陳世鉆，俞富祥，陳俊予，唐銀河

（溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 肝膽外科，浙江 溫州 325015）

我國是慢性肝病大國，更是肝惡性腫瘤的高發(fā)國家。嚴重慢性肝病和肝惡性腫瘤的晚期需要肝臟移植治療[1]。肝移植治療對肝臟供體的巨大需求與肝臟供體的嚴重短缺形成了巨大反差[2]，因此，肝臟再生的研究刻不容緩。肝臟再生一直是肝臟疾病研究中的重要環(huán)節(jié)，但經(jīng)過多年的探索對其機制仍是知之甚少，一個重要的原因是缺乏一個簡單方便的可重復(fù)的肝再生動物模型。2014年JIANG等[3]利用整個肝臟組織去細胞制備成去細胞支架。此后又有多個研究小組報道運用各種去細胞方式制備去細胞支架[4]，但目前仍未有簡單可重復(fù)的肝臟再生模型。本研究旨在探究新型大鼠肝臟再生模型，為肝臟再生及肝臟移植的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠，體質(zhì)量200～250 g，由溫州醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物許可證號：SYXK（浙）2015-0009。普通飼料喂養(yǎng)，實驗前禁食12 h。

1.2 主要試劑及儀器 DMEM培養(yǎng)液購自美國Sigma公司，胰蛋白酶消化液、Triton X-100、Percoll分離液、IV膠原酶、內(nèi)皮素-1（endothelin-1，ET-1）一抗、ET-1二抗、DAPI染液、肝細胞細胞角蛋白18（cytokeratin 18，CK-18）一抗、CK-18二抗、DAB顯色試劑盒購自北京Solarbio公司，倒置熒光顯微鏡購自廣州明美光電有限公司，密度梯度離心機購自長沙英泰儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 肝細胞分離：取SD大鼠，用75%乙醇浸泡消毒5 min后，在無菌條件下取出肝臟，剪碎，并用Hanks液反復(fù)清洗3次后，用0.1%的IV型膠原酶消化30 min，此后用3倍體積的完全培養(yǎng)基終止消化，最后將組織懸液經(jīng)100目鋼網(wǎng)過濾，然后反復(fù)洗滌殘渣，收集濾液。濾液用50×g離心2 min，上清富含非實質(zhì)細胞，而沉淀則富含肝細胞。收集沉淀，用DMEM+20% FBS+雙抗培養(yǎng)基將細胞進行重懸鋪板后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.3.2 肝竇內(nèi)皮細胞分離：將上述上清液進行100×g離心5 min，再次收集上清，用350×g離心10 min，取得沉淀后經(jīng)洗滌后混懸于20 mL PBS中。在50 mL離心管內(nèi)，每10 mL細胞懸液平鋪在二層Percoll梯度的上層（底層是15 mL 50% Percoll，中間層是20 mL 25% Percoll），這樣在50 mL離心管內(nèi)從下至上形成50% Percoll、25% Percoll和細胞懸液3層梯度。用900×g離心20 min，吸取中間帶混懸液約10 mL（在50% Percoll與25% Percoll之間），予PBS等量稀釋后再經(jīng)900×g離心10 min，保留沉淀。加入DMEM/F12+20% FBS+雙抗培養(yǎng)液將細胞重懸形成肝竇內(nèi)皮細胞懸液鋪板后，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.3.3 免疫熒光法檢測肝竇內(nèi)皮細胞表面ET-1的表達：分離出的肝竇內(nèi)皮細胞用4%的多聚甲醛固定，加入5% BSA液封閉后，加入一抗ET-1（1:200），37 ℃孵育3 h后，加入Cy3（1:200）免疫熒光二抗，并隨后用DAPI標記細胞核，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.3.4 細胞免疫組織化學染色：分離出的肝細胞用4%的多聚甲醛固定，用0.5% Triton X-100（PBS配制）通透20 min；在培養(yǎng)皿加入新鮮配制的3%雙氧水，去除內(nèi)源性過氧化物酶封閉液，然后滴加足夠量的稀釋好的一抗：CK-18（1:600），此后滴加聚合HRP標記抗兔IgG二抗工作液，DAB顯色5～10 min，在顯微鏡下掌握染色程度，經(jīng)脫水、透明、封片后鏡檢。

