封杏嵐，黃程青，徐瀹澄，沈繼云，解文濤，楊豫斐，何述棟

（合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，安徽合肥 230009）

0 引言

醇溶蛋白（Prolamin）是作物籽粒蛋白中溶于醇類的部分，占谷類成熟種子總氮的40%～60%[1]。醇溶蛋白具有良好的疏水、成膜、抗氧化[2]等功能，因而被廣泛應(yīng)用于食品、材料、紡織、醫(yī)藥等領(lǐng)域[3]。挖掘植物種子中醇溶蛋白的生產(chǎn)潛力，對(duì)于提高蛋白資源利用率、增加農(nóng)作物附加值具有重要意義。蕓豆（Kidney bean），又名扁豆、腰豆、飯豆，屬豆科，蝶形花亞科，菜豆族菜豆屬作物[4]，具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，其主要成分為碳水化合物（37.6%～48.5%）和蛋白質(zhì)（19.9%～20.0%）[5]。目前，鮮有針對(duì)蕓豆醇溶蛋白的研究報(bào)道。試驗(yàn)以白蕓豆為對(duì)象，通過單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，為豆類中醇溶蛋白的提取提供借鑒，同時(shí)可為蕓豆中蛋白質(zhì)資源的精細(xì)化利用提供理論基礎(chǔ)和試驗(yàn)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

云南大白蕓豆，市售；纖維素酶（綠色木霉50 U/mg）、（果膠酶500 U/mg），上海源葉生物科技有限公司提供；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器設(shè)備

SC-3614型低速離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；LGJ-12型冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；HX-300型高速中藥粉碎機(jī)，浙江省永康市溪岸五金藥具廠產(chǎn)品；CPll4型電子天平，奧豪斯儀器有限公司產(chǎn)品；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司產(chǎn)品；85-2型恒溫磁力攪拌器，江蘇省金壇市城東新瑞儀器廠產(chǎn)品；101-3A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海坤天試驗(yàn)室儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 原料預(yù)處理

選取飽滿、潔白、無(wú)蟲眼的白蕓豆，粉碎并過80目篩，篩下粉用正己烷脫脂。配制成濃度為50 mmol/L濃度0.5 mol/L NaCl和1.0 mmol/L EDTA的磷酸鹽緩沖液（pH值6.5），去除蕓豆粉中清蛋白和球蛋白[6]，具體方法為：準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的脫脂蕓豆粉，以料液比1∶10溶于緩沖液中，于室溫下磁力攪拌2 h后，在4℃下離心（8 000 r/min，10 min），棄去上清液，沉淀用超純水清洗3次后冷凍干燥備用。

1.4 蕓豆醇溶蛋白提取

參考韓晶[7]的方法提取白蕓豆中的醇溶蛋白。稱取預(yù)處理后的蕓豆粉20 g，加入乙醇溶液并在室溫下攪拌2 h，使蕓豆粉充分分散，水浴浸提后離心（8 000 r/min，15 min），收集上清液，沉淀重復(fù)浸提、離心2次，合并上清液，待45℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，冷凍干燥得到醇溶蛋白粉。

1.5 醇溶蛋白得率計(jì)算

利用凱氏定氮法（參考國(guó)標(biāo)GB 5009.5—2010）對(duì)蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算醇溶蛋白的得率。

1.6 醇溶蛋白提取單因素試驗(yàn)

選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)（50%，60%，70%，80%，90%，V/V），提取料液比 （1∶6，1∶8，1∶10，1∶12，1∶14，W/V），浸提溫度 （10，20，30，40，50℃） 和浸提時(shí)間 （1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h） 進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考查其對(duì)醇溶蛋白得率的影響，根據(jù)試驗(yàn)需要固定提取料液比1∶10，浸提溫度30℃，浸提時(shí)間2.0 h，每個(gè)單因素試驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.7 醇溶蛋白提取響應(yīng)面試驗(yàn)

選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)（X1）、料液比（X2）、浸提溫度（X3）、浸提時(shí)間（X4）為優(yōu)化因素，以醇溶蛋白得率（%）為響應(yīng)值，采用四因素三水平中心組合設(shè)計(jì) （Central Composite Design，CCD） 進(jìn)行白蕓豆醇溶蛋白提取試驗(yàn)。

響應(yīng)面因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面因素與水平設(shè)計(jì)

1.8 酶解處理對(duì)蕓豆醇溶蛋白提取率的影響

選擇纖維素酶和果膠酶對(duì)脫脂后蕓豆粉進(jìn)行酶解，探究酶解工藝對(duì)醇溶蛋白得率的影響。各組加酶量及條件為：①?gòu)?fù)合酶處理：0.5%纖維素酶+0.1%果膠酶，pH值5.0，180 min；②纖維素酶處理：0.5%纖維素酶，pH值5.0，180 min；③未加酶處理：料液比1∶10，酶解溫度55℃，酶解時(shí)間3.0 h。酶解后將混合液離心，沉淀于40℃下烘干備用。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 19.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，利用Design Expert 8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)、結(jié)果分析及預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)白蕓豆醇溶蛋白提取率的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)白蕓豆醇溶蛋白得率的影響見圖1。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)白蕓豆醇溶蛋白得率的影響

