杜亞麗, 徐 凱, 趙慧婷, 劉玉玲, 牛慶生,*, 姜玉鎖,*

(1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院, 山西太谷 030801; 2. 吉林省養(yǎng)蜂科學(xué)研究所, 吉林吉林 132108;3. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 山西太谷 030801)

眾所周知，昆蟲通過嗅覺來感知外界環(huán)境中各種氣味物質(zhì)，如信息素、花香物質(zhì)和動物體表揮發(fā)物，從而來確定食物來源、選擇產(chǎn)卵場地、尋找同伴、配偶和合適的寄主、躲避捕食者等(Breer, 2003; Fanetal., 2011; Huaetal., 2012)。識別并解析外界環(huán)境中的化學(xué)信號是維持昆蟲生命的重要機制。在嗅覺信號轉(zhuǎn)導(dǎo)啟動之前，外界的疏水性分子必須滲入嗅覺感器(位于觸角上的微小的毛狀多孔表皮結(jié)構(gòu))內(nèi)，穿過親水性的感器淋巴液到達感覺神經(jīng)元后刺激樹突膜表面特定的嗅覺受體(olfactory receptors, ORs)(Britoetal., 2016)。在這個過程中，由專門的輔助細胞合成并被分泌到感器淋巴器中高濃度分布的氣味結(jié)合蛋白(odorant binding proteins, OBPs)發(fā)揮著關(guān)鍵作用(Leal, 2013; 張玉等, 2019)。盡管在分子水平上對嗅覺機制尚未完全了解，但許多研究表明該類蛋白參與化學(xué)通訊過程，是最先參與嗅覺識別的嗅覺相關(guān)蛋白。OBPs具有多種生物學(xué)功能，其中研究得最多的是保護氣味分子免受氣味降解酶(odorant-degrading enzymes, ODEs)降解以及轉(zhuǎn)運疏水性化學(xué)物質(zhì)通過感器淋巴液到達嗅覺受體的作用(Pelosietal., 2018a)。

1 昆蟲的外周嗅覺系統(tǒng)

昆蟲對氣味分子的識別過程非常復(fù)雜，可以分為兩個系統(tǒng)：(1)外周嗅覺系統(tǒng)：對氣味分子進行結(jié)合和轉(zhuǎn)運，將化學(xué)信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娚硇盘柌⑦M行傳導(dǎo)；(2)中樞神經(jīng)系統(tǒng)：通過軸突傳導(dǎo)至昆蟲中樞神經(jīng)系統(tǒng)，進而引發(fā)昆蟲對氣味分子作出識別反應(yīng)(杜立嘯等, 2016)。其中，昆蟲外周嗅覺系統(tǒng)涉及多種蛋白，主要包括氣味結(jié)合蛋白(OBPs)、嗅覺受體(ORs)、離子型受體(ionotropic receptors, IRs)、感覺神經(jīng)元膜蛋白(sensory neuron membrane proteins, SNMPs)、化學(xué)感受蛋白(chemosensory proteins, CSPs)和氣味降解酶(ODEs)等(莫建初等, 2019)。

OBPs是一類可溶性蛋白，主要負責(zé)外部環(huán)境與ORs之間的連接(Liu Wetal., 2018)。外界環(huán)境中的氣味分子一旦滲入觸角表面的感器微孔，就會被OBPs結(jié)合從而增加其在感器淋巴液中的可溶性；氣味分子-OBP復(fù)合物穿過感器淋巴液到達感器樹突，激活樹突膜上表達的ORs，引起嗅覺神經(jīng)元的興奮(Britoetal., 2016)(圖1)。編碼OBPs的基因數(shù)目因昆蟲種類不同差異很大，有的物種含有幾個，有的甚至高達上百個(Gongetal., 2014; Guetal., 2015; Zhouetal., 2015; Paulaetal., 2016; Heetal., 2017; Kimetal., 2017; Qiuetal., 2018; Quetal., 2019)。昆蟲OBP家族還包括特異結(jié)合和轉(zhuǎn)運信息素到信息素受體(pheromone receptors, PRs)的信息素結(jié)合蛋白(pheromone binding proteins, PBPs)(Dongetal., 2017; Yuetal., 2018)。關(guān)于OBPs的作用模式，目前有兩種假設(shè)：(1)對蛾類和蚊類的研究表明，OBPs起被動載體的作用，且配體可以單獨激活相應(yīng)的ORs(Dambergeretal., 2007)；(2)在某些情況下，OBPs似乎發(fā)揮更直接的作用，只有形成特定的OBP-配體復(fù)合物才能激活受體(Ronderos and Smith, 2010)。

