盛 磊，武貴臻，熱娜古麗·熱依木，艾尼娃爾·艾克木*

(1．新疆醫(yī)科大學(xué)新疆地方病分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830011；2．新疆醫(yī)科大學(xué)藥物分析教研室，新疆烏魯木齊 830011；3．新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究院，新疆烏魯木齊 830011)

黑種草子為毛茛科植物腺毛黑種草(Nigella glandulifera Freyn et Sint.)的干燥成熟種子，在中國(guó)新疆有悠久的栽培歷史，是當(dāng)?shù)厣贁?shù)民族常用的藥材，被應(yīng)用于婦科疾病且有較好的療效[1]。黑種草子除了富含脂肪酸和揮發(fā)油外，還含有黃酮類、皂苷類及生物堿類等多種化合物[2]。其中黃酮類化合物由于其藥用價(jià)值廣泛、生物活性強(qiáng)、毒副作用小的特點(diǎn)，在醫(yī)藥領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景和潛在的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值，一直為國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)[3]。以往研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物具有廣泛的抗腫瘤活性[4-9]，但到目前為止黑種草子總黃酮在抗腫瘤方面的研究甚少?；诤诜N草子為新疆民族醫(yī)婦科常用藥的特點(diǎn)，本研究以宮頸癌細(xì)胞株(SiHa和HeLa)為對(duì)象，采取MTT法檢測(cè)新疆黑種草子總黃酮成分對(duì)宮頸癌細(xì)胞株的體外抗增殖活性，劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)新疆黑種草子總黃酮成分對(duì)宮頸癌細(xì)胞株遷移的影響，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)藥物干預(yù)前后宮頸癌細(xì)胞株的凋亡情況，初步探討新疆黑種草子總黃酮成分的體外抗腫瘤機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

宮頸癌細(xì)胞株(SiHa和HeLa)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)。

1.2 主要試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基，購(gòu)于HyClone公司；胎牛血清，購(gòu)于Gibco公司；青霉素/鏈霉素溶液，購(gòu)于HyClone公司；MTT購(gòu)于Sigma公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，購(gòu)于BD公司；新疆黑種草子購(gòu)于新疆維吾爾自治區(qū)民族醫(yī)院。

1.3 儀器設(shè)備

細(xì)胞圖像觀察及采集使用Leica DMI4000B智能型倒置熒光顯微鏡(Leica公司)；MTT結(jié)果檢測(cè)使用Thermo Multiskan GO全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Thermo公司)；細(xì)胞凋亡率檢測(cè)使用LSRⅡ流式細(xì)胞檢測(cè)儀(BD公司)。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) 使用含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基，在37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下分別培養(yǎng)宮頸癌SiHa和HeLa細(xì)胞株，每隔2～3 d需更換完全培養(yǎng)基1次，待細(xì)胞鋪滿80%～90%瓶底面積時(shí)，使用0.25%的胰蛋白酶消化后按1∶3或1∶4的比例進(jìn)行傳代。

1.4.2 黑種草子總黃酮體外抗腫瘤細(xì)胞增殖檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期宮頸癌細(xì)胞，以2×105個(gè)/mL的濃度接種于96孔板，每孔200μL。待細(xì)胞貼壁后，分別以2.5、5、10、15、20、25和50μg/mL的黑種草子總黃酮進(jìn)行體外處理，空白對(duì)照組加入等體積的生理鹽水。處理24 h后，使用倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)，加入MTT工作液，37℃孵育4 h后490 nm處檢測(cè)吸光度D(490)值。按照公式：抑制率=[D(490)對(duì)照組-D(490)處理組]/D(490)對(duì)照組×100%，計(jì)算各濃度下的增殖抑制率，以受試物濃度為橫坐標(biāo)、抑制率為縱坐標(biāo)繪制黑種草子總黃酮體外抗腫瘤活性曲線，使用SPSS軟件以probit模型計(jì)算出黑種草子總黃酮體外抗腫瘤的IC50。

1.4.3 黑種草子總黃酮體外抗腫瘤細(xì)胞遷移檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期宮頸癌細(xì)胞，以2×105個(gè)/mL的濃度接種于6孔板，每孔2 mL。待細(xì)胞貼壁后，使用10μL槍頭在每孔中做一條垂直于板底的劃痕，PBS沖洗去除劃下的細(xì)胞。處理組每孔加入2 mL含藥培養(yǎng)基(15μg/mL)，空白對(duì)照組每孔加入2 mL無(wú)血清培養(yǎng)基，每組3個(gè)復(fù)孔。分別于處理的0和24 h拍攝并測(cè)量劃痕寬度，計(jì)算每組處理前后劃痕寬度的差值(d)。

