孫妍妍, 王景婭, 王 露, 李曉哲, 闞云超, 喬惠麗,*

(1. 鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 鄭州 450001; 2. 南陽師范學(xué)院, 河南省伏牛山昆蟲生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 河南南陽 473061)

MicroRNAs(miRNAs)是一種內(nèi)源性小分子非編碼RNA，長度約22 nt，廣泛存在于原生動(dòng)物、病毒、植物和動(dòng)物中，且物種間具有高度保守性(Ambros, 2004; Bartel, 2004)。miRNAs通過與靶基因的非翻譯區(qū)或編碼區(qū)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后或翻譯水平上調(diào)節(jié)靶基因mRNA的降解或蛋白的表達(dá)，參與調(diào)控細(xì)胞增殖分化(Lietal., 2013)、凋亡(Heetal., 2013; Lietal., 2018)、自噬(Nelsonetal., 2014; Texadaetal., 2019; Zhaoetal., 2019)、免疫(Silwaletal., 2019; Xuetal., 2019)、發(fā)育和代謝(He and Hannon, 2004; Ameres and Zamore, 2013)等幾乎所有的生命活動(dòng)過程。lin-4和lin-7是最早在秀麗隱桿線蟲Caenorhabditiselegans中發(fā)現(xiàn)的miRNAs(Leeetal., 1993)；在哺乳動(dòng)物中，約50%的編碼蛋白基因表達(dá)受miRNAs的調(diào)控(Kroletal., 2010)；miRNAs同樣在昆蟲中廣泛存在，并在昆蟲變態(tài)發(fā)育和生殖過程中發(fā)揮重要作用(Behura, 2007; Lucas and Raikhel, 2013; Liuetal., 2018, 2019)。

昆蟲的變態(tài)發(fā)育由蛻皮激素20E和保幼激素(juvenile hormone, JH)協(xié)同調(diào)控，研究發(fā)現(xiàn)，20E不僅可抑制PI3K-Akt信號(hào)通路而促進(jìn)自噬的起始，同時(shí)可與20E受體EcR-USP的異源二聚體結(jié)合，啟動(dòng)20E初級(jí)應(yīng)答基因Br-C,E74,E75和E93的表達(dá)，進(jìn)而通過與特異DNA序列結(jié)合啟動(dòng)晚期應(yīng)答基因的表達(dá)(Riddifordetal., 2000; Yin and Thummel, 2005)。作為20E信號(hào)通路中的一個(gè)初級(jí)應(yīng)答基因，細(xì)胞核激素受體E75(nuclear hormone receptor E75)基因最早在黑腹果蠅Drosophilamelanogaster中被鑒定，該基因在果蠅中通過5′端外顯子的可變剪接編碼DmE75A, DmE75B, DmE75C和DmE75D 4個(gè)異構(gòu)體，其中DmE75A和DmE75C的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域含有2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，DmE75B含有1個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，DmE75D沒有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Feigletal., 1989; Segraves and Hogness, 1990; Bernardoetal., 2009)。在家蠶中，E75基因具有BmE75A,BmE75B和BmE75C3個(gè)可變剪接體，且其編碼蛋白同樣具有相同的C末端和不同的N末端(Segraves and Hogness, 1990)。對BmE75A,BmE75B和BmE75C在家蠶BmN細(xì)胞、前胸腺和脂肪體中的表達(dá)研究結(jié)果也表明，BmE75A,BmE75B和BmE75C具有不同的組織和時(shí)期特異性，而且三者的表達(dá)與20E的滴度密切相關(guān)(Lietal., 2015)。 近年研究表明，E75基因可參與不同昆蟲幼蟲到蛹的變態(tài)發(fā)育過程(Guoetal., 2016; Liuetal., 2018; Pengetal., 2019)。