圖1 昆蟲嗅覺過程的示意圖(改自Brito et al., 2016)Fig. 1 Schematic view of the odorant perception process in insects (adapted from Brito et al., 2016)

CSPs是從多個目的昆蟲中鑒定發(fā)現(xiàn)的另一類可溶性小蛋白。與OBPs相比，CSPs的分子量更小，組織分布更廣泛，可以結(jié)合多種化學(xué)物質(zhì)(Zhouetal., 2013)。免疫細胞化學(xué)定位研究表明，在嗅覺感受器淋巴液中的CSPs主要參與昆蟲的化學(xué)信號傳導(dǎo)，如紅火蟻SolenopsisinvictaSinvCSP1在觸角中高表達，在巢內(nèi)同伴信號的識別過程中發(fā)揮重要作用(Gonzálezetal., 2009)。然而，一些在非嗅覺器官中表達的CSPs可能行使其他不同的生理功能(Ozakietal., 2008)。RNAi介導(dǎo)西方蜜蜂ApismelliferaAmelCSP5沉默后，胚胎形態(tài)異常，表明該基因參與蜜蜂胚胎表皮的形成(Maleszkaetal., 2007)；斜紋夜蛾SpodopteralituraSlitCSP3,SlitCSP8和SlitCSP11在中腸中高表達，與寄主植物的選擇有關(guān)(Yietal., 2017)；東亞飛蝗LocustamigratoriaLmigCSP-II在成蟲翅膀上的毛形感器中表達，可能參與接觸性化學(xué)感受過程(Zhou SHetal., 2008)；紅火蟻4齡幼蟲中高表達的SinvCSP9調(diào)控蛻皮過程(Chengetal., 2015)。

與可溶性的OBPs和CSPs相比，SNMPs基因編碼的是一類跨膜蛋白，屬于CD36蛋白家族的一個亞家族，在昆蟲性信息素的化學(xué)通信中發(fā)揮作用(Pregitzeretal., 2014)。研究表明，黑腹果蠅DrosophilamelanogasterDmelSNMP1是T1感器檢測性信息素Z11-18OAc(簡稱cVA)的必需蛋白(Bentonetal., 2007; Jinetal., 2008)，而二化螟ChilosuppressalisCsupSNMP1也與觸角中檢測性信息素的神經(jīng)元緊密相關(guān)(Liuetal., 2013)。

嗅覺受體(ORs)蛋白含有7個跨膜結(jié)構(gòu)域，與脊椎動物GPCRs受體不同源(Benton, 2015)。昆蟲ORs的膜拓撲結(jié)構(gòu)與傳統(tǒng)的GPCR相反，其N末端區(qū)位于細胞內(nèi)(Bentonetal., 2006)。配體特異性O(shè)Rs通常與高度保守的嗅覺受體共受體(odorant receptor co-receptor, Orco)以異源二聚體的形式組成一個配體門控離子通道，此結(jié)構(gòu)可能與昆蟲對外界氣味物質(zhì)及性信息素的識別和區(qū)分有關(guān)(Vosshall and Hansson, 2011)。氣味分子可以特異性地結(jié)合ORs，因此Orco不直接參與氣味識別(Guidobaldietal., 2014)。

