陳君第霞，潘曉瓊，禹博威，胡臻

（溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 中醫(yī)科，浙江 溫州 325027）

糖尿病是一類由糖代謝紊亂而引起的以長期高血糖為主要特征的代謝性疾病，可導致多種并發(fā)癥，包括糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）、視網(wǎng)膜病變、心血管疾病及神經(jīng)損傷等[1-2]。隨著社會的發(fā)展、人口老齡化以及生活方式的改變，糖尿病的發(fā)病人數(shù)呈迅猛增長的趨勢，已經(jīng)成為21世紀人類健康的最大威脅之一。DN是糖尿病最嚴重的微血管并發(fā)癥之一，也是終末期腎臟病的主要原因之一[3]。蛋白尿、高血壓、腎小球濾過率降低是DN的主要臨床表現(xiàn)[4]。大量研究表明炎癥與DN的病理發(fā)展密切相關[5-6]。因此，有效改善糖尿病炎癥狀態(tài)成為防治DN的重要措施之一。

梔子苷，也稱梔子甙（geniposide），是一種環(huán)烯醚萜葡萄糖苷，易溶于水，是梔子中主要活性成分[7]。近年，越來越多的臨床、動物及細胞實驗證明梔子苷具有抗炎[8]、抗氧化[9]、降低血糖[10]、神經(jīng)保護[11]、保肝利膽[12]等多種生物學活性，并引起醫(yī)學界的高度重視。研究表明，梔子苷可以通過激活Nrf2 信號通路抑制脂多糖誘導的BV2 小膠質(zhì)細胞炎癥反應，降低腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）和白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）蛋白表達[13]。梔子苷能有效降低脂多糖誘導的小鼠巨噬細胞中炎癥狀態(tài)下TNF-α和白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）等的表達和釋放[14]。目前梔子苷緩解DN炎癥狀態(tài)的研究較少，本研究擬利用鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）建立1型糖尿病小鼠模型，觀察梔子苷對改善DN損傷的作用效果，為DN提供新的治療方向。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：32只SPF級C57BL/6J小鼠雄性（6～8周齡），體質(zhì)量18～22 g，由溫州醫(yī)科大學實驗動物中心提供，實物動物許可證號：SCXK（浙）2015-0001。

1.1.2 主要試劑：梔子苷（純度＞98%）購自上海莫奇生物科技有限公司，STZ購自美國Sigma公司，血糖儀及血糖試紙購自瑞士羅氏公司，TRIzol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RNA提取試劑盒和熒光定量試劑盒購自美國Inritrogen公司，TNF-α、IL-6、IL-1β和β-actin引物購自美國Invitrogen公司，HE染色試劑購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.1.3 主要設備：熒光正置顯微鏡（日本Nikon公司），HM340E半自動輪轉(zhuǎn)切片機（美國Thermo Fisher Scientific公司），TPJ-A型攤片機、TPJ-A型烘片機（常州中威電子儀器有限公司），艾本德高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司），T100型梯度PCR儀、CFX96實時熒光定量PCR儀（美國Bio-rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病動物模型的建立：SPF 級雄性C57BL/6J小鼠36只，適應性飼養(yǎng)1周后，隨機抽取28 只小鼠作為造模小鼠，剩余8 只小鼠作為正常組。0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液（pH為4.5）溶解STZ，配制成1%的STZ（配置過程冰浴避光，現(xiàn)配現(xiàn)用）。造模前小鼠禁食不禁水12 h，造模小鼠以每天50 mg/kg STZ進行腹腔注射，連續(xù)5 d，正常組小鼠以等量0.9%氯化鈉溶液進行腹腔注射。注射藥物后每7 d在小鼠尾靜脈取血，用快速血糖儀測小鼠空腹6 h后血糖，連續(xù)2次≥13.9 mmol/L者為造模成功小鼠[15]。

1.2.2 分組和給藥：28只造模的小鼠中，有24只造模成功，將其隨機分為模型組、梔子苷低劑量組（100 mg/kg）和梔子苷高劑量組（200 mg/kg），每組8只。梔子苷處理組以不同劑量梔子苷，模型組和正常組均以等量0.9%氯化鈉溶液每天灌胃，連續(xù)給藥8周。

1.2.3 一般情況記錄以及血糖、體質(zhì)量的測量：實驗期間觀察并記錄各組小鼠的精神狀態(tài)、活動反應、毛色情況、飲食飲水量、墊料潮濕情況以及大便情況，每2周測量并記錄小鼠血糖和體質(zhì)量。

1.2.4 標本采集：給藥8周后，采用10%水合氯醛麻醉小鼠，切開腹腔迅速摘取腎組織，分裝標本，部分于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫糠钟?%中性甲醛溶液中固定備用。

1.2.5 腎臟組織形態(tài)學檢查：腎臟組織置于4%中性甲醛溶液中24 h后，流水沖洗過夜，經(jīng)乙醇梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片，按照HE染色試劑說明書操作，光鏡下觀察腎臟組織形態(tài)學變化，重點觀察腎臟炎癥細胞浸潤情況。

1.2.6 RT-qPCR法檢測小鼠腎臟組織TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA的表達：用TRIzol法提取腎臟組織總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟，以RNA為模板合成cDNA。參照熒光定量PCR試劑盒說明書，以β-actin為內(nèi)參，進行PCR反應，采用實時熒光定量PCR儀進行定量分析腎臟組織內(nèi)TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA的含量。所用小鼠基因的引物序列見表1。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 采用GraphPad Prism 6.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

