郝丹 岳磊 黃金明

(南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校第一附屬醫(yī)院泌尿外科，河南 南陽(yáng) 473000)

前列腺癌是第二大男性惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2012年世界前列腺癌新發(fā)病例約109萬(wàn)，死亡例數(shù)約30萬(wàn)，其中北美、西歐等發(fā)達(dá)地區(qū)發(fā)病率較高，中非、東南亞等欠發(fā)達(dá)地區(qū)發(fā)病率較低，總體呈上升趨勢(shì)〔1〕。隨著人口老齡化進(jìn)程和飲食結(jié)構(gòu)的改變，我國(guó)前列腺癌發(fā)病率和死亡率已分別占男性惡性腫瘤第6位和第9位〔2〕。前列腺癌的發(fā)生與年齡、居住地區(qū)、飲食結(jié)構(gòu)、遺傳等多種因素有關(guān)，采用直腸指檢、前列腺特異性抗原檢測(cè)、磁共振成像等進(jìn)行臨床篩查及外科手術(shù)、放化療、姑息治療、中藥治療等綜合治療方式有助于改善患者預(yù)后、延長(zhǎng)患者總生存期〔3～5〕。傳統(tǒng)中草藥治療在肝癌、胃癌等多種腫瘤的治療中發(fā)揮良好的抗腫瘤作用〔6，7〕。穿心蓮內(nèi)酯是中藥穿心蓮的有效成分之一，具有抗菌消炎、保肝利膽、抗腫瘤等藥理作用，能夠通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白表達(dá)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，抑制多種癌細(xì)胞的體外增殖〔8〕。本研究以PC-3人前列腺癌細(xì)胞為研究對(duì)象，檢測(cè)穿心蓮內(nèi)酯對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞中miR-206表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1一般資料 選取2015年8月至2018年3月就診于南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校第一附屬醫(yī)院經(jīng)病理科確診為前列腺癌的患者45例為研究對(duì)象，年齡43～81歲；經(jīng)手術(shù)切除的前列腺癌組織樣本及相應(yīng)的癌旁組織(距離病灶≥5 cm)迅速放入液氮中，帶回后于-80℃ 冰箱保存；所有患者術(shù)前未接受放療或化療并簽署知情同意書；本實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批同意。

1.2材料 PC-3細(xì)胞(批號(hào)：CRL-1435)購(gòu)自ATCC；穿心蓮內(nèi)酯(批號(hào)：100136-201405)購(gòu)自中國(guó)藥品與生物制品鑒定所；胎牛血清(批號(hào)：SH41288)、RPMI1640培養(yǎng)液(批號(hào)：SH30807)購(gòu)自美國(guó)Gibco-BRL公司；噻唑藍(lán)(MTT，批號(hào)：M2129)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：170207)購(gòu)自美國(guó)Coulter公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(批號(hào)：11668027)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；二甲基亞砜(DMSO)(批號(hào)：D8370)、聚偏氟乙烯(PVDF)膜(批號(hào)：BSP0161)、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：D0010)、電化學(xué)發(fā)光(ECL)液(批號(hào)：PE0030)、結(jié)晶紫(批號(hào)：C8470)、4% 多聚甲醛(批號(hào)：P1110)、RIPA裂解液(批號(hào)：R0020)購(gòu)自北京Solarbio公司；免疫組化試劑盒(批號(hào)：1410319706)購(gòu)自邁新生物技術(shù)有限公司；miR-206模擬物及抑制物購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；斯鈣素(STC)2多克隆抗體(批號(hào)：ABP60538)購(gòu)自武漢艾美捷科技有限公司；GAPDH多克隆抗體(批號(hào)：XFC1665)購(gòu)自上海信帆生物科技有限公司；TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)：RR047A)、TaKaRa實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒(批號(hào)：RR820A)購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；MCO-18AC型CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自日本SANYO公司；NanoDrop微量核酸測(cè)定儀購(gòu)自上海創(chuàng)萌生物科技有限公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自Thermo公司；ABI-7300實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自上海普迪生物技術(shù)有限公司。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)與分組 使用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液于37℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)PC-3細(xì)胞，每天更換新鮮培養(yǎng)液。取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的PC-3細(xì)胞，胰酶消化后重懸，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1×105個(gè)/ml并接種于96孔板。細(xì)胞分組：常規(guī)培養(yǎng)24 h后更換新鮮培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞加入穿心蓮內(nèi)酯并調(diào)整濃度為10 μmol/L，記為穿心蓮內(nèi)酯組；取等量DMSO加入到培養(yǎng)液中，記為對(duì)照組；匯合度約45% 的PC-3細(xì)胞按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別將模擬物對(duì)照、miR-206模擬物、抑制物對(duì)照、miR-206抑制物轉(zhuǎn)染至PC-3細(xì)胞并分別標(biāo)記為miR-NC組、miR-206組、miR-con組、miR-206抑制物組；穿心蓮內(nèi)酯+miR-con組：轉(zhuǎn)染抑制物對(duì)照后的PC-3細(xì)胞培養(yǎng)液中加入穿心蓮內(nèi)酯并調(diào)整濃度為10 μmol/L；穿心蓮內(nèi)酯+miR-206抑制物組：轉(zhuǎn)染miR-206抑制物后的PC-3細(xì)胞培養(yǎng)液中加入穿心蓮內(nèi)酯并調(diào)整濃度為10 μmol/L；每組細(xì)胞6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 對(duì)照組、穿心蓮內(nèi)酯組、miR-NC組、miR-206組、穿心蓮內(nèi)酯+miR-con組和穿心蓮內(nèi)酯+miR-206抑制物組細(xì)胞在37℃、5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)24 h、48 h、72 h時(shí)加入20 μl MTT(5 mg/ml)，繼續(xù)孵育4 h；棄去多余培養(yǎng)基后加入150 μl DMSO振蕩反應(yīng)10 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處吸光度(A)值。

