龍哲，王旭，侯偉建，楊丹，5

（1. 東北大學(xué)中荷生物醫(yī)學(xué)信息與工程學(xué)院，沈陽 110819； 2. 中國醫(yī)科大學(xué)公共基礎(chǔ)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程教研室，沈陽 110122；3. 東北大學(xué)信息科學(xué)與工程學(xué)院，沈陽 110819；4. 中國醫(yī)科大學(xué)公共基礎(chǔ)學(xué)院組織工程學(xué)教研室，沈陽 110122；5. 東北大學(xué)智能工業(yè)數(shù)據(jù)解析與優(yōu)化教育部重點實驗室，沈陽 110819）

隨著科技的發(fā)展，生活環(huán)境中電磁場分布日益 復(fù)雜，電磁場對生命健康的影響越來越受到關(guān)注。近年來流行病學(xué)研究［1-3］發(fā)現(xiàn)，電磁場曝露可能誘發(fā)多種疾病，并且與電磁場類型、曝露的強度和時間均有關(guān)系。極低頻電磁場可誘導(dǎo)小鼠腦和肝細(xì)胞凋亡［4］。低頻交變電磁場影響大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及分化［5］。低頻脈沖電磁場通過激活絲裂原活化蛋白激酶 （mitogen-activated protein kinase，MAPK） 信號通路促進成肌細(xì)胞增殖作用［6］。

MAPK家族是將信號從細(xì)胞表面轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核的重要傳遞者，c-Jun氨基末端激酶 （c-Jun N-terminal kinase，JNK） 和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶 （extracellular signal regulated kinase，ERK） 是MAPK家族的主要成員。當(dāng)機體受外界刺激，細(xì)胞內(nèi)JNK和ERK蛋白磷酸化水平發(fā)生改變，參與增殖、分化、代謝和氧化應(yīng)激等細(xì)胞活動［7-9］。50 Hz極低頻電磁場曝露的人黑素細(xì)胞，能夠抑制JNK和ERK磷酸化水平，促進黑色素的產(chǎn)生［10］。人表皮細(xì)胞HaCaT經(jīng)中波紫外線照射后，JNK和ERK磷酸化水平上升，MAPK信號通路產(chǎn)生活化效應(yīng)［11］。

本研究通過對HT22細(xì)胞進行3種強度工頻電磁場短時曝露，觀察不同強度電磁場曝露對細(xì)胞的增殖、凋亡及JNK和ERK磷酸化水平的影響，進而為工頻電磁場安全閾值的確立提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系HT22購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。DMEM-H培養(yǎng)基購自美國HyClone公司；胰蛋白酶、胎牛血清購自美國Gibico公司；細(xì)胞增殖檢測試劑盒購自美國Biovision公司；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自南京諾唯贊公司；p-JNK抗體、p-ERK抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗IgG （H+L） 購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系HT22采用含10%胎牛血清的DMEM-H培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。采用對數(shù)生長期的細(xì)胞進行實驗。

1.2.2 工頻電磁場刺激：利用工頻電磁場發(fā)生器 （東北大學(xué)電子科學(xué)與信息光學(xué)研究所自行研制） ，將HT22細(xì)胞隨機分成4組，其中1組為對照組，不作任何處理，其余3組為實驗組，分別曝露于強度為10、20、30 mT的工頻電磁場中，20 min/d，連續(xù)3 d。

1.2.3 細(xì)胞增殖檢測：將經(jīng)曝露的各組HT22細(xì)胞分別接種于96孔板中，密度為5×103/孔，37℃、5% CO2孵育24、48、72 h后，每孔加入MTS試劑20 μL，孵育2 h，利用全自動酶標(biāo)儀測量490 nm處各孔的OD值。

1.2.4 細(xì)胞凋亡檢測：收集經(jīng)曝露的各組HT22細(xì)胞，PBS漂洗后，計數(shù)5×105個，離心，加入500 μL Binding buffer重 懸 細(xì) 胞 后，加 入5 μL Annexin V-FITC，混勻，再加入10 μL PI染液，再次混勻，室溫避光染色10 min，用流式細(xì)胞儀進行檢測。

1.2.5 Western blotting檢測：收集經(jīng)曝露的各組HT22細(xì)胞，加入適量RIPA裂解液離心提取總蛋白，用Bradford法檢測蛋白濃度。各組取30 μg蛋白經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%牛血清白蛋白封閉2 h，加入一抗4℃過夜，TBST漂洗3 次，每次5 min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗IgG （H+L） 孵育2 h，TBST漂洗3 次，每次5 min，利用ECL成像系統(tǒng)進行顯影。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同強度電磁場曝露后對HT22細(xì)胞形態(tài)的影響

大部分HT22細(xì)胞形態(tài)舒展，貼壁分布均勻。經(jīng)電磁場曝露后細(xì)胞生長迅速，細(xì)胞增多，細(xì)胞排列密集。見圖1。

圖1 HT22細(xì)胞經(jīng)不同強度電磁場曝露后3 d的形態(tài)變化 ×200Fig.1 Morphology of HT22 cells with and without exposure to magnetic fields for three days ×200