離子受體(IRs)雖與離子型谷氨酸受體有關(guān)，但這兩個家族在結(jié)構(gòu)上差異較大，因為昆蟲IRs沒有谷氨酸結(jié)合位點(Knechtetal., 2016; Yuvarajetal., 2018)。IRs僅在不表達ORs或Orco的感覺神經(jīng)元中表達，且與共受體共表達。目前尚未在異源表達系統(tǒng)中研究IRs的功能特性，但對其定位和結(jié)構(gòu)特征分析表明IRs在配體誘導(dǎo)的離子通道過程中發(fā)揮主要作用(Bentonetal., 2009)。

對于以氣味為導(dǎo)向的昆蟲來說，嗅覺系統(tǒng)動力學(xué)要求在毫秒級的時間內(nèi)迅速滅活雜散的氣味分子(Szyszkaetal., 2014)。關(guān)于信號終止目前有兩種假設(shè)：第1種假說為氣味降解酶(ODEs)參與的配體降解，其速度非?？?，可快速終止信號(Ishida and Leal, 2005)；第2種假說認(rèn)為存在一種尚不清楚的負責(zé)信號終止的“清道夫”(Kaissling, 2009)。

2 昆蟲OBPs的一般特性及分類

昆蟲OBPs是一類水溶性的小分子蛋白(13～17 kD)，一般由130～150個氨基酸組成，呈酸性(Ahmedetal., 2017)。但有研究表明，雙翅目的埃及伊蚊Aedesaegypti和半翅目的長紅獵蝽Rhodniusprolixus基因組中發(fā)現(xiàn)的候選OBPs具有更廣范圍的等電點(pI)(Zhou JJetal., 2008; Mesquitaetal., 2015)。根據(jù)一級結(jié)構(gòu)中氨基酸殘基的數(shù)量，OBPs可分為長鏈OBPs(約160個氨基酸)、中鏈OBPs(約120個氨基酸)和短鏈OBPs(約100個氨基酸)。OBPs的氨基酸序列差異很大，同一物種OBPs間的氨基酸同源性可能低于10%，但通常含有6個位置相對保守的半胱氨酸(Cys)(張治科等, 2017)。實驗證明，6個Cys形成了3個連鎖的二硫鍵，其排列方式有助于蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，是昆蟲OBPs的一個保守特征。這種Cys模式已經(jīng)成為昆蟲OBPs的“典型特征”(Pelosietal., 2014)。雖然脊椎動物中也發(fā)現(xiàn)了OBPs的存在，但這些蛋白屬于脂質(zhì)運載蛋白家族，Cys在蛋白穩(wěn)定性方面并未起到關(guān)鍵作用(Bianchietal., 2019)。

根據(jù)功能和氨基酸序列的同源性，鱗翅目OBPs最初被細分為5類：信息素結(jié)合蛋白PBPs，I型普通氣味結(jié)合蛋白(type 1 general odorant binding proteins, GOBP1s)，II型普通氣味結(jié)合蛋白(type 2 general odorant binding proteins, GOBP2s)，I型觸角結(jié)合蛋白(type 1 antennal binding proteins, ABP1s)和II型觸角結(jié)合蛋白(type 2 antennal binding proteins, ABP2s)(Gong DPetal., 2009)。然而，這種分類并不適用于其他昆蟲。根據(jù)保守Cys的模式，OBPs分為Classical OBPs, Minus-C OBPs, Plus-C OBPs, Dimer OBPs和Atypical OBPs。所謂的Classical OBPs氨基酸序列中含有6個保守Cys位點，而Minus-C OBPs只有4個或5個(Britoetal., 2016)。西方蜜蜂AmelOBP14是第一個確定晶體結(jié)構(gòu)的Minus-C OBPs，僅含有2個二硫鍵(Spinellietal., 2012)。Plus-C OBPs至少含有2～3個額外的Cys，且在第6個Cys之后有1個保守的脯氨酸位點(Liu NYetal., 2018)，如煙粉虱BemisiatabaciBtabOBP2就含有9個保守的Cys(謝紅艷等, 2017)。Dimer OBPs是由2個典型的Cys基序聚合在一起形成的(Campanini and de Brito, 2016; Zengetal., 2019)。Atypical OBPs的N端區(qū)域比較典型，C端區(qū)域較長且特征不明顯(Manoharanetal., 2013)。從岡比亞按蚊Anophelesgambiae中鑒定的Atypical OBPs實際上含有2個與Classical OBPs相同的結(jié)構(gòu)域，因此又稱為“two-domain OBPs”，但本質(zhì)上還是屬于dimer OBPs亞家族(Vieira and Rozas, 2011)。