1.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取各組細(xì)胞，胰酶消化后4℃、900 r/min離心10 min收集。按照Annexin V-FITC/碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書分別加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI，輕輕混勻后室溫避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.6qRT-PCR 取適量前列腺癌組織及癌旁組織細(xì)胞充分研磨，加入Trizol試劑提取總RNA，使用超微量核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)RNA濃度和純度。分別使用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA并配制反應(yīng)體系，以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用F=2-△△Ct法分析miR-206和STC2相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)RNA樣品重復(fù)3次。MiR-206引物：上游：5′-AGTTCACCTTGATGCCGTTCT-3′，下游：5′-CAGTGCTTCAGCCGCTACCC-3′；STC2引物：上游：5′-ATGCTACCTCAAGCACGACC-3′，下游：5′-TCTGCTCACACTGAACCTGC-3′；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)引物：上游5′-GCCAAGGTCATCCATGACAACTTTGG-3′，下游：5′-GCCTGCTTCACCACCTTCTTGATGTC-3′。

1.7Western印跡 將各組細(xì)胞超聲粉碎，加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液于冰上裂解5 min，4℃，36 000 r/min離心15 min，收集上清。取蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)封閉2 h。分別加入兔抗人STC2多克隆抗體(1∶100)、兔抗人GAPDH多克隆抗體(1∶1 000)，4℃ 孵育過(guò)夜，TBST漂洗后加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h。TBST漂洗3次，每次10 min，ECL試劑盒發(fā)光顯影，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.8免疫組化 收集的前列腺癌組織及癌旁組織經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋后4 μm連續(xù)切片，使用二甲苯和梯度乙醇溶液脫蠟水化，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次。滴加3 % 過(guò)氧化氫室溫孵育10 min，阻斷過(guò)氧化物酶，將切片浸入0.01 mol/L檸檬酸緩沖液微波加熱至沸騰30 min，自然冷卻至室溫，先后用蒸餾水和PBS洗滌；加入PBS稀釋的正常山羊血清37℃ 封閉30 min。按照免疫組化試劑盒說(shuō)明書加入STC2單克隆抗體(1∶100)，濕盒中4℃孵育過(guò)夜；加入生物素標(biāo)記的二抗37℃ 孵育25 min；PBS洗滌3次，每次3 min。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)避光顯色，蘇木素復(fù)染；經(jīng)梯度乙醇和二甲苯脫水透明后中性樹膠封片；顯微鏡下觀察。

1.9雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的PC-3細(xì)胞，按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書將STC2 3′UTR野生型(WT)質(zhì)粒和突變型(MUT)質(zhì)粒分別與模擬物對(duì)照或miR-206模擬物共轉(zhuǎn)染，常規(guī)培養(yǎng)48 h。加入細(xì)胞裂解液裂解后4℃，36 000 r/min離心10 min收集上清，檢測(cè)熒光素酶活性。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1穿心蓮內(nèi)酯對(duì)PC-3細(xì)胞增殖、凋亡及miR-206表達(dá)的影響 穿心蓮內(nèi)酯組培養(yǎng)48 h、72 h的細(xì)胞活性較對(duì)照組均顯著降低(P<0.05)；而細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞中miR-206表達(dá)水平則顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。見表1。

