曹翠平，張耀杰，朱成聰，張瑜

（ 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院老年病科，沈陽(yáng) 110001）

糖尿病腎病是糖尿病最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致我國(guó)終末期腎臟疾病的第二大病因［1］，其發(fā)病率逐年升高。隨著疾病的進(jìn)展，腎臟病變不可逆轉(zhuǎn)，雖積極控制危險(xiǎn)因素，但糖尿病腎病控制情況仍不理想。早期診治是延緩腎臟病變的有效手段，在蛋白尿這個(gè)經(jīng)典診斷指標(biāo)的基礎(chǔ)上，近年來(lái)不斷發(fā)現(xiàn)新的預(yù)測(cè)指標(biāo)。但研究發(fā)現(xiàn)這些指標(biāo)的敏感度和特異度不能很好的兼顧，因此探究新的預(yù)測(cè)指標(biāo)仍是目前的研究熱點(diǎn)。

沉默信息調(diào)節(jié)蛋白4 （sirtuin 4，SIRT4） 是沉默信息調(diào)節(jié)因子2家族的一員，是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性高度保守的酶。在對(duì)SIRT4的初始研究中，僅發(fā)現(xiàn)腺苷二磷酸-核糖轉(zhuǎn)移酶活性，近年發(fā)現(xiàn)其還有去乙酰酶活性［2-3］。SIRT4通過(guò)作用于不同底物，廣泛參與生物代謝過(guò)程。糖脂代謝紊亂是糖尿病的危險(xiǎn)因素，也是促進(jìn)糖尿病腎病發(fā)展的主要原因。SIRT4作為一種調(diào)控糖脂代謝的蛋白酶，既往研究［4-7］發(fā)現(xiàn)其在糖尿病狀態(tài)下及腎臟損傷時(shí)低表達(dá)，有理由推測(cè)SIRT4與糖尿病腎病相關(guān)。因此，研究SIRT4在糖尿病腎病不同時(shí)期的表達(dá)極為重要。本研究通過(guò)檢測(cè)健康體檢者及糖尿病腎病患者外周血中SIRT4的表達(dá)水平，旨在探究SIRT4是否與糖尿病腎病存在相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

RNAiso Plus試劑盒、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒、SYBR Premix Ex Taq試劑盒、BCA試劑盒 （日本TaKaRa公司）；anti-SIRT4抗體、驢抗山羊IgG （英國(guó)Acbam公司）；ECL發(fā)光試劑盒 （美國(guó)Thermo公司）?；蛞?（日本TaKaRa公司）：SIRT4，上游引物序列：5’-TCCACGGATGCATGGACA-3’，下游引物序列：5’-TCAGGACTTGAAACGCTCTTG-3’；GAPDH上游引物序列：5’-GCACCGTCAAGGCTGAG AAC-3’，下游引物序列：5’-TGGTGAAGACGCCAGT GGA-3’。

1.2 研究對(duì)象及分組

在2017年10月至2018年4月中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院干診門診和內(nèi)分泌病房診治的患者中，參照美國(guó)糖尿病學(xué)會(huì)2012年推薦的篩查及診斷微量白蛋白尿［尿白蛋白/肌酐比值 （urine albumin/creatinine ratio，UACR） ］的方法篩選出正常蛋白尿組 （A組，UACR＜30 mg/g，n = 30）、早期糖尿病腎病組 （B組，UACR 30～300 mg/g，n = 30）、臨床糖尿病腎病組 （C組，UACR＞300 mg/g，n = 30），共90例 符 合1999年世界衛(wèi)生組織糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)的糖尿病患者。并選取同期于健康體檢中心體檢的30例健康體檢者作為健康對(duì)照組。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并糖尿病急性并發(fā)癥，合并泌尿系感染或者其他腎臟疾病，頑固性高血壓或正在使用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、血管緊張素Ⅱ受體阻斷劑類藥物，近期使用腎毒性藥物，合并惡性腫瘤或嚴(yán)重感染，合并嚴(yán)重心腦血管疾病，未合并糖尿病視網(wǎng)膜病變。

1.3 研究方法

1.3.1 資料收集：收集患者基本資料及當(dāng)次就診時(shí)化驗(yàn)的生化指標(biāo)，包括年齡、性別、糖尿病病程、收縮壓、舒張壓、體質(zhì)量指數(shù) （body mass index，BMI）、空腹血糖、糖化血紅蛋白、血肌酐、胱抑素C、總膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白膽固醇，并采集患者當(dāng)次就診的隨機(jī)尿進(jìn)行尿微量白蛋白與尿肌酐的測(cè)定，計(jì)算估算腎小球?yàn)V過(guò)率。