3 昆蟲OBPs在嗅覺感受系統(tǒng)中的作用

Vogt和Riddiford(1981)利用同位素標(biāo)記法，在對鱗翅目多音天蠶蛾Antheraeapolyphemus雄蟲的觸角研究中發(fā)現(xiàn)并鑒定了首個PBPs，其能夠結(jié)合雌蟲分泌的性信息素。隨后，Breer等(1990)在雌性柞蠶Antheraeapernyi觸角中發(fā)現(xiàn)了一類可以結(jié)合并轉(zhuǎn)運普通氣味分子的GOBPs。生物化學(xué)結(jié)合動力學(xué)研究還發(fā)現(xiàn)，OBPs具有運載和滅活氣味物質(zhì)的雙重作用(Vogtetal., 1991; Ziegelberger, 1995)。一項對黑腹果蠅突變體的研究表明OBPs參與氣味分子向ORs的轉(zhuǎn)運過程(Kimetal., 1998)。之后，對豌豆蚜AcyrthosiphonpisumApisOBP3(Qiaoetal., 2009)、梨小食心蟲GrapholitamolestaGmolGOBP2(Lietal., 2016)、淡足側(cè)溝繭蜂MicroplitispallidipesMpalOBP8(楊安, 2018)等的研究證明，OBPs能夠特異性地識別和篩選特定的化學(xué)信號，而不只是被動運輸。對果蠅突變體(Swarupetal., 2011)和蚜蟲(Sun YFetal., 2012)的采集和交配行為分析也表明OBPs確實參與了化學(xué)物質(zhì)的選擇過程。此外，OBPs還可以提高嗅覺系統(tǒng)的敏感性(Vidicetal., 2008; Forstneretal., 2009)。家蠶BmorOR1(蠶蛾性誘醇bombykol受體)和BmorPBP1在黑腹果蠅的神經(jīng)元細胞中共表達時，細胞對bombykol的敏感性顯著高于單獨表達BmorOR1時的敏感性(Syedetal., 2010)。類似地，二化螟C.supressalisPBPs與PRs共存時，PRs對信息素的敏感性可提高4個數(shù)量級(Changetal., 2015)。近幾年的基因敲除、RNA干擾和電生理學(xué)等研究更是直接證明了OBPs是嗅覺系統(tǒng)正常運作必不可少的蛋白(Jiaetal., 2015; Pechlaner and Oostenbrink, 2015; Chenetal., 2018; Huetal., 2019)。

大量研究表明，OBPs在昆蟲嗅覺系統(tǒng)中發(fā)揮著多種重要功能，主要包括：(1)特異性地識別并結(jié)合外界環(huán)境中不同結(jié)構(gòu)的氣味分子，過濾掉那些不需要的或有毒有害物質(zhì)；(2)運輸疏水性的氣味分子穿過水溶性的感器淋巴液到達嗅覺神經(jīng)元樹突膜上的受體蛋白，調(diào)節(jié)其對氣味物質(zhì)的反應(yīng)強度；(3)保護氣味分子免受氣味降解酶的降解；(4)在氣味分子刺激受體后迅速地使其失活，避免持續(xù)刺激導(dǎo)致嗅覺神經(jīng)元過度興奮；(5)清除感器淋巴液中不需要的或有毒的物質(zhì)(Fanetal., 2011; 張玉等, 2019)。