家蠶Bombyxmori作為重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲，是研究昆蟲變態(tài)發(fā)育分子機(jī)制的重要模式生物。家蠶的變態(tài)發(fā)育過程由20E和JH協(xié)同調(diào)控。在昆蟲變態(tài)發(fā)育過程中需經(jīng)歷復(fù)雜的器官重建過程，脂肪體的自噬和凋亡對家蠶變態(tài)發(fā)育過程十分重要(Ihry and Bashirullah, 2014; Huetal., 2016)。本研究通過生物信息學(xué)方法分析預(yù)測家蠶miR-2769在20E處理后家蠶脂肪體中差異表達(dá)基因中的關(guān)聯(lián)靶基因，利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)對miR-2769與其靶基因BmE75B的互作進(jìn)行鑒定，進(jìn)一步通過qRT-PCR檢測miR-2769、靶基因BmE75B及其不同剪接體BmE75A和BmE75C在20E處理后家蠶脂肪體及不同發(fā)育時(shí)期和不同組織的表達(dá)特征，從而闡明miR-2769及其靶基因BmE75B在家蠶變態(tài)發(fā)育過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試家蠶為二化性的大造p50品系，常規(guī)條件下對蠶卵進(jìn)行催青，幼蟲用新鮮桑葉飼養(yǎng)。收集5齡第2天家蠶幼蟲進(jìn)行血淋巴注射蛻皮激素20E(2 μg/μL)，每頭家蠶注射5 μg，對照注射等體積無菌水稀釋10倍的無水乙醇溶劑。注射后2, 6, 12和24 h 后分別取處理和對照的家蠶幼蟲脂肪體。家蠶頭、表皮、絲腺、脂肪體、精巢、卵巢、馬氏管、中腸和血淋巴的組織取自正常家蠶5齡第3天幼蟲；在4齡幼蟲、5齡幼蟲、蛹期至羽化后3 d成蟲期間，每天分別隨機(jī)取整蟲，幼蟲去中腸。每個(gè)樣品3組，每組來自5頭個(gè)體。所有樣品液氮速凍后-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

大腸桿菌EscherichiacoliTop10細(xì)胞，人胚胎腎細(xì)胞HEK293T細(xì)胞，psiCheck2載體為實(shí)驗(yàn)室保存，用于基因克隆的載體和試劑有pMD-19T載體(TaKaRa, 大連)，Trizol Reagent(Invitrogen， 美國)，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermofisher，美國)，限制性內(nèi)切酶(Fermentas，美國)，質(zhì)粒DNA提取試劑盒和膠回收試劑盒(Axygen, 美國)，Taq酶(Vazyme, 南京)，T4 DNA連接酶(Thermofisher, 美國)；用于細(xì)胞培養(yǎng)的試劑有DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone, 美國)，胎牛血清(BI, 以色列)，細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑為X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent(Roche, 瑞士)，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒(Promega，美國)，qRT-PCR試劑為FastStart通用型SYBR? Green預(yù)混液(Roche, 瑞士)和All-in-oneTMmiRNA qRT-PCR檢測試劑盒(Genecopia, 美國)。

1.2 家蠶總RNA的提取

將1.1節(jié)不同家蠶樣品分別用液氮研磨，取約100 mg粉末加入1 mL Trizol試劑，按照RNA提取說明書進(jìn)行抽提，RNA沉淀充分溶解后用超微量核酸蛋白測定儀(NanoDrop ND-2000)對總RNA的濃度和純度進(jìn)行測定。

1.3 家蠶miR-2769的序列和表達(dá)分析

根據(jù)前期測序獲得的成熟miR-2769的序列(AUAUAUUAUCAGAUUUUCGGUC)設(shè)計(jì)上游引物(5′-ATATATTATCAGATTTTCGGTC-3′)，以All-in-oneTMmiRNA qRT-PCR檢測試劑盒中的通用的接頭引物(Genecopia, 美國)為下游引物，對1.2節(jié)家蠶脂肪體RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，利用All-in-oneTMmiRNA qRT-PCR檢測試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件: 預(yù)變性95℃ 5 min; 95℃ 15 s, 55℃ 30 s, 72℃ 30 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物純化后連接pMD-19T載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞，挑取鑒定后的陽性克隆送深圳華大基因科技有限公司進(jìn)行測序。

利用All-in-oneTMmiRNA qRT-PCR檢測試劑盒對miR-2769在1.1節(jié)中20E處理組與對照組的2, 6, 12和24 h的脂肪體組織中的表達(dá)進(jìn)行qRT-PCR檢測。內(nèi)參基因?yàn)榧倚Q5S rRNA(GenBank登錄號(hào): M35394.1)，引物序列為5S-F: 5′-CGTCCGATCA CCGAAGTCAAG-3′；5S-R: 5′-AGGCGGTCACCCAT CCAAGTA-3′。擴(kuò)增條件: 95℃ 5 min; 95℃ 15 s, 55℃ 30 s, 72℃ 30 s，共40次循環(huán)；最后72℃延伸10 min，溶解曲線范圍為65℃～95℃。

