杜愛林 姚良雪 崔展閣 秦浩志 韓家鑫 任靜茹 張瑞嶺

(1新鄉(xiāng)醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院 河南省生物精神病學重點實驗室，河南 新鄉(xiāng) 453003；2新鄉(xiāng)醫(yī)學院生理學與神經(jīng)生物學教研室 中英腦功能損傷聯(lián)合實驗室 河南省高校腦研究重點實驗室培育基地)

酒精具有脂溶性和神經(jīng)親和力，可迅速通過神經(jīng)細胞膜及血腦屏障〔1〕，腦組織是酒精重要的靶器官，最易受到傷害。研究表明,酒精中毒可能涉及的神經(jīng)解剖部位包括海馬、杏仁核等。酒精引起的腦功能損害在海馬中較為顯著〔2〕，可抑制海馬部位神經(jīng)元的成熟分化，從而造成學習記憶功能失調(diào)〔3〕。并有研究證實，杏仁核在酒精所致焦慮行為中起主要作用〔4〕，在正常生理濃度范圍的硫化氫(H2S)可以擴張血管，提高學習記憶水平〔5〕，內(nèi)源性H2S濃度升高到一定水平，便對細胞產(chǎn)生毒性損傷作用〔6〕。慢性酒精中毒可激活胱硫醚-β-合成酶(CBS),催化H2S的大量形成〔7〕；氨基羥乙酸(AOAA)是CBS活性抑制劑，可使H2S含量減少，緩解慢性酒精中毒導致的神經(jīng)細胞損傷〔8〕。本實驗觀察AOAA作用于慢性酒精中毒大鼠后海馬杏仁核內(nèi)H2S和CBS的含量及大鼠學習記憶能力的變化，探討AOAA對慢性酒精中毒大鼠組織損傷和行為的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物和分組 清潔級健康SD雄性大鼠60只(由新鄉(xiāng)醫(yī)學院動物中心提供),3～4周齡，體重120～60 g。實驗開始前大鼠于22～25℃實驗室中適應性飼養(yǎng)4～6 d，隨后隨機分為正常對照(NC)組、慢性酒精中毒模型(M)組、AOAA治療(AR)組各20只。

1.2主要儀器和試劑 Morris水迷宮和行為學記錄軟件EthoVision XT 8購于德國Noldus公司；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒，鏈霉卵白素工作液,山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G聚合物,封閉用正常山羊血清工作液，由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；Bio-TekELx800全自動酶標儀購自美國Bio-Tek公司；AOAA購自美國ACROS公司；微量加樣器購自德國Eppendorf公司；高速冷凍離心機購自德國Heraeus公司；FA1004電子分析天平購自上海瀘奧明科學儀器有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)或進口分析純級。

1.3模型制作和處理 除NC組外，其余組復制慢性酒精中毒動物模型，把酒精與純凈水混合配成含體積分數(shù)為 6%(V/V) 酒精的水溶液作為唯一飲水來源， 24 h自由飲用， 室溫控制在22～25℃，酒精溶液每日9∶00進行配制，置換，任意進食。14 d后，把AOAA按5 mg/kg比例溶解在1 ml的生理鹽水中，每日腹腔注射1次，AR組注射劑量為5 mg/kg，NC組注射1 ml的生理鹽水，持續(xù)注射14 d。

1.4學習記憶能力評價 實驗前1 d，檢測游泳能力，剔除游泳能力極差的。剩下的每組隨機選16只進行水迷宮實驗。訓練前，一個平臺被淹沒在水面以下0.5 cm，控制水溫在18.0～22.0℃，進行定位航行試驗。實驗時長4 d，每天相同時間點進行實驗，記錄游泳軌跡，并進行信號的記錄與分析。每只每天訓練4次，每個象限1次。每次訓練60 s,若在60 s內(nèi)找到水下平臺，讓其停留在平臺上30 s,以鞏固其記憶，若60 s內(nèi)沒有找到水下平臺，則將其引導至水下平臺停留30 s，讓其根據(jù)4個象限不同的參照物進行空間學習記憶。定位航行實驗結(jié)束后進行空間探索實驗，該實驗只進行1次，目的是測量在空間位置記憶形成后的定位保持能力。此次實驗將水下平臺移除，在原平臺所在象限的對側(cè)分別釋放大鼠，每組游泳時長均為300 s，在規(guī)定時間內(nèi)，檢測穿越平臺次數(shù)和平臺所在象限游泳距離的比重。水迷宮實驗最后1 d，處死大鼠，每組隨機抽取8只進行免疫組化實驗，剩余8只測定海馬杏仁核H2S。

1.5海馬H2S含量的測定采用亞甲基藍分光光度法 將海馬杏仁核組織置在-20℃溫度下用研磨管充分研磨，后倒入5 ml的玻璃試管內(nèi)，用放在冰中預冷的50 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH=8.0)勻漿(1.2 g/L)，4℃下12 000 r/min離心10 min，離心后吸取0.1 ml的上清液，轉(zhuǎn)至另一個離心管中，室溫下，向其加入0.5 ml 1%的醋酸鋅溶液，振蕩混勻，孵育10 min，再依次向其加入0.5 ml 20 mmol/L的N，N-二甲基苯二胺溶液和0.5 ml 30 mmol/L的三氯化鐵溶液，室溫下孵育20 min使其充分顯色，再加入2.5 ml三蒸水和1 ml 10%的三氯乙酸終止反應，進而離心(6 000 r/min，4℃，10 min)，取出其清澈的上清液，Bio-TekELx800全自動酶標儀測定波長670 nm處上清液的吸光度，依據(jù)H2S標準曲線計算出溶液中H2S含量，用單位重量組織H2S的量表示海馬和杏仁核組織中H2S的含量。