1.3.5 肝細胞支架制備：選取正常狀態(tài)良好的SD大鼠取肝臟，注意保護好肝臟的完整性；用0.9%氯化鈉溶液反復(fù)沖洗，高濃度雙抗液體（滅菌用水配制，青霉素及鏈霉素濃度分別為4 000 U/mL）浸潤消毒10 min；從SD大鼠肝臟門靜脈處插管，用PBS循環(huán)灌注肝臟標本2 h以沖出殘留血液；之后用0.02%胰酶循環(huán)灌注2 h以消化肝臟組織；隨后用Triton X-100循環(huán)灌注15 h清除殘余的肝組織；最后依次用0.1%過氧乙酸灌洗消毒1 h，滅菌PBS灌洗1 h，制備成去細胞支架。之后行HE染色檢查和掃描電鏡檢查鑒定肝細胞支架。

2 結(jié)果

2.1 肝細胞及肝竇內(nèi)皮細胞數(shù)量形態(tài) 每個肝臟標本能成功分離出1×107個肝細胞，低倍鏡下可見活細胞呈圓形，飽滿，胞核清晰。肝竇內(nèi)皮細胞培養(yǎng)擴增至1×106，大部分細胞光鏡下為小圓形，大小均勻，2 h后開始貼壁，出現(xiàn)三角形或不規(guī)則形，隨著時間延長，肝竇內(nèi)皮細胞形態(tài)逐漸呈梭形，細胞邊緣清楚，細胞核突起位于中央。

2.2 肝細胞免疫組織化學實驗 肝細胞進行CK-18免疫組織化學鑒定，200倍顯微鏡下可見肝細胞胞漿內(nèi)存在棕黃色顆粒，細胞核呈藍紫色（見圖1）。

2.3 肝竇內(nèi)皮細胞熒光單染實驗 肝竇內(nèi)皮細胞經(jīng)ET-l多抗間接免疫熒光法鑒定，90%的細胞熒光染色陽性；因此培養(yǎng)48 h的肝竇內(nèi)皮細胞純度可達90%左右。肝竇內(nèi)皮細胞核經(jīng)DAPI染色后在倒置免疫熒光顯微鏡下呈藍色，見圖2。

圖1 肝細胞CK-18免疫組織化學染色結(jié)果

圖2 肝竇內(nèi)皮細胞免疫熒光染色結(jié)果

圖3 排盡血液前后大鼠肝臟組織大體觀

2.4 肝細胞支架制備及鑒定 SD大鼠肝組織標本呈暗紅色（見圖3A），經(jīng)PBS灌注排盡血液后呈蠟黃色（見圖3B），此后經(jīng)0.02%胰酶灌注消化、3% Triton X-100循環(huán)灌注后，殘留血液逐漸被沖凈，細胞成分逐漸被脫除，大鼠肝臟標本逐漸趨于透明膠凍樣（見圖4A-B）。制備的大鼠肝臟去細胞基質(zhì)呈無色透明，表面平整，肝臟包膜完整（見圖4C）。HE染色顯示肝臟去細胞支架呈蜂窩樣孔隙結(jié)構(gòu)，纖維樣細胞外基質(zhì)保留，未見細胞核及細胞質(zhì)成分殘留（見圖5）。掃描電鏡證實肝組織去細胞支架內(nèi)僅存留多孔隙樣細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)，孔隙內(nèi)原有占位的細胞成分被完全脫除，視野內(nèi)尚可見較為完整的血管斷面、中央靜脈結(jié)構(gòu)和門管三聯(lián)結(jié)構(gòu)（見圖6）。

