劉琴 時(shí)建國(guó)

慢性乙型肝炎(chronic viral hepatitis B，CHB)是一種肝臟疾病，在臨床上極為普遍，慢性乙肝病毒(HBV)感染是其主要致病因素，隨著患者病情的發(fā)展，患者可出現(xiàn)各類的肝臟病變，其中肝臟纖維化在患者中比較常見(jiàn)[1]。及時(shí)了解患者是否存在肝纖維化及纖維化程度是治療此類患者的關(guān)鍵[2]。以往相關(guān)報(bào)道表明[3]，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endo-plasmic reticulum，ER)會(huì)產(chǎn)生應(yīng)激，主要原因是機(jī)體內(nèi)HBV一直進(jìn)行復(fù)制及表達(dá)，并且ER應(yīng)激會(huì)影響受HBV感染后機(jī)體肝臟內(nèi)不可控制的炎癥的變化和發(fā)展，但準(zhǔn)確的調(diào)控機(jī)制仍需繼續(xù)探討。中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor，MANF)蛋白是一種以高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為主要編碼區(qū)域的分泌性蛋白。目前研究[4-5]認(rèn)為，ER應(yīng)激可以提高M(jìn)ANF基因的表達(dá)水平和蛋白的分泌水平，MANF蛋白高表達(dá)可能有助于抑制肝臟受到損傷后的過(guò)度炎癥及纖維化反應(yīng)，但MANF蛋白表達(dá)水平是否與慢性HBV感染后肝臟纖維化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)目前鮮有報(bào)道[6]。本研究通過(guò)檢測(cè)我院接收的乙肝患者外周血MANF蛋白的表達(dá)情況，來(lái)探究MANF蛋白對(duì)乙肝患者肝臟纖維化程度的診斷效果。

資料與方法

一、一般資料

選取2016年9月至2017年9月96例我院接收的乙肝患者進(jìn)行研究，其中女性42例，男性54例，年齡25～52歲，平均年齡(29.2±18.5)歲，將上述患者按照肝纖維化程度分為輕度肝纖維化組、中度肝纖維化組、重度肝纖維化組。同時(shí)選取50例在我院體檢后顯示健康者作為對(duì)照組，其中女性29例，男性21例，年齡22～52歲，平均年齡(26.6±15.4)歲。乙肝患者與對(duì)照組在性別和年齡比較不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性(P>0.05)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有患者均經(jīng)病理確診為乙肝病毒感染。(2)所有患者均自愿加入研究。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)并發(fā)嚴(yán)重的心臟、肝臟及腎臟疾??；(2)由于其他原因引發(fā)的肝功能障礙患者；(3)并發(fā)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等風(fēng)濕性免疫系統(tǒng)疾??；(4)并發(fā)甲亢或糖尿病等患者。

二、方法

(一)ELISA法檢測(cè)MANF蛋白水平 采集乙肝患者以及體檢健康者空腹時(shí)的外周血5 mL，將血清分離出，于零下80℃的環(huán)境下保存?zhèn)溆?。使用MANF檢測(cè)試劑盒進(jìn)行樣本檢測(cè)，步驟如下：①檢測(cè)標(biāo)本分別設(shè)置待測(cè)樣本孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和空白孔，將50 μL待測(cè)樣本分別加入相應(yīng)的檢測(cè)孔中，在37℃下培育2 h，倒掉剩余液體并將標(biāo)本甩干；②在每個(gè)檢測(cè)孔中加入50 μL檢測(cè)溶液A，在37 ℃下培育1 h；③倒掉檢測(cè)孔中的液體，在每個(gè)檢測(cè)孔中加入180 μL洗滌液，浸泡2 min，將酶標(biāo)板內(nèi)液體甩掉或吸去，重復(fù)洗滌3～4次；在檢測(cè)孔中加入50 μL檢測(cè)溶液B，在37℃環(huán)境下培育0.5 h；接著倒去檢測(cè)孔內(nèi)液體并甩干，將酶標(biāo)板清洗4-5次；④在每個(gè)檢測(cè)孔內(nèi)加入45 μL底物溶液，在37 ℃下避光顯色20分鐘，在每個(gè)測(cè)試孔中加入25 μL終止液，將反應(yīng)終止，藍(lán)色立即轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色；⑤用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各檢測(cè)孔的光密度值。