4 昆蟲OBPs在非嗅覺組織中的生理功能

研究表明，行使嗅覺功能的大部分昆蟲OBPs基因均在觸角中特異性高表達，如嘴壺夜蛾OraesiaemarginataOemaPBP1(Fengetal., 2017)、紅棕象甲RhynchophorusferrugineusRferOBP1768(Antonyetal., 2018)和玉米象SitophituszeamaisSzeaOBP35-36(Tangetal., 2019)。但隨著OBPs基因家族成員的增加，人們發(fā)現(xiàn)并非所有OBPs只表達和分布于觸角中，在口器、足、中腸、腺體等非嗅覺器官中同樣有廣泛的表達，暗示它們可能還參與除嗅覺感知以外的其他不同的生理功能。黑花蠅Phormiaregina口器中高表達的PregOBP56a對膳食脂肪酸具有增溶作用(Ishidaetal., 2013)；埃及伊蚊卵巢中高表達的AaegOBP45可能參與卵膜的形成(Costa-da-Silvaetal., 2013)；中華蜜蜂Apisceranacerana足中特異性高表達的AcerOBP15在采集花蜜和花粉時參與味覺識別過程(Duetal., 2019)；黑須庫蚊Culexnigripalpus(Smartt and Erickson, 2009)和長紅錐蝽Rhodniusprolixus(Ribeiroetal., 2014)的腸道中發(fā)現(xiàn)的OBPs可能與營養(yǎng)物質(zhì)或參與腸道功能的其他小分子物質(zhì)的轉(zhuǎn)運有關(guān)；棉鈴蟲HelicoverpaarmigeraHarmOBP10(Sun YLetal., 2012)和西方蜜蜂AmelOBP21(Lietal., 2013)在合成信息素的腺體中表達，參與化學(xué)信息素的合成、儲存與釋放過程；PxylOBP13有助于增強小菜蛾P(guān)lutellaxylostella對菊酯類殺蟲劑的抗性(Bautistaetal., 2015)。此外，吸血昆蟲的OBPs還具有一定的抗炎作用，可作為生物學(xué)標(biāo)記來檢測蚊和白蛉等引起的流行病(Pelosietal., 2018a)。

昆蟲基因組預(yù)測獲得的OBPs不一定都是嗅覺相關(guān)蛋白。例如，黑腹果蠅基因組中共有51個OBPs，但只有7個在成蟲的嗅覺器官中特異性表達(Galindo and Smith, 2001)。家蠶基因組包含44個編碼OBPs的基因，但目前只鑒定出1個PBP和多個GOBPs(Danietal., 2011)。岡比亞按蚊基因組中鑒定獲得66個OBPs，大多數(shù)OBPs除嗅覺器官之外也能在非嗅覺器官中表達(Amenyaetal., 2010)。OBPs家族中的嗅覺蛋白和非嗅覺蛋白具有相同的結(jié)構(gòu)特性，富含螺旋結(jié)構(gòu)。這些蛋白能將疏水性氣味物質(zhì)和其他配體包裹在形成的空腔內(nèi)，從而具有轉(zhuǎn)運揮發(fā)性物質(zhì)穿過水溶性環(huán)境的能力。因此，這種穩(wěn)定的蛋白質(zhì)可表達于各種需要在水相中轉(zhuǎn)運疏水分子的組織中，保護化學(xué)物質(zhì)免于降解，確?；瘜W(xué)物質(zhì)緩慢向環(huán)境中釋放(Britoetal., 2016)。鑒于此，有學(xué)者認(rèn)為應(yīng)該將這些蛋白命名為“膠囊”，以暗示其具有結(jié)合并轉(zhuǎn)運配體的一般作用(Leal, 2006)。