3 討論

近年來，隨著終末期慢性肝病患者及肝惡性腫瘤患者數(shù)量日益增多，肝移植技術(shù)的運用愈發(fā)廣泛，而短缺的肝臟供體問題愈發(fā)突出[5]。為解決肝源緊缺問題，“人造肝”成為近年來的研究熱點。其中天然的組織器官去細胞支架制備而成的“人造肝”具有完整脈管系統(tǒng)和天然的細胞外基質(zhì)[6]，并且能夠高度模擬細胞自然生長的微環(huán)境，為細胞生長提供氧氣和養(yǎng)分，可以保證定植細胞發(fā)揮效能。肝臟去細胞基質(zhì)從生理、生化和幾何角度等方面都更接近肝臟細胞自然生長環(huán)境[7]，提高肝臟細胞重新植入肝細胞支架后存活的成功率。本研究利用SD大鼠的肝臟標本經(jīng)Triton X-100循環(huán)灌注成功制備了符合標準的肝組織去細胞支架，未見明顯細胞核，并保留了完整的血管網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。掃描電鏡檢查證實在有效去除細胞的同時，保留原有肝臟的細胞外基質(zhì)的組成和脈管結(jié)構(gòu)。并且制備成的支架具有良好的孔徑和孔隙率，這有利于受體細胞的浸潤和植入，有利于后續(xù)肝細胞植入、再生方面實驗研究的開展[8]。

圖4 肝細胞灌注過程

圖5 正常肝臟組織和肝臟去細胞支架HE染色結(jié)果（×100）

圖6 正常肝臟組織和肝臟去細胞支架掃描電鏡觀查結(jié)果

肝細胞和肝竇內(nèi)皮細胞在肝臟病理生理及器官移植中的作用已引起人們重視[8]，獲得高純度和活力的肝竇內(nèi)皮細胞和肝細胞是進行細胞重新植入去細胞支架再生形成“人工肝”的基礎(chǔ)[9]。本研究在分離培養(yǎng)的過程中，多次調(diào)整分離原代肝細胞和肝竇內(nèi)皮細胞方法[10]，總結(jié)出一套較為穩(wěn)定且分離純度較高的肝細胞和肝竇內(nèi)皮細胞的分離方法[11]。通過摸索與實驗我們發(fā)現(xiàn)，大鼠肝細胞和肝竇內(nèi)皮細胞的成功分離與以下因素密切相關(guān)：①選擇合適的膠原酶消化肝組織。膠原酶IV主要針對肝臟組織中的膠原成分及纖維組織有消化分解作用，而對上皮細胞的影響不大?？梢岳么颂匦苑蛛x提純肝細胞[12]。②消化酶的濃度一般以0.1%～0.15%為宜，消化酶的濃度過高會破壞肝細胞膜，濃度過低則會使對肝臟消化不徹底，均會使分離下來的肝細胞成活率低。③采用低速離心（50×g）分離法既可將肝實質(zhì)細胞與非實質(zhì)細胞分離開，又可減少對肝臟細胞的損害[13]，提高分離出的肝臟細胞的存活率。④選擇含有多種因子的培養(yǎng)液，并且加入足夠的血清及營養(yǎng)[14]，保證實驗期間肝細胞和肝竇內(nèi)皮細胞的穩(wěn)定及較高的存活率。⑤在肝竇內(nèi)皮細胞分離培養(yǎng)的過程中，分離出的肝竇內(nèi)皮細胞純度主要取決于Percoll密度梯度離心是否徹底。選擇合適的離心機及合適的離心轉(zhuǎn)數(shù)顯得尤為重要[15]。⑥梯度離心時可以將離心機調(diào)節(jié)為慢剎車狀態(tài)，這樣更有助于形成梯度離心后的懸浮細胞層。

總之，本研究成功分離出了肝細胞以及肝竇內(nèi)皮細胞，并成功制備了肝臟去細胞支架，為下一步的肝細胞和肝竇內(nèi)皮細胞的植入及肝再生鑒定了基礎(chǔ)。希望給后續(xù)以臨床為導(dǎo)向的肝臟組織工程研究提供參考。