葉必宏，劉海飛，李靈浙，潘勝蓮，宋豐軍，王慶來，朱文宗

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬溫州市中醫(yī)院 針推理療科，浙江 溫州 325000）

抑郁癥是以情緒低落、快感缺失、行為遲緩等為主要特征的精神類疾病，重度抑郁癥患者會有明顯的自殺念頭及行為[1]。抑郁癥發(fā)病機(jī)制及其防治研究是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究的熱點，目前較為公認(rèn)的抑郁癥發(fā)病機(jī)制主要集中在單胺神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)營養(yǎng)、細(xì)胞因子等，而突觸可塑性變化在其中的關(guān)鍵作用也日益受到重視[2]。研究表明，抑郁癥模型大鼠腦內(nèi)多個位置伴隨著顯著的突觸可塑性下降，表現(xiàn)為結(jié)構(gòu)的缺失以及功能的失常，其中以海馬區(qū)研究最為廣泛[3]。電針是傳統(tǒng)中醫(yī)療法之一，治療抑郁癥等情緒疾病有其獨(dú)特優(yōu)勢，能夠減輕藥物的不良反應(yīng)，改善患者軀體化癥候群，穩(wěn)定患者情緒[4]。然而，盡管電針治療抑郁癥在臨床已廣泛使用，近年來基礎(chǔ)研究也快速發(fā)展，但更多集中于對動物行為學(xué)及生化指標(biāo)的探討，機(jī)制尚未深入。本研究采用經(jīng)典的CUMS抑郁模型，通過觀察電針對大鼠海馬區(qū)突觸結(jié)構(gòu)及可塑性蛋白表達(dá)的影響，深入探討其抗抑郁機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供更多的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠48只，體質(zhì)量為200～220 g，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，動物許可證號為SCXK（滬）2017-0005。整個實驗期間大鼠均飼養(yǎng)在SPF級標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境中，適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后開始正式實驗。

1.2 試劑與主要儀器 氟西?。绹Y來公司）；RIPA裂解液（美國Thermo公司）；兔抗大鼠SYN、PSD-95、CREB、BDNF多克隆抗體（英國Abcam公司）；蘇木素、伊紅（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；山羊抗兔IgG二抗（美國CST公司）；華佗牌一次性針灸針（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）；LH202型電針儀（北京華衛(wèi)醫(yī)藥有限責(zé)任公司）；光學(xué)顯微鏡（德國ZEISS公司）；核酸蛋白測定儀（英國BioDrop公司）；酶標(biāo)儀、組織切片機(jī)（美國Thermo公司）；凝膠成像分析儀（美國Bio-Rad公司）。

1.3 分組與造模 動物隨機(jī)分為4 組，包括對照組、模型組、電針組、氟西汀組，每組12只。采用慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）的方法建立抑郁大鼠模型，應(yīng)激方法包括夾尾（1 min）、冰?。? ℃，4 min）、熱水?。?0 ℃，4 min）、傾籠（24 h）、電擊（50 V，3 min）、晝夜顛倒（24 h）、禁水禁食（24 h），每天隨機(jī)采取其中一種應(yīng)激，同一種應(yīng)激不連續(xù)出現(xiàn)，共持續(xù)21 d。

1.4 治療與給藥 電針組于每日應(yīng)激造模前接受電針治療，穴位參照林文注主編的《實驗針灸學(xué)》分別選取百會、印堂穴進(jìn)行針刺，平刺進(jìn)針，深度約為6 mm，然后接電針儀，強(qiáng)度為1 mA，頻率為2 Hz，每次電針20 min，每日1次，連續(xù)21 d。氟西汀組則于每日應(yīng)激前灌胃給予抗抑郁西藥氟西汀，給藥劑量為10 mg/kg，灌胃體積為10 mL/kg，給藥21 d。對照組和模型組大鼠不予治療或給藥。

1.5 行為學(xué)測試

1.5.1 曠場測試：將大鼠放入黑色敞箱中央，待其在敞箱中自由活動1 min后，記錄接下來4 min內(nèi)大鼠的水平活動次數(shù)和垂直站立次數(shù)，以兩者之和作為大鼠的曠場評分。