5 昆蟲OBPs的三維結(jié)構(gòu)及其作用機理

研究蛋白功能最基礎(chǔ)的就是要搞清楚蛋白質(zhì)及其復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)，從而在分子水平上進行功能研究來闡明其本質(zhì)。目前蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的測定主要有三大技術(shù)：X-射線晶體學(xué)、核磁共振(NMR)和冷凍電鏡三維重構(gòu)技術(shù)，而昆蟲OBPs的三維結(jié)構(gòu)大多是利用前兩種方法進行解析的。自Sander等(2000)首次采用X-射線晶體學(xué)獲得BmorPBP1-bombykol的晶體結(jié)構(gòu)(pH 8.2)以來，已對鱗翅目、雙翅目、膜翅目、直翅目、半翅目、脈翅目、蜚蠊目等多種昆蟲OBPs的單體或復(fù)合結(jié)構(gòu)進行了解析(表1)。昆蟲OBPs通常由6個α-螺旋結(jié)構(gòu)域組成，由3個二硫鍵兩兩連接，折疊形成非常緊密和穩(wěn)定的疏水性結(jié)合腔，在一定程度上增加了OBPs結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性(胡穎穎等, 2013)。這與脊椎動物折疊方式完全不同，其典型結(jié)構(gòu)為8個反平行的β-折疊和1個短的α-螺旋(緊靠C端)(Floweretal., 2000; Ramonietal., 2007)。

昆蟲OBPs的構(gòu)象變化具有pH依賴性(Leeetal., 2002; Xuetal., 2010; Tianetal., 2016)。BmorPBP1的6個α-螺旋由3個二硫鍵連接，以錐形排列方式形成一個緊密結(jié)構(gòu)(Sandleretal., 2000)。BmorPBP1的C端區(qū)域主要由非極性氨基酸組成，但位于螺旋表面的Asp132, Glu137和Glu141為酸性氨基酸。在酸性pH下，Asp132(或臍橙螟AtraPBP1的Glu132)和Glu141與質(zhì)子化的組氨酸殘基His形成鹽橋，促進C端第7個α-螺旋形成并占據(jù)結(jié)合腔引起配體釋放，該機制又被稱為組氨酸質(zhì)子化作用開關(guān)，是OBPs向ORs傳遞信息素的活性機制(Xu and Leal, 2008; Xuetal., 2010)。中性pH時，去質(zhì)子化的His使鹽橋破裂，導(dǎo)致第7個螺旋從結(jié)合腔向外排出，使蛋白核心中的疏水性殘基暴露，與信息素相互作用并結(jié)合(Xu and Leal, 2008)。這種現(xiàn)象并非所有鱗翅目PBPs所共有。多音天蠶蛾ApolPBP1的α3中間存在一個扭結(jié)，使Asn53的側(cè)鏈成為信息素結(jié)合腔的一部分，中性pH時一般不結(jié)合配體。酸性pH下組氨酸發(fā)生質(zhì)子化，Asn53遠離蛋白核心，引起α1, α3和α4重新定向，結(jié)合腔打開釋放出配體(Zubkovetal., 2005; Gongetal., 2010)。此外，對舞毒蛾LymantriadisparLdisPBPs的配體反應(yīng)動力學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，LdisPBP2首先與配體通過擴散控制碰撞形成中間復(fù)合物，然后配體從外部結(jié)合位點重新定位到不同的內(nèi)部結(jié)合位點，從而產(chǎn)生更穩(wěn)定的配體-OBP復(fù)合物，為鱗翅目OBPs配體結(jié)合的另一機制的存在提供了依據(jù)(Gong Yetal., 2009)。

表1 已解析三維結(jié)構(gòu)的氣味結(jié)合蛋白Table 1 Odorant binding proteins with three-dimensional structures resolved

續(xù)表1 Table 1 continued

QMP: 蜂王上顎腺信息素Queen’s mandibular gland pheromone. 括號中文字表示X射線衍射的光波長。The text in brackets indicates the optical wavelength of X-ray diffraction.

