcl-2 和兔抗Bax 購自萬類生物公司，兔抗βactin購自博奧森生物公司，辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒和PVDF膜購自美國MILLIPORE公司。

1.2 方法

1.2.1 沉默宮頸癌CaSki細(xì)胞中hnRNP A2/B1基因 慢病毒載體介導(dǎo)shRNA轉(zhuǎn)染沉默宮頸癌CaSki細(xì)胞中hnRNP A2/B1已由課題組前期完成［9-10］。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 根據(jù)課題組前期已構(gòu)建好的基因沉默細(xì)胞，分為未沉默hnRNP A2/B1的空白組（CaSki組）、轉(zhuǎn)染陰性序列的陰性對照組（CaSki-NC組）、轉(zhuǎn)染陽性hnRNP A2/B1干擾序列的實驗組（CaSki-shRNA組）。3組細(xì)胞均用含有10%胎牛血清、1%青/鏈霉素、1%L-谷氨酰胺的RPMI-1640培養(yǎng)液于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 實時熒光定量PCR（Quantitative real-time PCR，qRTPCR）檢測hnRNP A2/B1mRNA表達(dá)情況 采用Trizol試劑盒提取RNA 并根據(jù)試劑說明步驟取1 μg 總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，依據(jù)SYBR Green PCR Master Mix 試劑盒說明書取2 μL cDNA 進(jìn)行實時熒光定量反應(yīng)。qRT-PCR 引物：β-actin，上游5′- GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3′，下游5′- ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3′；hnRNP A2/B1，上游5′-GATGGCAGAGAACGGTGTGAAG-3′，下游5′-AGGCATAGGTATTGGCAACTGC-3′。反應(yīng)條件：95 ℃10 min；95 ℃15 s，60 ℃1 min；40次循環(huán)，結(jié)果以2-ΔΔCt值表示。

1.2.4 MTT實驗檢測細(xì)胞增殖情況 取對數(shù)生長期的CaSki組、CaSki-NC組及CaSki-shRNA組細(xì)胞用0.25%的胰酶消化懸浮后稀釋至5×104/mL，以每孔200 μL接種至96孔板中，搖勻后放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱，每組細(xì)胞又分為培養(yǎng)12 h、24 h及48 h亞組，相應(yīng)時點后每孔加入含10 μL MTT 的培養(yǎng)液繼續(xù)于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，而后去除MTT 培養(yǎng)液并每孔加入150 μL 的DMSO 充分震蕩反應(yīng)后于酶標(biāo)儀上檢測490 nm波長處光密度（OD）值。

1.2.5 平板克隆實驗檢測細(xì)胞增殖能力 以0.25%胰酶消化3組對數(shù)生長期細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，以每孔500 個細(xì)胞接種至6孔板中并用RPMI-1640完全培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)2周。去除上清培養(yǎng)液并用PBS清洗2次后用4%的多聚甲醛固定15 min，龍膽紫染液染色30 min，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥，在顯微鏡（低倍鏡）計數(shù)大于50 個細(xì)胞的克隆數(shù)?？寺⌒纬陕?克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.6 流式細(xì)胞檢測細(xì)胞凋亡 將各組對數(shù)生長期細(xì)胞消化稀釋至5×104/mL 并接種至6 孔板過夜，取5×105個細(xì)胞并用緩沖液懸浮成單細(xì)胞懸液，之后取5 μL Annexin APC 和5 μL PI 染液避光染色15 min，以流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡變化。

1.2.7 蛋白印跡（Western blot）檢測hnRNP A2/B1、Bax、Bcl-2的表達(dá) 用含有1%PMSF的RIPA裂解液于冰上裂解各組細(xì)胞并在預(yù)冷的4 ℃離心機(jī)上以12 000 r/min 離心20 min，收集上清蛋白液分裝保存于-80 ℃。用BCA 法測定提取的蛋白濃度，SDS-PAGE 凝膠電泳分離目的蛋白并將蛋白轉(zhuǎn)入PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉液封閉PVDF 膜2 h。4 ℃過夜孵育兔抗β-actin（1∶6 000）、兔抗Bcl-2（1∶500）、兔抗Bax（1∶500），兔抗hnRNP A2/B1（1∶1 000），次日TBST 洗膜3 次，將PVDF膜在山羊抗兔二抗（1∶90 000）中室溫孵育1 h。ECL顯影并曝光，Image J 1.51軟件分析灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較應(yīng)用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 驗證hnRNP A2/B1沉默效率 與CaSki 組比較，CaSki-shRNA 組hnRNP A2/B1的mRNA 及蛋白表達(dá)水平均明顯減低（P＜0.01），而CaSki 組和CaSki-NC組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖1、表1。