2.2 不同強度電磁場曝露后對HT22細(xì)胞增殖的影響

MTS結(jié)果顯示，HT22細(xì)胞經(jīng)不同強度電磁場曝露后，均明顯促進細(xì)胞增殖。電磁場曝露后24 h，細(xì)胞生長活力最強，之后隨時間延長，增殖活力降低，但仍顯著高于對照組。20 mT組促進生長增殖效果最顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P ＜ 0.01） 。電磁場強度和細(xì)胞生長增殖率呈非線性依賴關(guān)系。見表1。

表1 各組HT22細(xì)胞增殖率 （%） Tab.1 Cell proliferation in each group （%）

2.3 不同強度電磁場曝露后對HT22細(xì)胞凋亡的影響

Annexin V-FITC/PI雙染后，流式細(xì)胞儀檢測不同強度工頻電磁場曝露后HT22細(xì)胞凋亡的變化。與對照組相比，10 mT組凋亡率為2.32%±0.04%，20 mT組凋亡率為2.55%±0.06%，30 mT組凋亡率為2.17%±0.03%。隨著曝露電磁場強度增加，各實驗組細(xì)胞凋亡率未見明顯變化。工頻電磁場10 mT、20 mT和30 mT均未誘導(dǎo)HT22細(xì)胞凋亡。

2.4 不同強度電磁場曝露后對HT22細(xì)胞p-JNK與p-ERK表達(dá)的影響

Western blotting結(jié)果顯示，不同強度電磁場曝露后HT22細(xì)胞p-JNK與p-ERK表達(dá)均明顯升高。見圖2。

圖2 Western blotting檢測p-JNK和p-ERK表達(dá)水平Fig.2 Western blotting analysis of p-JNK and p-ERK expression

3 討論

近年來，電磁場的安全性受到研究人員的廣泛關(guān)注，國際腫瘤研究中心機構(gòu)將工頻電磁場分類為“懷疑對人體致癌的”。但是，國際非電離輻射防護委員會發(fā)表的《限制時變電場和磁場曝露的導(dǎo)則》中認(rèn)為工頻電磁場與生物體之間的作用機制尚不明確，對癌癥發(fā)生缺乏已確定的因果關(guān)系。電磁場作為一種外加的物理因子，作用于細(xì)胞的機制非常復(fù)雜，已有的研究表明，磁場類型、曝露方式、曝露時間的不同對細(xì)胞的增殖、凋亡、信號通路等影響各不相同［12-13］。研究［14］表明，5 mT強度脈沖電磁場可以增強人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力，促進血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖。但是也有研究［15］表明，1.10～4.10 mT強度的固定頻率脈沖電磁場對小鼠成骨樣細(xì)胞MC3T3-E1的增殖能力無明顯影響。本研究利用工頻電磁場0、10、20、30 mT曝露HT22細(xì)胞，觀察到10、20、30 mT明顯促進HT22細(xì)胞的增殖，這與湯翔宇等［16］報道的結(jié)果 （BMSC細(xì)胞） 類似。在3種強度作用下，20 mT強度電磁場曝露對HT22細(xì)胞增殖促進作用最強。

JNK和ERK作為MAPK的主要成員，可被電離輻射、生長因子、滲透壓、細(xì)胞因子等多種外界刺激激活，并在細(xì)胞增殖、凋亡和分化等過程中起到關(guān)鍵作用［17］。王蕾等［18］采用化學(xué)動力學(xué)方程構(gòu)建與電磁場敏感ERK相關(guān)的MAPK信號模型，得出電磁場可以激活ERK通路。本研究結(jié)果表明，工頻電磁場10、20、30 mT曝露HT22細(xì)胞可以使其JNK、ERK磷酸化水平增高，這與孫文鈞等［19］研究中0.4 mT和0.8 mT工頻電磁場可以激活JNK、使其磷酸化報道結(jié)果類似。

MAPK是一種存在于大多數(shù)細(xì)胞中的胞內(nèi)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。MAPK信號途徑使真核細(xì)胞能夠?qū)⒓?xì)胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)胞反應(yīng)，并通過影響基因的轉(zhuǎn)錄和調(diào)控，影響細(xì)胞的生物學(xué)行為 （如增殖、分化、轉(zhuǎn)化、凋亡等） 。JNK受到外界刺激后被活化轉(zhuǎn)到細(xì)胞核內(nèi)，使其下游底物氨基末端激酶蛋白等磷酸化，參與多種外界刺激的應(yīng)激反應(yīng)，與細(xì)胞增殖凋亡密切相關(guān)；ERK廣泛存在于各種組織中，活化后可將信號轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞核，其活性增高與持續(xù)時間的長短決定對刺激的反應(yīng)形式，對細(xì)胞增殖、生長和分化等方面有重要的調(diào)節(jié)作用［20］。補骨脂素可以通過劑量依賴方式刺激成骨細(xì)胞增殖，并且增加p-JNK和p-ERK的表達(dá)，特異性的抑制JNK和ERK的磷酸化可以有效地抑制補骨脂素對成骨細(xì)胞的增殖作用［21］。醋酸艾塞那肽可以通過激活JNK和ERK的磷酸化，促進大鼠脂肪來源干細(xì)胞的增殖［22］。

綜上所述，本研究認(rèn)為10 mT、20 mT和30 mT這3種強度工頻電磁場曝露可能通過調(diào)控ERK和JNK的活化促進HT22細(xì)胞增殖。但是由于生物多樣性和電磁場復(fù)雜度的原因，工頻電磁場曝露通過調(diào)控ERK和JNK的活化促進細(xì)胞增殖還需要更多的實驗結(jié)果證明。