2.2過(guò)表達(dá)miR-206對(duì)PC-3細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與miR-NC組比較，miR-206組細(xì)胞中miR-206表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；48 h、72 h時(shí)細(xì)胞活性顯著低于miR-NC組(P<0.05)，而細(xì)胞凋亡率較miR-NC組顯著升高(P<0.05)。見表2。

2.3抑制miR-206表達(dá)可逆轉(zhuǎn)穿心蓮內(nèi)酯對(duì)PC-3細(xì)胞增殖的抑制及凋亡的誘導(dǎo)作用 穿心蓮內(nèi)酯干預(yù)PC-3細(xì)胞，細(xì)胞中miR-206表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，48 h、72 h細(xì)胞活性顯著下降(P<0.05)，凋亡細(xì)胞數(shù)顯著增加(P<0.05)；而將miR-206抑制物轉(zhuǎn)染至PC-3細(xì)胞并聯(lián)合穿心蓮內(nèi)酯干預(yù)后，細(xì)胞中miR-206表達(dá)水平、細(xì)胞活性及凋亡率均基本恢復(fù)至正常水平(P<0.05)。見表3。

2.4前列腺癌組織中miR-206和STC2表達(dá) STC2在前列腺癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織(6.76±0.62 vs 1.03±0.19,P<0.05)，見圖1。與癌旁組織比較，前列腺癌組織中miR-206表達(dá)顯著下調(diào)(1.21±0.12 vs 0.35±0.07,P<0.001)。

表1 穿心蓮內(nèi)酯對(duì)PC-3細(xì)胞增殖、凋亡及miR-206表達(dá)的影響

表2 miR-206過(guò)表達(dá)對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

表3 抑制miR-206表達(dá)可逆轉(zhuǎn)穿心蓮內(nèi)酯對(duì)PC-3細(xì)胞增殖的抑制及凋亡的誘導(dǎo)作用

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與穿心蓮內(nèi)酯+miR-Con組比較：2)P<0.05；表5同

圖1 STC2在前列腺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)(×200)

2.5miR-206靶向調(diào)控STC2表達(dá) Targetscan在線預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，STC2 3′UTR上存在miR-206的結(jié)合位點(diǎn)(圖2)；與miR-NC組比較，miR-206組WT-STC2細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)，而MUT-STC2熒光素酶活性無(wú)明顯變化(P>0.05)。見表4。

圖2 STC2的3′UTR中含有與miR-206互補(bǔ)的核苷酸序列

組別WT-STC2 MUT-STC2miR-NC組1.43±0.131.47±0.14miR-206組0.67±0.081.44±0.15t值8.6240.253P值0.0010.813

2.6抑制miR-206表達(dá)對(duì)穿心蓮內(nèi)酯處理的PC-3細(xì)胞中STC2表達(dá)的影響 穿心蓮內(nèi)酯干預(yù)PC-3細(xì)胞后，細(xì)胞中STC2 mRNA和蛋白水平的表達(dá)均顯著下調(diào)(P<0.05)；而將miR-206抑制物轉(zhuǎn)染至PC-3細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理后，細(xì)胞中STC2表達(dá)水平基本恢復(fù)至正常水平(P<0.05)。見圖3、表5。

1～4：對(duì)照組、穿心蓮內(nèi)酯組、穿心鏈內(nèi)酯+miR-Con組、穿心蓮內(nèi)酯+miR-206抑制物組圖3 前列腺癌細(xì)胞中STC2蛋白表達(dá)

組別STC2 mRNASTC2蛋白對(duì)照組1.46±0.150.76±0.08穿心蓮內(nèi)酯組0.67±0.071)0.23±0.031)穿心蓮內(nèi)酯+miR-Con組0.62±0.060.19±0.02穿心蓮內(nèi)酯+miR-206抑制物組1.33±0.132)0.71±0.072)F/P值47.783/0.00088.151/0.000

3 討 論

穿心蓮又名一見喜、苦草，是爵床科穿心蓮屬1年生草本植物，廣泛分布于我國(guó)廣東、廣西、海南等地；其化學(xué)成分包括黃酮類、生物堿、三萜類、二萜內(nèi)酯類等，常用于腸胃炎、呼吸道感染、感冒發(fā)熱等疾病的治療〔9〕。近年來(lái)，穿心蓮內(nèi)酯在腫瘤領(lǐng)域的研究受到了廣泛關(guān)注，其抗腫瘤作用在越來(lái)越多的研究中得到證實(shí)。如：Chen等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)，穿心蓮內(nèi)酯能夠通過(guò)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用；Chao等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌細(xì)胞中，穿心蓮內(nèi)酯可抑制基質(zhì)金屬蛋白酶2活性，從而抑制細(xì)胞侵襲。此外，在前列腺癌的相關(guān)研究中，已有報(bào)道〔12〕稱：穿心蓮內(nèi)酯可調(diào)控細(xì)胞周期、降低細(xì)胞活力及遷移能力。本文檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)10 μmol/L穿心蓮內(nèi)酯干預(yù)的PC-3細(xì)胞活性降低，同時(shí)細(xì)胞凋亡率增加。