由圖1可知，醇溶蛋白得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高而增大，并于70%時(shí)獲得最大的提取量（1.75%±0.03%），當(dāng)體積分?jǐn)?shù)大于70%時(shí)，對(duì)于醇溶蛋白的提取效果反而有所下降。由方差分析結(jié)果可知，不同體積分?jǐn)?shù)乙醇對(duì)于蕓豆醇溶蛋白得率的影響差異顯著，過高（90%）或過低（50%）體積分?jǐn)?shù)都不宜于醇溶蛋白的溶出。醇溶蛋白的提取需要在一定體積分?jǐn)?shù)的醇溶液中實(shí)現(xiàn)，有文獻(xiàn)報(bào)道，玉米醇溶蛋白可溶解于50%～95%的乙醇溶液中[8]。陳曉萌等人[9]采用70%乙醇溶液對(duì)2種紅蕓豆中醇溶蛋白進(jìn)行提取，其得率分別占總蛋白的6.79%和6.12%，間接印證上述試驗(yàn)結(jié)果。以上試驗(yàn)確定提取用最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。

2.2 料液比對(duì)白蕓豆醇溶蛋白提取率的影響

料液比對(duì)白蕓豆醇溶蛋白得率的影響見圖2。

由圖2可知，當(dāng)料液比為1∶8和1∶10時(shí)均獲得較大的醇溶蛋白得率，且1∶10時(shí)達(dá)到最高為1.76%±0.01%，但二者之間差異不顯著；除此二者以外，無(wú)論料液比升高或是降低，均導(dǎo)致醇溶蛋白得率下降。一般而言，提取所用料液比越大，蕓豆粉在溶液中的分散越充分，更有利于蛋白質(zhì)的溶出。但過多的溶劑用量會(huì)造成分離和濃縮過程中混合液處理量增大，引起醇溶蛋白損失和提取成本增加；而較低料液比無(wú)法滿足蕓豆粉中蛋白質(zhì)的充分溶出。綜上原因并結(jié)合經(jīng)濟(jì)等因素，選擇提取液料比為1∶10。

圖2 提取液料比對(duì)白蕓豆醇溶蛋白得率的影響

2.3 浸提溫度對(duì)白蕓豆醇溶蛋白提取率的影響

浸提溫度對(duì)白蕓豆醇溶蛋白得率的影響見圖3。

圖3 浸提溫度對(duì)白蕓豆醇溶蛋白得率的影響

當(dāng)浸提溫度低于30℃時(shí)，醇溶蛋白得率隨浸提溫度增加而上升，并于30℃時(shí)獲得最大值（1.76%±0.01%）；隨后在40℃時(shí)醇溶蛋白得率為1.72%±0.02%，與30℃時(shí)相比差異不顯著；當(dāng)浸提溫度達(dá)到50℃時(shí)，醇溶蛋白得率迅速降低，此時(shí)僅為1.56%±0.42%。升高溫度可引起溶劑中分子活動(dòng)加劇，從而提高醇溶蛋白得率。但另一方面，乙醇作為沸點(diǎn)較低的易揮發(fā)性溶劑，隨著浸提溫度的升高不斷逸出，表現(xiàn)為溶液體系中實(shí)際乙醇體積分?jǐn)?shù)的下降，造成醇溶蛋白得率的降低。由圖3可知，最優(yōu)浸提溫度為30℃。

2.4 浸提時(shí)間對(duì)白蕓豆醇溶蛋白提取率的影響

浸提時(shí)間對(duì)白蕓豆醇溶蛋白得率的影響見圖4。

由圖4可知，隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)，各組醇溶蛋白得率不斷增加，在3.0 h時(shí)獲得最大值為1.80%±0.02%。從圖4中各點(diǎn)形成趨勢(shì)可明顯看出，增加浸提時(shí)間可以增加醇溶蛋白提取率，故3.0 h為最佳浸提時(shí)間，但對(duì)于實(shí)際生產(chǎn)而言，提取水平的選擇還需綜合成本、時(shí)間等因素來(lái)考慮。

2.5 白蕓豆醇溶蛋白提取響應(yīng)面優(yōu)化及結(jié)果分析

響應(yīng)面中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

通過Design Expert 8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，建立醇溶蛋白得率Y對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)X1、浸提液料比X2、浸提溫度X3和浸提時(shí)間X4的多元回歸方程如下：