與鱗翅目不同，大多數(shù)雙翅目OBPs的C端區(qū)域較短，如同結(jié)合腔上的“蓋子”，不能形成占據(jù)配體結(jié)合腔的新螺旋。比如，岡比亞按蚊AgamOBP1、埃及伊蚊AaegOBP1和致倦庫蚊CquiOBP1的pH依賴性構(gòu)象變化與結(jié)合親和力的喪失相關(guān)(Wogulisetal., 2006; Leiteetal., 2009; Maoetal., 2010)。這個“蓋子”是由3個對pH變化極其敏感的保守氫鍵在適當(dāng)?shù)奈恢眯纬傻摹４送?，這些OBPs的C末端只有最后1個氨基酸存在差異，如AgamOBP1和CquiOBP1的Val125、AaegOBP1的Ile125，其羧酸氧基分別與Tyr54的羥基、His23的δ-氮基和Arg23形成氫鍵。當(dāng)OBP-氣味分子復(fù)合物到達樹突膜附近的時候，局部pH降低，羧酸鹽質(zhì)子化使氫鍵被破壞，導(dǎo)致C末端遠離結(jié)合腔，從而“打開蓋子”并促進配體釋放(Leiteetal., 2009; Maoetal., 2010)。

西方蜜蜂AmelASP1的配體親和力雖呈pH依賴性，但作用方式與鱗翅目和雙翅目OBPs正好相反。pH 4.0時，AmelASP1與蜂王信息素的主要成分9-ODA具有很高的結(jié)合親和力，而pH 7.0時，ASP1疏松的C末端可以與另一個ASP1分子的N末端聚合形成結(jié)構(gòu)域二聚體，其配體親和力比酸性pH時低10倍。(Pesentietal., 2008)。該二聚化反應(yīng)可能與Asp35密切相關(guān)，因此突變體Asp35Asn和Aps35Ala在不同pH條件下的單體結(jié)構(gòu)完全相同(Pesentietal., 2009)。

雖然在NCBI GenBank中注冊的半翅目昆蟲OBPs已達到300多個，但直到最近才解析了蚜蟲OBPs的晶體結(jié)構(gòu)(Northeyetal., 2016)。巢菜修尾蚜Megouraviciae和萵苣蚜NasonoviaribisnigriOBP3的結(jié)構(gòu)與Classical OBPs相似：6個保守的Cys形成3個二硫鍵，6個螺旋由延伸的環(huán)狀結(jié)構(gòu)連接。但這2個蛋白表面都有一個結(jié)合凹槽，主要由N端區(qū)域和部分螺旋α1和α2形成，沒有明顯的內(nèi)部結(jié)合腔(Northeyetal., 2016)。分子動力學(xué)表明，兩蛋白的Tyr30與配體間的互作及其結(jié)合前后的取向在配體結(jié)合過程中起關(guān)鍵作用，但這兩個蛋白的特殊結(jié)構(gòu)特征還需進一步評估，以充分闡明其在報警信息素感知過程中的作用。

6 昆蟲OBPs的配體結(jié)合特性和激活ORs的作用模式

6.1 昆蟲OBPs結(jié)合特性的研究方法

在早期的PBPs結(jié)合特性研究中，經(jīng)氚及放射性標(biāo)記的信息素常被用于定性結(jié)合分析(Plettneretal., 2000)。隨著重組蛋白的可用性，Leal等(2005a)制定了一種不需放射性配體的“冷凍結(jié)合分析法”，能夠在單一實驗中從有機混合物中鑒定出OBPs的最佳配體。目前，熒光競爭結(jié)合實驗是研究OBPs與候選配體結(jié)合特性最常用的方法，可通過比較OBPs與生理相關(guān)化合物的結(jié)合親和力，評估它們優(yōu)先轉(zhuǎn)運某些配體的能力(Zhuangetal., 2013)。但該方法有一定的局限性，需要一種與目標(biāo)蛋白質(zhì)具有一定親和力的熒光探針，比如1-氨基蒽(AMA)(Campanaccietal., 2001)、1-苯胺-8-萘磺酸(ANS)(Wojtasek and Leal, 1999; Lartigueetal., 2003)和N-苯基-1-萘胺(1-NPN)(Pelosietal., 2018c)。在找不到合適熒光探針的情況下，通過測定色氨酸的固有熒光以監(jiān)控配體結(jié)合特性也是可行的(Lealetal., 2005a)。例如，對ApolPBP1與其信息素混合物組分(E6,Z11)-六癸二醛、(E6,Z11)-六癸二烯基-1-乙酸鹽和(E4,Z9)-四癸二烯基-1-乙酸鹽之間的固有熒光變化進行觀察，發(fā)現(xiàn)ApolPBP1存在3種不同類型的配體結(jié)合模式(Betteetal., 2002)。