1.3.2 收集樣本：所有研究對(duì)象于空腹?fàn)顟B(tài)采集外周靜脈血，存于-80℃冰箱中，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR：按照試劑盒步驟提取總RNA，檢測(cè)RNA濃度后測(cè)定其純度，隨后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq 25 μL，cDNA溶液4 μL，ROX Reference Dye （50×） 1 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，RNase Free dH2O 18 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s；60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。分析擴(kuò)增曲線及融解曲線，計(jì)算結(jié)果。

1.3.4 Western blotting：提取細(xì)胞總蛋白，BCA方法檢測(cè)蛋白濃度，進(jìn)行SDS-PAGE，取待測(cè)樣品上樣，80 V恒壓電泳，待溴酚藍(lán)達(dá)到分離膠界面時(shí)，更改為電泳參數(shù)為120 V恒壓電泳，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，TBST溶液沖洗后，牛血清白蛋白溶液封閉，隨后加入1∶1 000稀釋的SIRT4一抗，孵育過(guò)夜，TBST洗膜，之后加入1∶1 000稀釋的二抗，室溫下孵育2 h，TBST洗膜，洗滌結(jié)束后將PVDF膜放于凝膠成像分析系統(tǒng)中，于膜上滴加ECL工作液 （A液與B液的比例為1∶1），隨后曝光，采集圖像。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有資料采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。計(jì)量資料采用表示，組間比較采用單因素方差分析及非參數(shù)檢驗(yàn)，血SIRT4與各因素的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組間一般資料的比較

各組間比較，性別、年齡、收縮壓、舒張壓、糖化血紅蛋白、總膽固醇的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＞ 0.05）；C組糖尿病病程、低密度脂蛋白膽固醇較A組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜ 0.05）；C組BMI高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜ 0.05）；A組、B組、C組空腹血糖高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜ 0.05）；C組肌酐、胱抑素C、甘油三酯高于健康對(duì)照組和A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜ 0.05）；C組估算腎小球?yàn)V過(guò)率低于健康對(duì)照組和A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜ 0.05）；C組和B組UACR高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜ 0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組間一般臨床資料的比較Tab.1 Comparison of the clinical characteristics of the four groups

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果

A、B、C組以及健康對(duì)照組SIRT4 mRNA表達(dá)水平分別為1.12±0.13、0.81±0.07、0.63±0.09、0.20±0.07。C組和B組SIRT4 mRNA的表達(dá)低于健康對(duì)照組和A組，A組SIRT4 mRNA表達(dá)低于健康對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜ 0.05）。

2.3 Western blotting結(jié)果

A、B、C組以及健康對(duì)照組SIRT4 蛋白的表達(dá)水平分別為0.48±0.04、 0.39±0.05、0.29±0.04、0.19±0.02。C組和B組SIRT4蛋白的表達(dá)水平低于健康對(duì)照組和A組，A組SIRT4蛋白的表達(dá)水平低于健康對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜ 0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 各組SIRT4蛋白的表達(dá)情況Fig.1 SIRT4 protein expression in the four groups

2.4 SIRT4與各項(xiàng)指標(biāo)的相關(guān)性分析

SIRT4與空腹血糖 （r = -0.424，P ＜ 0.001）、糖尿病病程 （r = -0.382，P ＜ 0.001）、BMI （r = -0.310，P = 0.001）、年齡 （r = -0.198，P = 0.039）、總膽固醇 （r = -0.237，P = 0.009）、甘油三酯 （r = -0.432，P ＜ 0.001）、血肌酐 （r = -0.394， P ＜ 0.001）、 UACR （r = -0.915，P ＜ 0.001）、胱抑素C （r = -0.391，P ＜ 0.001） 呈負(fù)相關(guān)，與估算腎小球?yàn)V過(guò)率 （r = 0.404，P ＜ 0.001） 呈正相關(guān)。

3 討論

糖尿病腎病是糖尿病患者最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一。強(qiáng)化血糖、血壓、血脂的控制對(duì)于預(yù)防糖尿病腎病是有效的［8］，但仍可發(fā)現(xiàn)糖尿病腎病的患病人數(shù)呈上升趨勢(shì)。早期診治對(duì)于延緩糖尿病腎病進(jìn)展至關(guān)重要，因此尋找臨床價(jià)值更高的早期診斷指標(biāo)一直是目前研究的重點(diǎn)。