圖4 浸提時(shí)間對(duì)白蕓豆醇溶蛋白得率的影響

表2 響應(yīng)面中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表3可知，回歸方程p＜0.000 1，方程高度顯著；失擬項(xiàng)p=0.637 9＞0.05，失擬結(jié)果不顯著；同時(shí)模型相關(guān)系數(shù)R2=0.992 5，校正系數(shù)R2Adj=0.985 4，說(shuō)明模型擬合效果良好，因此可通過以上回歸方程確定醇溶蛋白提取最優(yōu)工藝參數(shù)。影響醇溶蛋白得率因素的主次順序?yàn)閄2=X4＞X3＞X1，且選取的各因素均對(duì)醇溶蛋白得率影響顯著或極顯著。

方差分析見表3。

表3 方差分析

2.6 響應(yīng)面分析及最優(yōu)工藝參數(shù)確定

響應(yīng)面分析診斷圖見圖5。

由圖5可知，（a）中展示的殘差正態(tài)分布概率近似分布在一條直線上，（b）中各點(diǎn)分布零散且無(wú)規(guī)律，而（c）中的點(diǎn)幾乎在一條直線上，以上皆表明由響應(yīng)面分析擬合的模型適應(yīng)性良好。由表3可知，除乙醇體積分?jǐn)?shù)和浸提溫度外，其余因素間兩兩交互作用差異顯著。

不同因素交互作用對(duì)醇溶蛋白得率影響響應(yīng)面及等高線圖見圖6。

由圖6可知，固定浸提溫度和時(shí)間，醇溶蛋白得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加呈上升后下降趨勢(shì)，隨料液比在一定范圍內(nèi)緩慢上升、（b）中乙醇體積分?jǐn)?shù)和浸提溫度在試驗(yàn)設(shè)計(jì)水平內(nèi)交互作用不顯著，固定浸提溫度后，醇溶蛋白得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)先升高后下降，另一方面，得率隨浸提溫度升高也表現(xiàn)出相似趨勢(shì)，但弱于乙醇體積分?jǐn)?shù)造成的影響。從圖6（c） 可看出，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)位于“0”水平附近，同時(shí)浸提時(shí)間位于“1”水平附近時(shí)，可獲得較高的醇溶蛋白提取量。（d）圖表明，在固定浸提溫度的情況下，提高液料比可以明顯增加醇溶蛋白的提取率。（e）（f）兩圖均表明，固定其他3個(gè)因素的水平，延長(zhǎng)浸提溫度可有效提高醇溶蛋白得率。經(jīng)該模型預(yù)測(cè)優(yōu)化出的提取工藝參數(shù)為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，料液比1∶9.2，浸提溫度32℃，浸提時(shí)間2.9 h，預(yù)測(cè)得率為1.83%。采用以上參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，獲得醇溶蛋白得率為1.78%，占蕓豆中總蛋白質(zhì)量的7.81%，與預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差為2.73%，表明預(yù)測(cè)模型較為可靠。

圖5 響應(yīng)面分析診斷圖

2.7 酶解處理對(duì)白蕓豆醇溶蛋白提取率的影響

酶解處理對(duì)白蕓豆醇溶蛋白得率的影響見圖7。

由圖7可知，醇溶蛋白得率由大到小排列為：未加酶組（1.76%±0.03%）＞僅加纖維素酶組（0.90%±0.05%）＞纖維素酶+果膠酶（復(fù)合酶）組（0.70%±0.04%），且各組間存在顯著差異。理論上認(rèn)為，在蕓豆粉脫脂之后進(jìn)行纖維素酶、果膠酶處理，對(duì)蕓豆粉中纖維素、半纖維素和果膠質(zhì)等[10]進(jìn)行酶解，破壞蕓豆的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，利于蛋白質(zhì)在后續(xù)醇提過程中的溶出。然而實(shí)際上，多步處理會(huì)造成蛋白質(zhì)的損失；多糖類物質(zhì)酶解后可能會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性降低蛋白質(zhì)的溶解度；且豆粉容易出現(xiàn)結(jié)塊，不利于乙醇溶液的浸提。綜上原因，酶解處理不利于白蕓豆中醇溶蛋白的提取。

3 結(jié)論

采用單因素試驗(yàn)分別考查乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、浸提溫度和浸提時(shí)間對(duì)于醇溶蛋白得率的影響，最佳工藝參數(shù)為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，料液比1∶10，浸提溫度30℃，浸提時(shí)間3.0 h；通過響應(yīng)面分析優(yōu)化出最佳提取工藝，得到回歸方程為：

圖6 不同因素交互作用對(duì)醇溶蛋白得率影響響應(yīng)面及等高線圖

圖7 酶解處理對(duì)白蕓豆醇溶蛋白得率的影響

當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，料液比1∶9.2，浸提溫度32℃和浸提時(shí)間2.9 h時(shí)，醇溶蛋白得率可達(dá)到1.78%。和未加酶組相比較，酶解處理未明顯提高醇溶蛋白的提取率。