1.4 家蠶miR-2769靶基因的預(yù)測及表達(dá)分析

課題組前期對20E處理前后的家蠶脂肪體進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序，據(jù)此利用軟件miRanda和生物信息學(xué)方法對20E處理前后家蠶脂肪體轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中差異表達(dá)基因中的miR-2769靶基因進(jìn)行預(yù)測。利用ClustalW2在線分析軟件(https:∥www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)對miR-2769靶基因BmE75B(GenBank登錄號(hào): NM_001112610.1)及其不同剪接體BmE75A(GenBank登錄號(hào): NM_001112609.1)和BmE75C(GenBank登錄號(hào): NM_001043577.1)的序列進(jìn)行比對分析。

以1.2節(jié)提取的家蠶幼蟲脂肪體RNA為模板，利用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，利用FastStart通用型SYBR? Green預(yù)混液對miR-2769靶基因BmE75B及其不同剪接體BmE75A和BmE75C進(jìn)行qRT-PCR檢測。擴(kuò)增條件: 95℃ 5 min; 95℃ 15 s, 55℃ 30 s, 72℃ 30 s, 共40次循環(huán)；最后72℃延伸10 min，溶解曲線范圍為65℃～95℃。BmE75B的引物序列為BmE75B-F: 5′-CACTCGGTGCTAGTGAGCAT-3′; BmE75B-R: 5′-TGCAGGGCCGGTATTGTATC-3′。BmE75A的引物序列為BmE75A-F: 5′-GGAACGTGAACCTGAA TTGC-3′; BmE75A-R: 5′-TGCAGGGCCGGTATTGT ATC-3′。BmE75C的引物序列為BmE75C-F: 5′-AGTGTTATCCGAAGTTGTCAC-3′; BmE75C-R: 5′-GAATGATGGAGGCTTGAGGA-3′。上述引物序列分別對應(yīng)于BmE75B,BmE75A和BmE75C的N端特異序列。內(nèi)參基因?yàn)榧倚QBmactinA3(GenBank登錄號(hào): U49854)，引物序列BmA3-F: 5′-ATGTGCGA CGAAGAAGTTGC-3′；BmA3-R: 5′-GTCTCCTACGTA CGAGTCCT-3′。

1.5 家蠶miR-2769的合成和BmE75B 3′UTR雙熒光素酶報(bào)告載體構(gòu)建

根據(jù)成熟miR-2769的序列及其與預(yù)測靶基因BmE75B的互作結(jié)合位點(diǎn)序列，由上海吉瑪生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成miR-2769的野生型模擬物miR-2769 mimics(5′-AUAUAUUAUCAGAUUUUCGG UC-3′)、互作位點(diǎn)突變后的miR-2769 mutant(5′-AAUAUAAUUCAGAUUUUCGGUC-3′)及陰性對照miR-2769 NC(5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′)。

以RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成的家蠶脂肪體cDNA為模板，利用BmE75B3′UTR序列的特異引物，PCR擴(kuò)增277 bp目的片段，純化后擴(kuò)增產(chǎn)物和psiCheck2載體分別用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和NotⅠ進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物切膠純化后用T4 DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌液PCR和雙酶切鑒定后的psiCheck2/BmE75B3′UTR陽性克隆送深圳華大基因科技有限公司進(jìn)行測序驗(yàn)證。引物序列為BmE75B3′UTR-XhoⅠ-F: 5′-AGCTCGAGGC CCCGACCTACTTTAAA-3′；BmE75B3′-UTR-NotⅠ-R: 5′-ATGCGGCCGCAATTCGACAACCTGTC-3′(下劃線為酶切位點(diǎn))。