(二)病毒學(xué)指標(biāo)和生化指標(biāo)檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)HBV DNA，采用生化分析儀及相應(yīng)試劑分別檢測(cè)谷天門(mén)冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、血清總膽紅素、谷丙轉(zhuǎn)氨酶，采用雅培化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)乙肝五項(xiàng)定量，采用血球分析儀檢測(cè)血小板。

(三)肝臟活組織檢查及診斷 采用1 s快速穿刺活檢術(shù)在超聲的引導(dǎo)下穿刺獲取肝臟組織，長(zhǎng)度2 cm左右，由HCHO固定，石蠟包埋，并連續(xù)切片，經(jīng)染色后由光學(xué)顯微鏡觀察，并分別由兩名醫(yī)師進(jìn)行閱片診斷。

(四)評(píng)價(jià)方法 采用受試者工作特征(ROC)曲線及AUC評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)分析，需計(jì)算FIB-4和APRI，F(xiàn)IB-4和APRI，以便較好地對(duì)乙肝患者肝纖維化程度進(jìn)行評(píng)估。FIB-4指數(shù)基于谷丙轉(zhuǎn)氨酶、天門(mén)冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、血小板和患者年齡進(jìn)行計(jì)算，F(xiàn)IB-4=(年齡×天門(mén)冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶)/(血小板×谷丙轉(zhuǎn)氨酶的平方根)。APRI評(píng)分計(jì)算方法：APRI=[天門(mén)冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶/ULN×100)/血小板(109/L)]，其中ULN為天門(mén)冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶正常參考值上限[7]。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、肝纖維化不同程度的乙肝患者外周血MANF蛋白的表達(dá)

對(duì)照組MANF蛋白的表達(dá)水平為(1.45±0.56)，輕度肝纖維化組MANF蛋白的表達(dá)水平為(1.75±0.84)，中度肝纖維化組MANF蛋白的表達(dá)水平為(1.85±1.02)，重度肝纖維化組MANF蛋白的表達(dá)水平為(2.21±1.12)，四組之間MANF蛋白的表達(dá)水平比較存在明顯差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，兩組之間分別比較，與對(duì)照組相比，其他三組患者M(jìn)ANF蛋白的表達(dá)水平比較差異顯著，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與輕度肝纖維化組比較，重度肝纖維化組MANF蛋白的表達(dá)水平存在差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與中度肝纖維化組比較，重度肝纖維化組MANF蛋白的表達(dá)水平比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。但輕度肝纖維化組與中度肝纖維化組MANF蛋白的表達(dá)水平差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。外周血MANF蛋白的表達(dá)水平與肝纖維化程度呈正相關(guān)(r=0.401,P<0.05)。

二、乙肝患者外周血MANF蛋白的表達(dá)水平與臨床各個(gè)指標(biāo)的相關(guān)性

根據(jù)谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平、乙肝病毒表面抗原水平、總膽紅素水平、HBV DNA、乙肝E抗原狀態(tài)及天門(mén)冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平，將96例患者進(jìn)行分組，結(jié)果如下：乙肝病毒表面抗原<1 500 IU/mL時(shí)，MANF值為(2.15±0.61)，在1 500～20 000 IU/mL時(shí)，MANF值為(2.31±0.55)，>20 000時(shí)，MANF值為(2.23±0.53)；乙肝E抗原呈陰性時(shí)，MANF值為(2.24±0.56)，呈陽(yáng)性時(shí)，MANF值為(2.21±0.55)；谷丙轉(zhuǎn)氨酶<80 U/mL時(shí)，MANF值為(2.16±0.58)，在80～250 U/mL時(shí)，MANF值為(2.13±0.53)，在>250 U/mL時(shí)，MANF值為(2.23±0.65)；在HBV DNA<1 000 IU/mL時(shí)，MANF值為(2.16±0.51)，在1 000～100 000 IU/mL時(shí)，MANF值為(2.17±0.62)，在>100 000 IU/mL時(shí)，MANF值為(2.24±0.52)；天門(mén)冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶<80 U/mL時(shí)，MANF值為(2.12±0.55)，在80～250 U/mL時(shí)，MANF值為(2.46±0.59)，在>250 U/mL時(shí)，MANF值為(2.58±0.41)。結(jié)果提示在不同臨床指標(biāo)條件下分組進(jìn)行比較時(shí)，不同天門(mén)冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平組間MANF蛋白的表達(dá)水平比較均具有明顯差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