1.4.4 黑種草子總黃酮體外誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期宮頸癌細(xì)胞，以2×105個(gè)/mL的濃度接種于6孔板，每孔2 mL。待細(xì)胞貼壁后，分別以不同濃度(10、15和25μg/mL)的黑種草子總黃酮進(jìn)行處理，空白對(duì)照組加入等體積的生理鹽水。處理24 h后分別收集各組細(xì)胞，細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒染色后采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行MTT檢測(cè)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，吸光度值結(jié)果以xˉ±s表示，兩樣本均數(shù)比較采取t檢驗(yàn)，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 黑種草子總黃酮的體外抗腫瘤細(xì)胞增殖活性

使用MTT法分別檢測(cè)黑種草子總黃酮對(duì)宮頸癌細(xì)胞株SiHa和HeLa的增殖抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黑種草子總黃酮均是在濃度為10μg/mL時(shí)對(duì)SiHa和HeLa細(xì)胞株開(kāi)始發(fā)揮增殖抑制作用(P＜0.05)，之后隨著濃度的升高黑種草子總黃酮對(duì)兩種宮頸癌細(xì)胞株的抑制率也不斷升高，顯現(xiàn)良好的量效依賴關(guān)系(表1、表2)。以濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)繪制黑種草子總黃酮體外抗腫瘤活性曲線(圖1)，發(fā)現(xiàn)黑種草子總黃酮對(duì)兩種宮頸癌細(xì)胞株具有相似作用效果，均在濃度為10μg/mL時(shí)發(fā)揮增殖抑制作用，而在20～25μg/mL時(shí)進(jìn)入平臺(tái)期。分別對(duì)兩組MTT結(jié)果的濃度和抑制率進(jìn)行Probit回歸分析后得到效應(yīng)概率為50%時(shí)的受試物濃度(IC50)，黑種草子總黃酮對(duì)SiHa細(xì)胞株的IC50為16.935 μg/mL，對(duì)HeLa細(xì)胞株的IC50為18.366 μg/mL。

表1 黑種草子總黃酮對(duì)宮頸癌細(xì)胞株SiHa的體外抑制作用()

表1 黑種草子總黃酮對(duì)宮頸癌細(xì)胞株SiHa的體外抑制作用()

*獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，所列數(shù)據(jù)均為與空白對(duì)照組比較的結(jié)果.

組別空白對(duì)照組黑種草子總黃酮 2.5μg/mL 5μg/mL 10μg/mL 15μg/mL 20μg/mL 25μg/mL 50μg/mL D(490)0.561±0.035 0.550±0.027 0.529±0.028 0.506±0.019*0.339±0.072*0.089±0.005*0.089±0.003*0.087±0.002*t 0.500 1.436 2.761 5.527 26.791 26.962 27.179 P*-0.635 0.201 0.043 0.001＜0.01＜0.01＜0.01抑制率/%-1.96 5.70 9.80 39.57 84.14 84.14 84.49

表2 黑種草子總黃酮對(duì)宮頸癌細(xì)胞株HeLa的體外抑制作用()

表2 黑種草子總黃酮對(duì)宮頸癌細(xì)胞株HeLa的體外抑制作用()

*獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，所列數(shù)據(jù)均為與空白對(duì)照組比較的結(jié)果.

組別空白對(duì)照組黑種草子總黃酮 2.5μg/mL 5μg/mL 10μg/mL 15μg/mL 20μg/mL 25μg/mL 50μg/mL D(490)0.929±0.019 0.928±0.017 0.894±0.057 0.843±0.041*0.649±0.023*0.240±0.030*0.085±0.003*0.092±0.003*t-0.079 1.184 3.817 18.605 38.903 87.538 87.099 P*-0.940 0.281 0.009＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01抑制率/%-0.11 3.77 9.26 30.14 74.17 90.85 90.10

圖1 黑種草子總黃酮體外抗腫瘤活性曲線

2.2 黑種草子總黃酮處理后腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

對(duì)處理后的宮頸癌細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)：對(duì)照組SiHa和HeLa細(xì)胞均為單層貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞個(gè)體飽滿，透明度大，折光性強(qiáng)，細(xì)胞密度達(dá)90%以上，SiHa細(xì)胞形態(tài)為梭形而HeLa細(xì)胞為多角形；在處理組中，兩種宮頸癌細(xì)胞形態(tài)均隨著藥物濃度的增加而逐漸回縮，細(xì)胞輪廓清晰，折光性下降，細(xì)胞密度逐步降低，死細(xì)胞數(shù)目增多(圖2、圖3)。