Fig.1 Expression of hnRNP A2/B1 protein after transfection圖1 轉(zhuǎn)染后hnRNP A2/B1蛋白表達(dá)情況

Tab.1 Relative expression levels of hnRNP A2/B1 after transfection in three groups表1 轉(zhuǎn)染后3組hnRNP A2/B1 mRNA和蛋白相對表達(dá)量（±s）

Tab.1 Relative expression levels of hnRNP A2/B1 after transfection in three groups表1 轉(zhuǎn)染后3組hnRNP A2/B1 mRNA和蛋白相對表達(dá)量（±s）

＊＊P＜0.01；a與CaSki組比較，b與CaSki-NC組比較，均P＜0.01

組別CaSki組CaSki-NC組CaSki-shRNA組F n3 3 3 hnRNP A2/B1 mRNA 1.00±0.04 0.96±0.07 0.44±0.02ab 124.342＊＊hnRNP A2/B1 蛋白0.69±0.08 0.67±0.03 0.42±0.05ab 19.759＊＊

2.2 沉默hnRNP A2/B1對CaSki 細(xì)胞增殖的影響 MTT 法檢測結(jié)果顯示，在48 h 時間點，與CaSki組相比，CaSki-shRNA 組OD值明顯降低（P＜0.01），細(xì)胞增殖能力減弱，而CaSki 組和CaSki-NC 組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

Tab.2 Comparison of CaSki cell proliferation between three groups表2 各組CaSki細(xì)胞增殖情況比較 （OD值，±s）

Tab.2 Comparison of CaSki cell proliferation between three groups表2 各組CaSki細(xì)胞增殖情況比較 （OD值，±s）

組別CaSki組CaSki-NC組CaSki-shRNA組F n3 3 3 12 h 0.40±0.02 0.39±0.02 0.37±0.03 0.963 24 h 0.58±0.05 0.56±0.05 0.49±0.03 3.198 48 h 0.85±0.06 0.84±0.07 0.61±0.04ab 16.150＊＊

2.3 沉默hnRNP A2/B1對CaSki 細(xì)胞克隆形成能力的影響 CaSki 組、CaSki-NC 組、CaSki-shRNA 組的克隆形成率分別為（90.80±3.80）%、（82.23±5.69）%、（45.37±4.97）%，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（n=3，F(xiàn)=73.361，P＜0.01），其中CaSki-shRNA 組與CaSki組、CaSki-NC組比較克隆形成率降低，而CaSki組和CaSki-NC組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖3。

Fig.3 Detection of clone forming ability by plate clone experiment圖3 平板克隆實驗檢測克隆形成能力

2.4 沉默hnRNP A2/B1對CaSki 細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞結(jié)果顯示，與CaSki 組及CaSki-NC 組相比，CaSki-shRNA 組凋亡率明顯增加（P＜0.01），Western blot結(jié)果也顯示其凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達(dá)減低，Bax 表達(dá)增加（P＜0.01），而CaSki 組和CaSki-NC組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表3，圖4。

Tab.3 The apoptosis rate and protein expressions of bax and bcl-2 in three groups表3 各組凋亡率及Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)情況 （±s）

Tab.3 The apoptosis rate and protein expressions of bax and bcl-2 in three groups表3 各組凋亡率及Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)情況 （±s）

＊＊P＜0.01：a與CaSki組比較，b與CaSki-NC組比較，P＜0.01

組別CaSki組CaSki-NC組CaSki-shRNA組F n3 3 3凋亡率（%）28.41±0.90 27.48±1.07 43.31±0.61ab 304.542＊＊Bax蛋白0.24±0.03 0.23±0.03 0.57±0.04ab 106.457＊＊Bcl-2蛋白0.75±0.07 0.74±0.03 0.56±0.04ab 13.438＊＊

3 討論

宮頸癌是當(dāng)前全球?qū)ε酝{最大的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居我國四大惡性腫瘤的第二位［11］。正是由于宮頸癌在女性腫瘤中的高發(fā)病率，因此目前也有許多關(guān)于尋找與宮頸癌致病相關(guān)的基因位點的研究，期望在分子水平上對宮頸癌進(jìn)行干預(yù)。隨著對hnRNP A2/B1基因的相關(guān)研究的深入，逐漸發(fā)現(xiàn)了其與部分腫瘤存在著密切關(guān)系，但hnRNP A2/B1與宮頸癌的關(guān)系目前研究報道甚少，因此本研究通過沉默宮頸癌CaSki 細(xì)胞hnRNP A2/B1基因后探索其對增殖、凋亡的影響及其可能的相關(guān)作用機(jī)制。