1.6免疫組化觀察海馬杏仁核CBS表達 各組依次進行4%多聚甲醛(4℃) 灌注，斷頭取腦，固定，石蠟包埋和切片，石蠟切片需要脫蠟和水化，目的是讓抗體等其他的試劑能夠充分地與組織中抗原結(jié)合，使其發(fā)生反應，再使用水浴抗原修復法進行抗原修復，暴露出抗原決定簇，使用3%的H2O2去離子水清除內(nèi)源性過氧化物酶活性。之后，加入試劑A(封閉用正常山羊血清工作液)封閉非特異性蛋白進行一抗孵育，再加入試劑B(SP-0023：生物素標記山羊抗兔IgG)進行二抗孵育，進而加入試劑C(辣根酶標記鏈霉卵白素工作液)，進行DAB顯色，最后進行常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片，通過顯微鏡觀察雙側(cè)海馬、杏仁核并且攝片。

1.7統(tǒng)計學分析 采用SPSS13.0軟件進行配對t檢驗、獨立樣本t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組學習記憶成績 與NC組相比，M組學習和記憶能力明顯降低,表現(xiàn)為第2～4天潛伏期和游泳距離的顯著增多(P<0.01)；與M組相比，AR組潛伏期和游泳距離明顯減少,第2～4天有極顯著性差異(P<0.01)。 見表1。

表1 各組學習記憶能力

與NC組比較：1)P<0.01；與M組比較：2)P<0.01；下表同

2.2光鏡觀察各組海馬組織、杏仁核組織中CBS表達 各組海馬組織、杏仁核組織均可見一定量CBS表達。與NC組相比，M組CBS含量顯著升高(P<0.01)；與M組相比，AR組CBS含量顯著降低(P<0.01)。見表2、圖1。

表2 各組海馬組織、杏仁核組織中CBS平均光密度值

NC組海馬組織

M組海馬組織

M組杏仁組織

AR組杏仁組織

2.3各組海馬組織、杏仁核組織中H2S的含量 與NC組相比，M組海馬組織、杏仁核組織內(nèi)的H2S含量明顯增高(P<0.01)；與M組相比，AR組海馬組織、杏仁核組織中H2S含量均顯著降低(P<0.01)。見表3。

表3 各組海馬組織、杏仁核組織中H2S含量

3 討 論

慢性酒精中毒發(fā)病率在全球病死和致殘的危險因素的排名中位列第3〔9〕。長期大量飲酒可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)的廣泛性損害〔10〕。腦海馬區(qū)是調(diào)控學習記憶功能的結(jié)構(gòu)基礎。杏仁核具有情緒調(diào)控和場景相關記憶的建立功能〔11〕。杏仁核中外側(cè)核(LA)是產(chǎn)生長時程增強效應(LTP)記憶的重要位置〔12〕，雙側(cè)杏仁核海馬均增強情緒記憶效應，這種固化增強作用是情緒信息由杏仁核作用于內(nèi)側(cè)顳葉記憶系統(tǒng)，進一步調(diào)節(jié)記憶固化作用——情緒調(diào)節(jié)假說〔13〕。當條件刺激LA，會產(chǎn)生LTP，若含有場景信息，則會與海馬產(chǎn)生關聯(lián)，進而在海馬內(nèi)誘導LTP，產(chǎn)生相對穩(wěn)定的場景情緒記憶；同時海馬也可以通過刺激杏仁核內(nèi)基底核、附屬基底核來調(diào)節(jié)信息傳遞〔14〕。以往實驗證實在LA和海馬內(nèi)加入蛋白質(zhì)合成阻斷劑可阻礙記憶的鞏固，說明杏仁核可以鞏固海馬的記憶〔15〕。

Morris水迷宮是一種研究海馬功能相關的空間學習記憶模型〔16～18〕。測試逃避潛伏期、游泳距離等指標〔19〕，能探究動物對空間方向感和位置感的記憶和學習能力〔18〕。本研究提示酒精中毒模型大鼠空間學習記憶能力降低。而給予AOAA對慢性酒精中毒大鼠的記憶認知功能有明顯的改善作用。

H2S是繼一氧化氮和一氧化碳之后的第3類氣體信號分子〔20〕，具有神經(jīng)保護效應和生物學效應〔21，22〕，與學習記憶過程和情緒調(diào)控相關〔23， 24〕。生理濃度的 H2S能易化海馬LTP來調(diào)節(jié)海馬依賴的情景型恐懼記憶和新物體認知能力〔23〕，杏仁核制造并調(diào)節(jié)情緒學習和記憶〔25，26〕。此外 H2S主要在CBS的催化下以 L 型半胱氨酸和高半胱氨酸為底物生成〔27〕。CBS的表達及活性直接關系腦內(nèi) H2S水平〔28〕。慢性酒精中毒可以激活CBS,催化H2S的大量形成。本研究顯示AOAA可能通過抑制CBS活性減少腦內(nèi)H2S的生成。