圖2 黑種草子總黃酮處理后SiHa細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察(×100)

2.3 黑種草子總黃酮體外抗腫瘤細(xì)胞遷移檢測(cè)

圖3 黑種草子總黃酮處理后HeLa細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察(×100)

通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)黑種草子總黃酮體外對(duì)宮頸癌細(xì)胞株SiHa和HeLa遷移的影響，結(jié)果顯示：體外處理24 h后，SiHa和HeLa細(xì)胞株空白對(duì)照組劃痕處細(xì)胞均趨于匯合，而處理組劃痕處變化不大(圖4、圖5)。使用處理前后劃痕處的寬度差表示細(xì)胞的相對(duì)遷移距離，結(jié)果如表3所示，SiHa細(xì)胞株空白對(duì)照組的腫瘤細(xì)胞相對(duì)遷移距離為(223.333±13.868)px，處理組的相對(duì)遷移距離為(56.333±10.970)px；HeLa細(xì)胞株空白對(duì)照組的腫瘤細(xì)胞相對(duì)遷移距離為(360.667±15.308)px，處理組的相對(duì)遷移距離為(13.000±3.606)px，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表3 黑種草子總黃酮對(duì)宮頸癌細(xì)胞株的體外誘導(dǎo)凋亡作用()

表3 黑種草子總黃酮對(duì)宮頸癌細(xì)胞株的體外誘導(dǎo)凋亡作用()

*獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，所列數(shù)據(jù)均為與空白對(duì)照組比較的結(jié)果.

腫瘤細(xì)胞株SiHa HeLa分組空白對(duì)照組處理組空白對(duì)照組處理組相對(duì)遷移距離/px 223.333±13.868 56.333±10.970*360.667±15.308 13.000±3.606*t 16.358 38.290 P＜0.01＜0.01

圖4 SiHa細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)(×50)

圖5 HeLa細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)(×50)

2.4 黑種草子總黃酮體外誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡檢測(cè)

使用Annexin V和PI分別對(duì)空白對(duì)照組和處理組細(xì)胞進(jìn)行染色，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡項(xiàng)目檢測(cè)，結(jié)果顯示黑種草子總黃酮對(duì)SiHa和HeLa細(xì)胞均具有誘導(dǎo)凋亡的作用(表4)，并且這種作用隨藥物濃度的增加而增強(qiáng)，顯示出良好的量效依賴關(guān)系(圖6、圖7)。在SiHa細(xì)胞中，相對(duì)于空白對(duì)照組(4.0±0.2)%的凋亡率，低濃度組(10μg/mL)的凋亡率為(8.5±0.5)%，中濃度組(15μg/mL)的凋亡率為(35.9±1.3)%，高濃度組(25μg/mL)的凋亡率為(85.7±1.6)%；在HeLa細(xì)胞中，相對(duì)于空白對(duì)照組(0.4±0.1)%的凋亡率，10μg/mL組的凋亡率為(5.3±0.4)%，15μg/mL組的凋亡率為(11.4±0.8)%，25μg/mL組的凋亡率為(85.9±1.9)%，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)

表4 黑種草子總黃酮對(duì)宮頸癌細(xì)胞株遷移的影響()

表4 黑種草子總黃酮對(duì)宮頸癌細(xì)胞株遷移的影響()

*獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，所列數(shù)據(jù)均為與空白對(duì)照組比較的結(jié)果.

組別空白對(duì)照組10μg/mL 15μg/mL 25μg/mL SiHa細(xì)胞凋亡率4.0±0.2 8.5±0.5*35.9±1.3*85.7±1.6*t--14.047-41.418-89.319 P-＜0.01＜0.01＜0.01 HeLa細(xì)胞凋亡率0.4±0.1 5.3±0.4*11.4±0.8*85.9±1.9*t--20.192-24.870-77.448 P-＜0.01＜0.01＜0.01