表1 RT-qPCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 4組小鼠生存狀態(tài)記錄 給藥期間正常組小鼠生活狀態(tài)良好；模型組小鼠出現(xiàn)不同程度的活動減少，毛色欠光澤，易脫落，多食、多飲、多尿癥狀，墊料潮濕，體質(zhì)量增長緩慢等現(xiàn)象；隨著實驗灌胃給藥的進行，梔子苷低、高劑量組小鼠上述癥狀較模型組有所改善。

2.2 梔子苷對4組小鼠體質(zhì)量的影響 正常組小鼠體質(zhì)量穩(wěn)步增長，梔子苷低、高劑量組和模型組的體質(zhì)量明顯低于正常組（P＜0.01）。隨著梔子苷的干預治療，給藥8周后，梔子苷低劑量組和模型組小鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），梔子苷高劑量組小鼠體質(zhì)量較模型組明顯增多（P＜0.05），見圖1。

圖1 梔子苷對4組小鼠體質(zhì)量的影響（每組n=8）

2.3 4組小鼠空腹血糖比較 正常組小鼠空腹血糖波動穩(wěn)定，梔子苷低、高劑量組和模型組空腹血糖明顯高于正常組（P＜0.01）。隨著梔子苷的干預治療，給藥8周后，模型組空腹血糖仍維持在較高的水平，梔子苷低劑量和高劑量組小鼠的空腹血糖水平降低，高劑量組小鼠空腹血糖較模型組明顯下降（P＜0.01），見圖2。

圖2 梔子苷對4組小鼠空腹血糖的影響（每組n=8）

2.4 4組小鼠腎臟組織形態(tài)比較 梔子苷干預治療8周后，正常組小鼠腎小球形態(tài)和結(jié)構(gòu)正常，毛細血管袢完整，球內(nèi)系膜細胞數(shù)量正常，腎小管形態(tài)良好，間質(zhì)未見明顯炎性細胞浸潤。模型組小鼠腎小球毛細血管袢受損形變，系膜細胞減少，小葉分隔增寬，呈分葉狀，腎小管上皮細胞萎縮、壞死、管腔變大，腎間質(zhì)大量炎性細胞浸潤。梔子苷低劑量和高劑量組小鼠腎組織病理損傷有很大程度上緩解，血管球形態(tài)有一定恢復，系膜細胞增多，腎小管形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰，腎間質(zhì)炎性細胞明顯減少，見圖3。

2.5 4組小鼠腎臟組織TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA相對表達量比較 梔子苷干預治療8周后，與模型組相比較，梔子苷低劑量和高劑量組腎組織中TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表達顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖4。

3 討論

梔子作為我國的傳統(tǒng)中藥，具有瀉火除煩、清熱利濕、涼血解毒、消腫止痛等作用。傳統(tǒng)臨床中常用于治療熱病心煩、濕熱黃疸、淋證澀痛、血熱吐衄、目赤腫痛、火毒瘡瘍等病變，近幾十年逐漸將其運用到糖尿病及其并發(fā)癥的治療中。從梔子果實中提取的的環(huán)烯醚萜類化合物梔子苷具多種生物學活性。梔子苷能夠保護糖尿病小鼠胰島結(jié)構(gòu)，促進β細胞增殖，增加胰島素分泌，從而降低血糖[16]。梔子苷可以降低膿毒血癥小鼠血清促炎因子表達水平，緩解多器官功能障礙狀態(tài)[8]。本研究探討梔子苷能否改善STZ誘導的DN小鼠炎癥狀態(tài)，從而保護腎組織。糖尿病小鼠連續(xù)灌胃8 周，每日1次，梔子苷低劑量組和梔子苷高劑量組能有效增加小鼠體質(zhì)量，降低血糖，且呈劑量依賴性。但梔子苷低劑量組和梔子苷高劑量組血糖值仍舊遠高于正常組，這可能與梔子苷劑量不足有關。給藥8周后，梔子苷低劑量組和梔子苷高劑量組小鼠腎組織血管球形態(tài)有一定恢復，系膜細胞增多，腎小管形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰，腎間質(zhì)炎性細胞浸潤明顯減少，說明梔子苷能有效緩解小鼠腎組織病理損傷，改善小鼠的DN狀態(tài)。

圖3 4組小鼠腎組織病理切片HE染色結(jié)果（×200）

圖4 4組小鼠腎組織中TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA的相對表達量（每組n=8）

越來越多的證據(jù)表明，持續(xù)低度炎癥反應狀態(tài)對DN的發(fā)生及發(fā)展過程具有重要影響[17]。TNF-α、IL-6 和IL-1β是重要的促炎因子，這些因子的過度分泌促進了中性粒細胞聚集和激活，進而向炎癥部位遷移、吞噬細胞、釋放卵清蛋白酶、產(chǎn)生活性氧和促進細胞凋亡等，促進糖尿病相關炎癥進展，導致糖尿病患者的免疫紊亂[18-19]。本研究結(jié)果顯示，梔子苷干預治療8周后，與模型組相比較，梔子苷低劑量和高劑量組TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表達顯著下降，且呈劑量依賴性。說明梔子苷可以降低DN小鼠炎癥相關RNA表達，減弱炎癥狀態(tài)，為進一步炎癥分子機制研究提供依據(jù)。

綜上所述，梔子苷能有效改善小鼠的DN狀態(tài)，降低血糖，保護腎組織，其調(diào)控機制可能與其能改善糖尿病小鼠炎癥狀態(tài)有關，但具體炎癥分子機制有待研究。