糖代謝紊亂是糖尿病腎病的一大特點(diǎn)，本研究中糖尿病各組的血糖均明顯高于健康對(duì)照組，說(shuō)明控制血糖也是糖尿病腎病患者的首要任務(wù)之一。SHI等［5］研究發(fā)現(xiàn)在葡萄糖誘導(dǎo)的小鼠中，作為濾過(guò)屏障主要成分的足細(xì)胞凋亡以濃度依賴性增加，足細(xì)胞凋亡增加提示腎臟有損傷，與本研究結(jié)果相符，血糖控制不佳會(huì)成為促進(jìn)腎功能下降的一大危險(xiǎn)因素。

正常蛋白尿期說(shuō)明患者尚未發(fā)展為糖尿病腎病，當(dāng)UACR＞300 mg/g時(shí)說(shuō)明此時(shí)腎臟已經(jīng)明顯損傷，本研究發(fā)現(xiàn)臨床糖尿病腎病組患者低密度脂蛋白與總膽固醇均較正常蛋白尿組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明糖尿病腎病進(jìn)展與脂代謝異常存在相關(guān)性。自1982年“脂質(zhì)腎毒性”假說(shuō)提出后，至今已有多個(gè)研究表明脂代謝異?？纱龠M(jìn)糖尿病腎病的進(jìn)展［9］。提示糖尿病腎病患者應(yīng)注意控制血脂。

本研究發(fā)現(xiàn)，臨床糖尿病腎病組糖尿病病程高于正常蛋白尿組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。糖尿病腎病是在糖尿病患者代謝紊亂的基礎(chǔ)上受到多種危險(xiǎn)因素作用，導(dǎo)致功能下降甚至功能衰竭。隨著糖尿病患者患病時(shí)間的延長(zhǎng)，腎臟受到危險(xiǎn)因素作用的時(shí)間延長(zhǎng)，損傷逐漸加重。既往研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者出現(xiàn)蛋白尿多在其發(fā)病的5年后，而進(jìn)入臨床蛋白尿則大約需要10～15年，說(shuō)明糖尿病病程的長(zhǎng)短與糖尿病腎病的進(jìn)展密切相關(guān)。

本研究中糖尿病各組SIRT4 mRNA及蛋白的表達(dá)均低于健康對(duì)照組，且糖尿病各組中隨著尿蛋白排泄率的增加，SIRT4表達(dá)呈逐漸下降趨勢(shì)，說(shuō)明SIRT4在糖尿病腎病患者不同時(shí)期的變化是有意義的。尿蛋白排泄率目前是篩查早期糖尿病腎病的最受認(rèn)可的指標(biāo)之一，正常蛋白尿說(shuō)明尚未發(fā)展成為糖尿病腎病，但如未及時(shí)診治，則非常有可能發(fā)展為糖尿病腎病。本研究中SIRT4在UACR處于正常水平即正常蛋白尿時(shí)期就出現(xiàn)了表達(dá)減少的趨勢(shì)，因此推測(cè)SIRT4可能作為腎臟損傷的早期標(biāo)志物。

本研究中，SIRT4與總膽固醇、甘油三酯呈負(fù)相關(guān)，同時(shí)隨著腎功能下降，SIRT4表達(dá)減少。SIRT4具有ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶活性，可以抑制脂肪酸氧化過(guò)程中的丙二酰輔酶A脫羧酶活性，進(jìn)而抑制脂肪酸氧化過(guò)程。因此，有理由推測(cè)SIRT4可能通過(guò)調(diào)控脂代謝而影響糖尿病腎病的進(jìn)展。

SIRT4可以參與調(diào)節(jié)脂肪酸氧化、活性氧的產(chǎn)生、胰島素抵抗、足細(xì)胞凋亡等過(guò)程，上述過(guò)程均與糖尿病腎病的進(jìn)展相關(guān)［10］。本研究發(fā)現(xiàn)SIRT4與血糖、糖尿病病程、BMI、膽固醇、甘油三酯水平呈負(fù)相關(guān)，且隨著尿蛋白排泄率增加而表達(dá)減少，說(shuō)明SIRT4在體內(nèi)可能是通過(guò)參與調(diào)控上述生物過(guò)程影響糖尿病腎病進(jìn)展。

本研究中SIRT4表達(dá)水平與 UACR、血肌酐、胱抑素C呈負(fù)相關(guān)，與估算腎小球?yàn)V過(guò)率呈正相關(guān)，而上述指標(biāo)均可以在一定程度上反映腎臟功能，說(shuō)明SIRT4在一定程度上也可以反映腎臟損傷的程度，有助于判斷疾病的進(jìn)展程度。