1.6 家蠶miR-2769與靶基因BmE75B的互作分析

HEK293T細(xì)胞于37℃，5% CO2的條件下，用10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。將生長狀態(tài)良好的細(xì)胞提前1 d鋪于24孔板中用于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。將合成的miR-2769 mimics, miR-2769 mutant和miR-2769 NC分別與psiCheck2/BmE75B3′UTR共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，psiCheck2/BmE75B3′UTR質(zhì)粒單轉(zhuǎn)為對照，根據(jù)X-tremeGENE siRNA轉(zhuǎn)染試劑的說明書，優(yōu)化后每個(gè)孔中質(zhì)粒DNA的量為100 ng，miRNA的終濃度為0.1 μmol/L，每組轉(zhuǎn)染3個(gè)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞，根據(jù)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒說明書，對細(xì)胞進(jìn)行裂解，利用化學(xué)發(fā)光儀依次檢測海腎熒光素酶活性與螢火蟲熒光素酶活性，二者的比值為螢火蟲熒光素酶的相對活性(楊娟娟等, 2018)。

1.7 家蠶miR-2769與靶基因BmE75不同剪接體的表達(dá)分析

以1.2節(jié)提取的家蠶5齡幼蟲不同組織、4齡幼蟲到3日齡成蟲整蟲的RNA為模板，利用All-in-oneTMmiRNA qRT-PCR檢測試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后對miR-2769進(jìn)行qRT-PCR檢測，內(nèi)參基因?yàn)榧倚Q5S rRNA(方法同1.3節(jié))。同時(shí)，利用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成上述RNA的cDNA，利用FastStart通用型SYBR? Green預(yù)混液對BmE75B及其不同剪接體BmE75A和BmE75C進(jìn)行qRT-PCR檢測，內(nèi)參基因?yàn)榧倚QBmactinA3 (方法同1.4節(jié))。

1.8 數(shù)據(jù)分析

雙熒光素酶活性檢測結(jié)果，根據(jù)螢火蟲熒光素酶活性進(jìn)行校正，以海腎熒光素酶活性與螢火蟲熒光素酶活性的比值為螢火蟲熒光素酶的相對活性，利用Prism 5.0作圖軟件進(jìn)行作圖和統(tǒng)計(jì)分析。qRT-PCR擴(kuò)增結(jié)果用2-△△Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，針對不同內(nèi)參基因的qRT-PCR擴(kuò)增結(jié)果，先通過計(jì)算兩個(gè)內(nèi)參基因Ct值的幾何平均數(shù)對不同內(nèi)參基因的擴(kuò)增進(jìn)行校正，再用2-△△Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，最后用Prism 5.0軟件進(jìn)行作圖和統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 家蠶miR-2769的序列和表達(dá)分析

以家蠶脂肪體組織RNA反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增miR-2769，擴(kuò)增產(chǎn)物連接pMD-19T克隆載體，連接產(chǎn)物經(jīng)初步鑒定后進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明擴(kuò)增后miRNA序列與成熟miR-2769序列完全一致。利用qRT-PCR檢測miR-2769在20E處理后2, 6, 12和24 h的家蠶5齡第2天幼蟲脂肪體組織中的表達(dá)情況。結(jié)果如圖1所示，與對照相比，miR-2769在20E處理后2, 6 和12 h表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)，24 h時(shí)差異不顯著(P>0.05)。

2.2 家蠶miR-2769靶基因的預(yù)測及表達(dá)分析

通過生物信息學(xué)預(yù)測，發(fā)現(xiàn)miR-2769的一個(gè)靶基因是家蠶的核激素受體基因BmE75的一個(gè)可變剪接體BmE75B。miR-2769第2-8位種子序列與預(yù)測靶基因BmE75B3′UTR存在互補(bǔ)配對(圖2: A)。利用ClustalW2在線分析軟件對BmE75B不同剪接體的氨基酸序列比對，分析結(jié)果表明，BmE75A, BmE75B和BmE75C的氨基酸序列具有不同的N端序列和完全相同的C末端(圖2: B)。同時(shí)BmE75A,BmE75B和BmE75C的3′UTR區(qū)DNA序列也完全一致，因此BmE75A和BmE75C的3′UTR區(qū)也存在miR-2769的結(jié)合位點(diǎn)。