微小RNA(miRNA)是普遍存在于真核細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)源性非編碼RNA分子，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、胚胎發(fā)育、免疫應(yīng)答等生物過(guò)程，與多種人類疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)〔13〕。多項(xiàng)研究〔14，15〕表明，miRNA分子在腫瘤組織中異常表達(dá)，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白、凋亡相關(guān)蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶等多個(gè)靶基因表達(dá)，調(diào)控癌細(xì)胞的增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移，在腫瘤進(jìn)程中起促進(jìn)或抑制作用。miR-206是一種脊椎動(dòng)物特有的miRNA分子，定位于人6號(hào)染色體、小鼠1號(hào)染色體，不同物種間的miR-206序列存在高度保守性〔16〕；在胃癌、肺癌等多種腫瘤組織中呈低表達(dá)，能夠靶向調(diào)節(jié)細(xì)胞周期素D2、c-Met、蛋白激酶B等基因表達(dá)，阻滯細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲及血管生成，其表達(dá)水平與患者預(yù)后及總體生存率存在顯著的相關(guān)性〔17～19〕。在前列腺癌中，已有證據(jù)〔20〕表明，miR-206可通過(guò)調(diào)節(jié)鈣黏蛋白和波形蛋白表達(dá)，抑制細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究采用qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-206在前列腺癌組織中低表達(dá)，穿心蓮內(nèi)酯干預(yù)可促進(jìn)PC-3細(xì)胞中miR-206表達(dá)。在PC-3細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-206能夠降低細(xì)胞活性并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；抑制miR-206表達(dá)可逆轉(zhuǎn)穿心蓮內(nèi)酯對(duì)細(xì)胞活性的抑制及凋亡的促進(jìn)作用。通過(guò)Targetscan在線預(yù)測(cè)和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證表明，STC2是miR-206的靶基因。

STC是一種糖蛋白激素，首次發(fā)現(xiàn)于硬骨魚中，以自分泌和旁分泌的方式參與機(jī)體生理功能，根據(jù)氨基酸序列差異可分為STC1和STC2〔21〕。STC2含302個(gè)氨基酸殘基，定位于染色體5q35，在多種哺乳動(dòng)物組織中均有表達(dá)。據(jù)報(bào)道〔22，23〕，STC2在腎細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌等多種人類腫瘤組織中高表達(dá)，且STC2高表達(dá)的患者總體生存率低于STC2低表達(dá)的患者，其表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小、腫瘤分期相關(guān)。Miyazaki等〔24〕研究發(fā)現(xiàn)，敲除STC2能夠顯著抑制低氧條件下的結(jié)直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移；Wang等〔25〕研究發(fā)現(xiàn)，STC2能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)，促進(jìn)肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖和遷移，起癌蛋白的作用。在前列腺癌中，已有證據(jù)〔26〕表明：STC2在前列腺癌組織中高表達(dá)，采用RNAi技術(shù)沉默STC2能夠抑制前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)；反之，過(guò)表達(dá)STC2則顯著促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化法檢測(cè)前列腺癌組織中STC2表達(dá)發(fā)現(xiàn)，對(duì)比癌旁組織，前列腺癌組織中STC2表達(dá)顯著升高，與上述結(jié)論〔26〕一致；穿心蓮內(nèi)酯能夠上調(diào)PC-3細(xì)胞中STC2 mRNA和蛋白表達(dá)，將miR-206抑制物轉(zhuǎn)染至PC-3細(xì)胞則逆轉(zhuǎn)穿心蓮內(nèi)酯對(duì)STC2表達(dá)的促進(jìn)作用。

綜上所述，在前列腺癌組織中miR-206低表達(dá)而STC2高表達(dá)，穿心蓮內(nèi)酯能夠通過(guò)上調(diào)miR-206水平靶向抑制STC2表達(dá)，從而抑制PC-3細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；這一研究結(jié)果為穿心蓮內(nèi)酯在前列腺癌中的深入研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。