1.5.2 強(qiáng)迫游泳實驗：將大鼠放入高50 cm透明圓柱形水缸中，水深約40 cm，水溫保持在（25±2）℃。待大鼠適應(yīng)1 min后，記錄接下來4 min內(nèi)大鼠的不動時間（兩前爪靜止且身體漂浮記為不動）。于應(yīng)激后7、14、21 d分別進(jìn)行曠場測試和強(qiáng)迫游泳實驗。

1.6 Golgi染色 行為學(xué)測試完成后，麻醉大鼠，剝離海馬，部分固定于4%多聚甲醛中用于病理組織觀察，另一部分速凍于液氮中用于分子生物學(xué)指標(biāo)檢測。取固定于4%多聚甲醛溶液中的海馬組織，用梯度濃度乙醇脫水后，將組織切成小塊，置于硝酸銀水溶液中完全浸泡鍍銀，在充分鍍銀后，以50 μm連續(xù)切片，漂洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，晾干后置于光學(xué)顯微鏡下觀察神經(jīng)元突觸形態(tài)。

1.7 Western blot實驗 取冷凍保存的海馬組織，加入5倍體積的RIPA裂解液，冰上勻漿，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液測定總蛋白含量。制備分離膠和濃縮膠，待膠凝固后上樣，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳完成后，轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上，室溫下封閉1 h，根據(jù)目的蛋白分子量裁剪條帶，加入稀釋后的一抗（SYN：1:1 000，PSD-95：1:1 000，CREB：1:1 000，BDNF：1:1 000，GAPDH：1:500），4 ℃孵育過夜。TBST洗滌4次，每次10 min，加入二抗（按1:2 000稀釋），室溫下孵育4 h，洗滌，ECL顯影。應(yīng)用Image J軟件分析各蛋白條帶灰度值，以目的蛋白/GAPDH灰度值計算蛋白相對表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量數(shù)據(jù)用表示，多組比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠曠場測試結(jié)果 與對照組比，模型組大鼠從應(yīng)激第14 天開始自主活動評分顯著下降（P＜0.05），至造模結(jié)束后下降更為明顯（P＜0.01）；經(jīng)電針治療后，大鼠自主活動評分和氟西汀組一樣較模型組顯著上升（P＜0.05），與氟西汀組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 各組大鼠強(qiáng)迫游泳實驗結(jié)果 與對照組比，模型組大鼠于應(yīng)激第7天起不動時間即顯著增加（P＜0.05）；經(jīng)電針治療14 d后，大鼠不動時間明顯下降（P＜0.05），在治療21 d后，不動時間下降更為明顯（P＜0.01）。見表2。

2.3 各組大鼠海馬Golgi染色結(jié)果 正常大鼠海馬神經(jīng)元豐富，樹突棘分枝較長，分布均一，排列整齊致密；模型組大鼠海馬神經(jīng)元排列散亂，樹突棘萎縮，分枝變短，稀疏無規(guī)則，突觸損傷明顯；經(jīng)電針和氟西汀治療后，模型大鼠神經(jīng)元突觸損傷情況得以緩解，表現(xiàn)為神經(jīng)元數(shù)量增加，樹突密度及長短逐漸恢復(fù)，排列整體有序。見圖1。

表1 各組大鼠曠場自主活動評分比較（每組n=12，±s）

表1 各組大鼠曠場自主活動評分比較（每組n=12，±s）

與對照組比：aP ＜0.05，bP ＜0.01；與模型組比：cP ＜0.05，dP ＜0.01

表2 各組大鼠強(qiáng)迫游泳不動時間比較（每組n=12，±s，s）

表2 各組大鼠強(qiáng)迫游泳不動時間比較（每組n=12，±s，s）

與對照組比：aP ＜0.05，bP ＜0.01；與模型組比：cP ＜0.05，dP ＜0.01

圖1 各組大鼠海馬神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)變化（×200）

2.4 各組大鼠海馬突觸可塑性蛋白表達(dá)情況 與對照組比，模型組大鼠海馬突觸可塑性相關(guān)蛋白SYN、PSD-95、CREB、BDNF表達(dá)均明顯下調(diào)（P＜0.01）；經(jīng)電針治療或氟西汀干預(yù)后，上述突觸可塑性蛋白的低表達(dá)情況均得到明顯逆轉(zhuǎn)（P＜0.01）。見圖2和表3。