圖1 qRT-PCR檢測miR-2769在20E處理后不同時(shí)間家蠶幼蟲脂肪體中的表達(dá)模式Fig. 1 Expression profiles of miR-2769 in larval fat body of Bombyx mori at different time after treatment with 20E by qRT-PCR處理組中往5齡第2天家蠶幼蟲血淋巴中注射蛻皮激素20E(2 μg/μL)，每頭注射5 μg，對照組注射等體積無菌水稀釋10倍的無水乙醇溶劑。圖3同。In the treatment group, 2 μg/μL of molting hormone 20E (5 μg per individual) was injected into the hemolymph of the day-2 5th instar larvae, while in the control group (CK), an equal volume of ethanol in 10-fold dilution with distilled water was injected. The same for Fig.3. CK: 無水乙醇Ethanol. 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，用雙尾配對t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。Data in the figure are mean±SE, and statistics analysis was performed by two tailed, paired t-test. *P<0.05; ns無顯著差異No significant difference (P>0.05).

為了比較預(yù)測靶基因BmE75B及其剪接體與miR-2769在20E處理后家蠶幼蟲脂肪體組織中的表達(dá)，利用qRT-PCR檢測BmE75B在20E處理組與對照組在2, 6, 12 和24 h脂肪體組織中的表達(dá)。結(jié)果如圖3(A)所示，與miR-2769的表達(dá)(圖1)相反，BmE75B在20E處理后2, 6和12 h表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.001)，24 h時(shí)表達(dá)差異不顯著(P>0.05)。同時(shí)也檢測了BmE75A和BmE75C在相同樣品中的表達(dá)情況，結(jié)果如圖3(B)和3(C)所示，與BmE75B類似，BmE75A在20E處理后2, 6和12 h家蠶幼蟲脂肪體中表達(dá)也顯著升高(P<0.001)，24 h時(shí)表達(dá)差異不明顯(P>0.05)；BmE75C僅在20E處理后6 h時(shí)顯著上調(diào)(P<0.01)， 2, 12和24 h時(shí)與對照相比無顯著差異(P>0.05)。由此可見，在脂肪體中miR-2769與BmE75A和BmE75B的表達(dá)存在負(fù)相關(guān)，推測在家蠶脂肪體中miR-2769可通過與靶基因BmE75 3′UTR的互作調(diào)控BmE75A和BmE75B的表達(dá)。

圖3 qRT-PCR檢測miR-2769靶基因BmE75不同剪接體在20E處理后不同時(shí)間家蠶幼蟲脂肪體中的表達(dá)模式Fig. 3 Expression profiles of different splice isoforms of the target gene BmE75 of miR-2769 in larval fat body of Bombyx mori at different time after treatment with 20E by qRT-PCRA: BmE75B; B: BmE75A; C: BmE75C. 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，用雙尾配對t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析. Data in the figure are mean±SE, and statistics analysis was performed by two tailed, paired t-test. ***P<0.001; **P<0.01; ns無顯著差異No significant difference (P>0.05).

2.3 雙熒光素酶報(bào)告載體系統(tǒng)分析miR-2769與BmE75B的互作

BmE75B3′UTR序列的PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖4(A)所示，擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量大小與理論一致。擴(kuò)增產(chǎn)物連接psiCheck2雙熒光素酶報(bào)告基因載體后的雙酶切鑒定結(jié)果如圖4(B)所示，酶切產(chǎn)物大小與理論分子量相符。構(gòu)建好的psiCheck2/BmE75B3′UTR雙熒光素酶報(bào)告載體經(jīng)測序驗(yàn)證正確。

圖4 BmE75B 3′UTR序列的PCR擴(kuò)增(A)和雙熒光素酶報(bào)告載體psiCheck2/BmE75B 3′UTR的酶切鑒定(B)Fig. 4 PCR amplification of BmE75B 3′UTR (A) and identification (B) of dual luciferase report vector of psiCheck2/BmE75B 3′UTR by restriction digestionM1: DL2000 Plus DNA Ladder; 1: BmE75B 3′UTR PCR擴(kuò)增結(jié)果PCR product of BmE75B 3′UTR; M2: DL2000 DNA Ladder; 2: psiCheck2/BmE75B 3′UTR雙酶切鑒定Identification of psiCheck2/BmE75B 3′UTR with double enzyme digestion.