3 討論

宮頸癌是最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤[10-11]，據(jù)2017中國(guó)腫瘤登記中心年報(bào)顯示，我國(guó)宮頸癌發(fā)病率高(9.6/10萬(wàn))，每年約有15萬(wàn)新發(fā)病例，占世界宮頸癌新發(fā)病例總數(shù)的28%，每年約有8萬(wàn)名婦女死于宮頸癌[12]。新疆是我國(guó)宮頸癌的高發(fā)區(qū)，其中維吾爾族婦女宮頸癌的發(fā)病率是相同地區(qū)漢族婦女宮頸癌發(fā)病率的3～4倍[13-14]，死亡率居全國(guó)少數(shù)名族宮頸癌死亡率首位[15]。因此，宮頸癌的防治是新疆地區(qū)醫(yī)療面臨的重要問(wèn)題。

宮頸癌的治療采用以手術(shù)治療為主，并輔以放射及化學(xué)藥物綜合治療。順鉑(DDP)作為宮頸癌常用的化療藥物之一[16]，具有抗癌譜廣、療效確切等特點(diǎn)[17-18]，同時(shí)也具有骨髓抑制，腎臟毒性，神經(jīng)毒性，胃腸道反應(yīng)，過(guò)敏反應(yīng)，電解質(zhì)紊亂等一系列毒副作用[19-20]，導(dǎo)致患者生存質(zhì)量普遍下降，甚至因不能耐受而被迫中止治療。尋找一種有效的天然抗癌新藥，使其與傳統(tǒng)化療藥聯(lián)合使用，降低傳統(tǒng)化療藥物的使用劑量，進(jìn)而減輕化療的毒副作用，提高患者耐受程度及生存質(zhì)量，對(duì)宮頸癌的治療具有積極意義。

腫瘤細(xì)胞具有兩大生物學(xué)特性：永生性和遷移性。永生性是腫瘤細(xì)胞無(wú)限增殖的根本原因，遷移性則是腫瘤發(fā)生浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的物質(zhì)基礎(chǔ)。因此，抗腫瘤細(xì)胞增殖是抗腫瘤藥物的重要特性，如何控制腫瘤細(xì)胞的遷移則是腫瘤治療的另一關(guān)鍵問(wèn)題。本研究使用黑種草子總黃酮對(duì)宮頸癌細(xì)胞SiHa和HeLa進(jìn)行體外處理，MTT法檢測(cè)黑種草子總黃酮對(duì)宮頸癌細(xì)胞的體外抗增殖作用，結(jié)果顯示黑種草子總黃酮在體外對(duì)SiHa和HeLa細(xì)胞均具有較好的抗增殖活性，且對(duì)兩種細(xì)胞株有相似的最大抑制率及IC50。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察進(jìn)一步支持了MTT檢測(cè)結(jié)果，隨著藥物濃度的不斷增大，腫瘤細(xì)胞失去了應(yīng)有的形態(tài)，細(xì)胞活力降低，活細(xì)胞數(shù)目不斷減少。劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)黑種草子總黃酮對(duì)宮頸癌細(xì)胞的體外抗遷移作用，結(jié)果顯示黑種草子總黃酮在體外對(duì)SiHa和HeLa細(xì)胞均具有明顯的抗遷移作用。

圖6 黑種草子總黃酮對(duì)SiHa細(xì)胞的體外誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡檢測(cè)

圖7 黑種草子總黃酮對(duì)HeLa細(xì)胞的體外誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡檢測(cè)

凋亡是細(xì)胞的程序性死亡，在機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育、免疫耐受等方面發(fā)揮著非常重要的作用，同時(shí)在整個(gè)生命周期中維持著機(jī)體的穩(wěn)態(tài)。細(xì)胞有增殖、分化和凋亡的特征，三者相互協(xié)調(diào)，共同調(diào)節(jié)。有研究顯示細(xì)胞凋亡作用的失衡與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[21]。自1992年Hickman[22]等首次提出誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡可作為腫瘤治療研究中的主要目標(biāo)和手段以來(lái)，治療性細(xì)胞凋亡干預(yù)作為一種發(fā)展中的疾病治療手段，已逐漸成為國(guó)內(nèi)外腫瘤治療研究的一個(gè)熱點(diǎn)。本研究細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示，黑種草子總黃酮在體外可誘導(dǎo)SiHa和HeLa細(xì)胞凋亡的發(fā)生，且呈現(xiàn)良好的量效依賴關(guān)系。綜合上述結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，黑種草子總黃酮具有體外抗宮頸癌細(xì)胞株增殖及遷移作用，同時(shí)能夠誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞株發(fā)生凋亡。

綜上所述，新疆黑種草子總黃酮可能在治療宮頸癌方面具有潛在的藥用價(jià)值，本研究為進(jìn)一步探索和開(kāi)發(fā)新疆地區(qū)道地藥材奠定了基礎(chǔ)。