3 討論

應(yīng)激與抑郁癥的發(fā)生密切相關(guān)，慢性、長期、強(qiáng)度不一的應(yīng)激源是導(dǎo)致抑郁產(chǎn)生并加速其發(fā)展的重要原因[5]。CUMS很好地擬合了人類抑郁癥的致病源，是國內(nèi)外通用的抑郁動物模型。臨床抑郁患者常伴有快感缺失、不愛運(yùn)動、精神萎靡、悲觀絕望等特征，依據(jù)此類特征已形成一系列公認(rèn)的抑郁動物模型的行為評估方法。在本研究中，21 d慢性應(yīng)激后，大鼠曠場自主活動評分顯著下降，同時強(qiáng)迫游泳不動時間顯著增加，表現(xiàn)出明顯的不愛活動、行為絕望等抑郁樣行為。經(jīng)電針或氟西汀治療后，大鼠的抑郁行為明顯減緩，體現(xiàn)了電針良好的抗抑郁療效。

圖2 各組大鼠海馬突觸可塑性蛋白電泳結(jié)果圖

表3 各組大鼠突觸可塑性蛋白相對表達(dá)量（每組n=6，±s）

表3 各組大鼠突觸可塑性蛋白相對表達(dá)量（每組n=6，±s）

與對照組比：aP ＜0.01；與模型組比：bP ＜0.01

突觸是神經(jīng)元間信息傳遞的基礎(chǔ)，神經(jīng)元通過突觸互相聯(lián)系，從而形成一個復(fù)雜的大腦信息處理網(wǎng)絡(luò)[6]。研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥等神經(jīng)精神類疾病均伴隨著明顯的突觸病理改變，包括結(jié)構(gòu)改變和功能改變[7]。突觸結(jié)構(gòu)改變通常為神經(jīng)元突觸的形態(tài)、密度異常，具體表現(xiàn)出樹突棘變短變細(xì)，數(shù)量稀疏，排列散亂。突觸功能改變以突觸可塑性下降為主要特征，包括調(diào)控可塑性的相關(guān)蛋白的含量變化。SYN和PSD-95分別位于突觸前、后膜，SYN是一種突觸素，其相對表達(dá)量一定程度上能決定突觸的數(shù)量和密度；PSD-95是突觸后致密區(qū)核心構(gòu)架蛋白之一，參與神經(jīng)元生長、突起形成和突觸可塑性調(diào)節(jié)等[8-9]。SYN和PSD-95的表達(dá)水平對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)神經(jīng)元間的正常信號傳遞起著關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用[10]。CREB是一種反應(yīng)元件結(jié)合蛋白，其mRNA表達(dá)水平能決定突觸可塑性的功能強(qiáng)弱，在學(xué)習(xí)記憶中起著“開關(guān)”作用[11]。CREB能調(diào)控BDNF表達(dá)，給予突觸形成過程中所必需的神經(jīng)營養(yǎng)，促進(jìn)神經(jīng)元存活、增殖及損傷后修復(fù)再生等[12-13]。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠海馬神經(jīng)元排列散亂，樹突棘萎縮，分枝變短，稀疏無規(guī)則，突觸結(jié)構(gòu)損傷明顯，同時突觸可塑性相關(guān)蛋白SYN、PSD-95、CREB、BDNF表達(dá)量均顯著降低，突觸可塑性功能障礙；經(jīng)21 d電針治療后，突觸可塑性蛋白表達(dá)上調(diào)，突觸損傷得以改善，這可能是電針治療抑郁癥的關(guān)鍵作用機(jī)制。