將psiCheck2/BmE75B3′UTR雙熒光素酶報(bào)告載體分別與合成的miR-2769 mimics, miR-2769 mutant和miR-2769 NC共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，以psiCheck2/BmE75B3′UTR質(zhì)粒單轉(zhuǎn)為對照，利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒檢測轉(zhuǎn)染后各組的海腎熒光素酶活性與螢火蟲熒光素酶活性，二者的比值為螢火蟲熒光素酶的相對活性。結(jié)果如圖5所示，與psiCheck2/BmE75B3′UTR質(zhì)粒單轉(zhuǎn)染對照相比，只有psiCheck2/BmE75B3′UTR與miR-2769 mimics共轉(zhuǎn)染時(shí)，報(bào)告基因的熒光素酶相對活性顯著降低(P<0.05)，而psiCheck2/BmE75B3′UTR與miR-2769 mutant或miR-2769 NC共轉(zhuǎn)染后的酶活性與對照質(zhì)粒無顯著差異(P>0.05)。由此表明，miR-2769能夠通過與靶基因BmE75B3′UTR區(qū)的互作負(fù)調(diào)控BmE75B在翻譯水平的表達(dá)。由于BmE75A和BmE75C的3′UTR也具有miR-2769的作用位點(diǎn)，因此，推測miR-2769也可調(diào)控BmE75A和BmE75C的表達(dá)。

2.4 家蠶miR-2769與靶基因BmE75不同剪接體的表達(dá)分析

利用qRT-PCR進(jìn)一步明確miR-2769及其靶基因BmE75不同剪接體在家蠶變態(tài)發(fā)育不同階段的表達(dá)是否存在負(fù)相關(guān)，結(jié)果如圖6所示，BmE75B在家蠶整個(gè)蛹期不同階段的表達(dá)量相對較高，而miR-2769在所有的發(fā)育階段的表達(dá)量都較低；BmE75A和BmE75C的表達(dá)特征也不同于BmE75B，BmE75A與miR-2769相似，在所有發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量都較低，BmE75C則在5齡末和蛹早期具有極高的表達(dá)量；另由圖中小圖可見，雖然miR-2769與BmE75A的表達(dá)量較低，但二者的表達(dá)仍存在負(fù)相關(guān)。由此表明，miR-2769與BmE75A,BmE75B和BmE75C在家蠶變態(tài)發(fā)育的不同階段均存在一定程度的表達(dá)負(fù)相關(guān)。

圖5 psiCheck2/BmE75B 3′UTR質(zhì)粒與miR-2769轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞后熒光素酶活性分析Fig. 5 Analysis of luciferase activity in HEK293T cells after transfected with psiCheck2/BmE75B3′UTR and miR-27691: psiCheck2/BmE75B 3′UTR單轉(zhuǎn)對照psiCheck2/BmE75B 3′UTR vector control; 2: psiCheck2/BmE75B 3′UTR+miR-2769 mimics; 3: psiCheck2/BmE75B 3′UTR+miR-2769 mutant; 4: psiCheck2/BmE75B 3′UTR+miR-2769 NC. 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上不同字母表示差異顯著(P<0.05, 單因素方差分析, Tukey氏檢驗(yàn))。Data in the figure are mean±SE. Different letters above bars indicate significant difference (P<0.05, one-way ANOVA, Tukey’s test).

圖6 qRT-PCR檢測miR-2769及其靶基因BmE75不同剪接體在家蠶不同發(fā)育階段的表達(dá)模式Fig. 6 Expression profiles of miR-2769 and different splice isoforms of its target gene BmE75 in different developmental stages of Bombyx mori by qRT-PCR 4L2D-5L8D: 分別為4齡第2天至5齡第8天2nd day of the 4th instar to the 8th day of the 5th instar, respectively; PP1-PP9: 分別為蛹期第1-9天1st-9th day of the pupal stage, respectively; A1-A3: 分別為成蟲第1-3天1st-3rd day of the adult stage, respectively. 幼蟲去中腸。圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；小圖為miR-2769和BmE75A調(diào)整坐標(biāo)軸刻度后的表達(dá)量。The midgut of larvae was removed. Data in the figure are mean±SE. Inset shows the expression of miR-2769 and E75A in adjusted Y axis scale.