三、MANF蛋白對(duì)乙肝患者肝纖維化診斷效果的ROC研究

將96例乙肝患者以肝臟病理結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分組，重度肝纖維化40例，顯著肝纖維化56例，分別進(jìn)行ROC研究。MANF蛋白診斷顯著肝纖維化的敏感度為0.647，,特異度為0.691，而診斷重度肝纖維化時(shí)的敏感度為0.931，特異度為0.467，與顯著纖維化相比，診斷重度纖維化時(shí)敏感度增加，特異度降低。根據(jù)ROC研究整理圖像信息，見(jiàn)表1。

討 論

據(jù)以往相關(guān)報(bào)道說(shuō)明，HBV的持續(xù)感染極易觸發(fā)ER發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，但關(guān)于患者HBV慢性感染后肝纖維化的進(jìn)一步發(fā)展以及肝臟情況中是否有MANF的參與方面的報(bào)道比較缺乏。有關(guān)研究人員猜測(cè)，MANF在患者由肝炎轉(zhuǎn)變?yōu)楦斡不倪^(guò)程中極有可能起著重要作用[8]。因此，本研究針對(duì)不同纖維化程度的乙肝患者外周血中MANF蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)。

表1 MANF蛋白對(duì)乙肝患者肝纖維化診斷效果的ROC研究

研究結(jié)果顯示，外周血MANF蛋白的表達(dá)水平與肝纖維化程度呈正相關(guān)；與體檢健康者對(duì)照組相比較，輕度纖維化組、中度纖維化組與重度纖維化組MANF蛋白的表達(dá)水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；同時(shí)不同AST、ALT水平組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。根據(jù)本研究可知，MANF蛋白在肝纖維化階段表達(dá)水平最高，ER應(yīng)激可以上調(diào)MANF蛋白表達(dá)水平，推測(cè)ER應(yīng)激作為一種因素參與了纖維化的進(jìn)程。適度的ER應(yīng)激是細(xì)胞的自我保護(hù)的一種方式，但過(guò)度的ER應(yīng)激，則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡過(guò)度。推測(cè)在慢性HBV感染的早期階段，即肝臟炎癥和纖維化階段，ER應(yīng)激導(dǎo)致的MANF蛋白表達(dá)水平較高對(duì)肝纖維化發(fā)生發(fā)展起到一種保護(hù)作用，但當(dāng)慢性HBV感染引起的持續(xù)的免疫損傷導(dǎo)致廣泛假小葉形成時(shí)，肝細(xì)胞則呈現(xiàn)過(guò)度凋亡，ER應(yīng)激不再是疾病發(fā)生發(fā)展的主要機(jī)制，因此，MANF蛋白表達(dá)水平下降[9]。我們根據(jù)ROC研究，探究MANF蛋白對(duì)乙肝患者肝臟纖維化程度的診斷效果，并將其與FIB-4和APRI指數(shù)進(jìn)行比較，得出MANF蛋白診斷重度肝纖維化時(shí)的敏感度為0.931，特異度為0.467，而診斷顯著肝纖維化的敏感度為0.647，特異度為0.691，與顯著纖維化相比，診斷重度纖維化時(shí)敏感度增加，特異度降低，但可以與FIB-4和APRI指數(shù)形成互補(bǔ)，達(dá)到良好的診斷效果。

綜上所述，MANF蛋白參與乙肝患者肝纖維化程度進(jìn)展，可有效評(píng)估乙肝患者肝纖維化程度。