核不均一核糖核蛋白（hnRNP）家族包含超過20種RNA結(jié)合蛋白，大部分結(jié)合于內(nèi)含子與外顯子的剪接序列而參與調(diào)控作用，其在mRNA轉(zhuǎn)錄、剪接過程中起著重要的作用［12-13］。hnRNP A2/B1是一種多功能RNA結(jié)合蛋白［14］。在對乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼RNAHOTAIR與hnRNP A2/B1之間存在著特異性相互作用，hnRNP A2/B1是HOTAIR介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞染色質(zhì)調(diào)控的關(guān)鍵因素［15］。本次研究驗證了課題組前期建立的穩(wěn)定沉默hnRNP A2/B1的CaSki細(xì)胞中的hnRNP A2/B1的表達(dá)情況，qRT-PCR和Western blot 結(jié)果顯示，與CaSki組及CaSki-NC 組相比，CaSki-shRNA組細(xì)胞中hnRNP A2/B1的mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯降低，表明hnRNP A2/B1基因的沉默效果仍然穩(wěn)定存在。在MTT 實驗中，CaSkishRNA 組培養(yǎng)48 h 后細(xì)胞增殖能力較CaSki 組及CaSki-NC組明顯降低，且在平板克隆實驗中CaSkishRNA 組的克隆形成率也較CaSki 組、CaSki-NCz 組明顯降低，表明沉默hnRNP A2/B1的表達(dá)可抑制CaSki 細(xì)胞的生長，這與Li 等［16］發(fā)現(xiàn)的沉默hnRNP A2/B1的表達(dá)后明顯抑制肺癌細(xì)胞的生長的結(jié)果一致，提示hnRNP A2/B1與宮頸癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)。

Fig.4 Detection of apoptosis by flow cytometry and Western blot assay圖4 流式細(xì)胞術(shù)及Western blot檢測凋亡相關(guān)變化

本研究顯示，hnRNP A2/B1 與宮頸癌細(xì)胞的凋亡同樣存在調(diào)控關(guān)系，因此本研究重點檢測了凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax 的表達(dá)變化。該凋亡蛋白家族主要包含促進(jìn)凋亡蛋白Bax 及抑制凋亡蛋白Bcl-2及其各自的亞基。研究表明，由于p53 腫瘤抑制因子突變會導(dǎo)致BH3 結(jié)構(gòu)域中蛋白的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受損，Bcl-2 過表達(dá)可觸發(fā)細(xì)胞凋亡［17］。Bax 主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，通過調(diào)控DNA 損傷、蛋白質(zhì)錯誤折疊等方式觸發(fā)線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C 的釋放，進(jìn)而激活半胱天冬酶級聯(lián)反應(yīng),從而誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡［18］。Bcl-2/Bax 已被證明參與調(diào)控了許多腫瘤的凋亡變化，在對鉑耐藥卵巢癌細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，利用siRNA 沉默Bcl-2基因或蛋白酶抑制劑abt-737阻斷Bcl-2的表達(dá)均可使順鉑誘導(dǎo)的MCS 細(xì)胞凋亡增強(qiáng)［19］。本研究Western blot 結(jié)果顯示，沉默宮頸癌CaSki 細(xì)胞中hnRNP A2/B1后，其凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2 表達(dá)減低，Bax 表達(dá)增加，流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果顯示其凋亡率明顯增加，表明沉默hnRNP A2/B1的表達(dá)可促進(jìn)CaSki細(xì)胞的凋亡，提示沉默宮頸癌細(xì)胞中hnRNP A2/B1后可能是通過抑制Bcl-2 及升高Bax 來介導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。這與Deng等［20］在膠質(zhì)瘤中研究結(jié)果一致，該研究發(fā)現(xiàn)沉默hnRNP A2/B1能誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。

綜上所述，本研究通過沉默宮頸癌細(xì)胞中hnRNP A2/B1基因后的體外相關(guān)研究表明，沉默hnRNP A2/B1基因后能抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖能力且可能通過Bcl-2/Bax 介導(dǎo)宮頸癌CaSki 細(xì)胞的凋亡，這將為宮頸癌的分子靶向治療提供新的思路。