為了進(jìn)一步分析miR-2769與其靶基因BmE75不同剪接體在家蠶個(gè)體中的表達(dá)情況，首先以家蠶5齡第3天幼蟲不同組織的cDNA為模板，利用qRT-PCR分別對miR-2769和BmE75不同剪接體進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，miR-2769在5齡幼蟲的精巢和卵巢中的相對表達(dá)量較高，其他組織的表達(dá)量相對較少；靶基因BmE75B在精巢、卵巢和脂肪體中的表達(dá)量相對較高，除頭部、表皮、血淋巴和馬氏管中表達(dá)量無顯著性差異(P>0.05)外，其他組織中miR-2769與BmE75B的表達(dá)差異均為顯著(P<0.05)。而BmE75A和BmE75C具有不同于BmE75B的表達(dá)特征，BmE75A在血淋巴和卵巢中表達(dá)量較高，而BmE75C的整體表達(dá)量都不高，但miR-2769與BmE75A和BmE75C在多個(gè)不同組織中的表達(dá)也存在顯著差異(P<0.05)(圖7)。

圖7 qRT-PCR檢測miR-2769及其靶基因BmE75不同剪接體在家蠶5齡幼蟲不同組織中的表達(dá)模式Fig. 7 Expression profiles of miR-2769 and different splice isoforms of its target gene BmE75 in different tissues of the 5th instar larvae of Bombyx mori by qRT-PCR1: 頭部Head; 2: 表皮Epidermis; 3: 血淋巴Hemolymph; 4: 中腸Midgut; 5: 馬氏管Malpighian tubules; 6: 脂肪體Fat body; 7: 絲腺Silk gland; 8: 精巢Testis; 9: 卵巢Ovary. 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上不同字母表示差異顯著(P<0.05, 單因素方差分析)。Data in the figure are mean±SE, and different letters above bars indicate significant difference (P<0.05, one-way ANOVA).

3 討論

miRNAs是一類小分子量的非編碼RNA，主要通過與靶基因的互作調(diào)控mRNA的降解和翻譯抑制。本研究發(fā)現(xiàn)家蠶miR-2769在20E誘導(dǎo)早期的脂肪體中表達(dá)下調(diào)(圖1)，BmE75B作為miR-2769的預(yù)測靶基因，在20E誘導(dǎo)后家蠶脂肪體中的表達(dá)與miR-2769的表達(dá)相反。同時(shí)20E在家蠶脂肪體中可快速誘導(dǎo)BmE75A的高表達(dá)，而BmE75C在20E誘導(dǎo)后表達(dá)升高較慢，且表達(dá)水平相對較低(圖3)。利用NCBI數(shù)據(jù)中的Blast比對分析表明，家蠶的BmE75A,BmE75B和BmE75C與黑腹果蠅DmE75A,DmE75B和DmE75C編碼的氨基酸序列一致性約為50%。研究表明，黑腹果蠅DmE75A和DmE75B被20E誘導(dǎo)后快速高表達(dá)，DmE75C誘導(dǎo)后表達(dá)則較慢且表達(dá)量弱的結(jié)果一致(Bialeckietal., 2002; Bernardoetal., 2009)，由此可見，E75不同剪接體在20E誘導(dǎo)后家蠶和果蠅中具有相似的表達(dá)特征。同時(shí)，前人也研究表明，20E也可誘導(dǎo)家蠶BmE75基因的高表達(dá)(Matsuoka and Fujiwara, 2000; Sweversetal., 2002; Shiraietal., 2012)，且BmE75A,BmE75B和BmE75C對20E具有發(fā)育階段和組織的特異表達(dá)特征(Lietal., 2015)。

利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)研究miR-2769與靶基因的互作，與家蠶中很多miRNAs調(diào)控靶基因的方式類似(Huangetal., 2012; Jiangetal., 2013; Lingetal., 2015; Liuetal., 2018, 2019)，miR-2769能夠通過與靶基因BmE75B3′UTR區(qū)的序列互作調(diào)控靶基因在翻譯水平的表達(dá)，由于BmE75A,BmE75B和BmE75C的3′UTR具有相同的miR-2769互作位點(diǎn)，推測miR-2769也可調(diào)控BmE75A和BmE75C的表達(dá)。結(jié)果表明在家蠶幼蟲脂肪體中，BmE75A和BmE75B在20E誘導(dǎo)家蠶脂肪體后不同時(shí)間的表達(dá)量均與miR-2769的表達(dá)具有負(fù)相關(guān)；在正常家蠶5齡幼蟲的大部分組織中，miR-2769與BmE75B不同剪接體的表達(dá)也都存在負(fù)相關(guān)，由此表明，miR-2769可能通過與BmE75 3′UTR的互作調(diào)控其不同剪接體在不同組織中的表達(dá)。

不同發(fā)育階段和組織中的表達(dá)特征表明，miR-2769與BmE75的不同剪接體在4齡第2天到成蟲不同發(fā)育階段和5齡幼蟲不同組織中的表達(dá)均具有特異性表達(dá)特征。在血淋巴中miR-2769可促進(jìn)BmE75A的表達(dá)，在脂肪體中miR-2769可促進(jìn)BmE75B的表達(dá)，而在其他大部分組織中miR-2769抑制BmE75不同剪接體的表達(dá)(圖7)，推測可能與家蠶不同組織中20E的滴度變化有關(guān)。由于家蠶4齡幼蟲到成蟲為整蟲取樣，整蟲樣品中miR-2769的模板量可能被稀釋，使miR-2769在家蠶不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量整體較低，而BmE75A,BmE75B和BmE75C在不同階段的表達(dá)量則各不相同，尤其BmE75C在5齡末和蛹初期表達(dá)量極高；BmE75B在5齡末、蛹期第1天、蛹期第4天，蛹期第7天和羽化前的變態(tài)發(fā)育時(shí)期表達(dá)量較高(圖6)，該結(jié)果與家蠶變態(tài)發(fā)育過程中20E的滴度變化(Burdette, 1962)基本一致；BmE75A的表達(dá)量則整體較低，但大部分時(shí)間點(diǎn)miR-2769與BmE75不同剪接體的表達(dá)均為負(fù)相關(guān)。在煙草天蛾Manducasexta幼蟲蛻皮和化蛹過程中，檢測到E75A和E75B的表達(dá)與20E水平的升高一致，但E75A的表達(dá)稍早于E75B(Zhouetal., 1998)。由于20E在家蠶不同發(fā)育階段及不同組織的滴度不同，可能使miR-2769與BmE75的不同剪接體在不同組織和不同發(fā)育時(shí)期表現(xiàn)出不同的調(diào)控模式。另外，miR-2769和BmE75B在精巢和卵巢中的表達(dá)量非常高，而BmE75A在卵巢中的表達(dá)量與miR-2769相當(dāng)(圖7)，而非負(fù)相關(guān)。在家蠶、煙草天蛾M.sexta和帕眼蝶Parargeaegeria中卵巢中特異表達(dá)的miR-2763和miR-989，在卵巢的發(fā)育中發(fā)揮作用(Jagadeeswaranetal., 2010; Zhangetal., 2012; Quahetal., 2015)，家蠶miR-2769是否參與卵巢的發(fā)育還有待進(jìn)一步證實(shí)。此外，在雌性果蠅中，DmE75A和DmE75B在卵室發(fā)育和凋亡過程中發(fā)揮相反的作用，DmE75A可誘導(dǎo)哺育細(xì)胞的凋亡，DmE75B可促進(jìn)卵的發(fā)育(Terashima and Bownes, 2006)，二者在家蠶卵發(fā)育中是否具有相似的功能還未見報(bào)道。最近，Liu等(2018)發(fā)現(xiàn)miR-14也可通過與靶基因E75和ECR-B3′UTR的互作參與家蠶幼蟲的發(fā)育過程，由此推測家蠶BmE75基因可能還存在除miR-2769外的其他調(diào)控因子，參與其可變剪接和功能調(diào)控。

綜上所述，miR-2769作為家蠶20E信號(hào)通路中關(guān)鍵基因BmE75新的調(diào)控因子，可通過與靶基因BmE75 3′UTR區(qū)的互作對BmE75不同剪接體進(jìn)行負(fù)調(diào)控，同時(shí)miR-2769與靶基因BmE75不同剪接體在不同發(fā)育時(shí)期和不同組織中具有不同的表達(dá)特征。該研究不僅豐富了miRNAs參與家蠶變態(tài)發(fā)育調(diào)控的功能研究，同時(shí)也為家蠶BmE75不同剪接體的調(diào)控機(jī)制及其在昆蟲變態(tài)發(fā)育過程中的功能研究提供了新的依據(jù)。