OBPs與不同配體之間的結(jié)合勢也可以通過分子對接和分子動力學(xué)等電腦模擬進行估算(Venthuretal., 2014)。對金龜子甲蟲HylamorphaelegansOBPs和矮假山毛櫸Nothofagusobliqua揮發(fā)物的模擬分析表明，HeleOBPs與倍半萜烯類化合物有較高的互作能值，且疏水氨基酸主要參與這些互作(González-Gonzálezetal., 2016)。Song等(2018)也使用此方法評估了AcerOBP11與小分子物質(zhì)之間的親和力，發(fā)現(xiàn)Ile97, Ile140和Phe101是該蛋白的關(guān)鍵結(jié)合位點。

6.2 昆蟲OBPs的配體結(jié)合特性

OBPs是昆蟲體內(nèi)多種疏水性物質(zhì)的有效載體，與小分子有機化合物的結(jié)合力是OBPs生理功能研究的必要依據(jù)。PBPs(至少對鱗翅目昆蟲來說)對信息素具有很強的結(jié)合特異性，比如BmorPBP1只能特異性識別bombykol(Sandleretal., 2000)。但也有證據(jù)表明，除了性信息素組分及其類似物外，PBPs還可以與普通氣味物質(zhì)結(jié)合(Jinetal., 2014; Jiaetal., 2015; Songetal., 2018)。相對于PBPs來說，GOBPs具有相當(dāng)廣泛的配體親和特性，能夠結(jié)合多種不同種類的氣味物質(zhì)，除結(jié)合宿主植物揮發(fā)物以外，部分還偏好性地結(jié)合特定的性信息素組分(Heetal., 2010; 陳東凱等, 2018; Jingetal., 2019)。例如，梨小食心蟲GmolGOBP1對寄主植物揮發(fā)物和性信息素成分存在雙重識別功能，而GmolGOBP2主要參與對十二烷醇(一種次要性信息素)的感知(Lietal., 2016)；LstiGOBP2對植物揮發(fā)物(E)-2-己烯醛、(Z)-3-exen-1-ol和信息素組分(E)-11-十四烯-1-基乙酸鹽均有很高的親和力(Yinetal., 2012)；中紅側(cè)溝繭蜂MicroplitismediatorMmedOBP18除與16種植物揮發(fā)物結(jié)合，還與性信息素組分(Z)-9-十四碳烯醛和(Z)-11-十六碳醛有較強的結(jié)合(宋玄等, 2019)。此外，OBPs還可以與非揮發(fā)性代謝物相結(jié)合。果蠅DmelOBP49a能夠直接與苦味物質(zhì)結(jié)合，并將其轉(zhuǎn)運到味覺受體上(Jeongetal., 2013)；苜蓿盲蝽Adelphocorislineolatus和三點盲蝽Adelphocorisfasciaticollis口器中高度表達的OBP11可以優(yōu)先結(jié)合寄主植物的非揮發(fā)性次生代謝物，在味覺感受系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用(Sunetal., 2016; Li ZBetal., 2019)；黑花蠅唾液中的脂肪酶可將體內(nèi)的甘油三酯水解為游離脂肪酸，這時對長鏈脂肪酸有高親和力的PregOBP56a就會結(jié)合并將其轉(zhuǎn)運至腸道(Ishidaetal., 2013)

6.3 OBPs激活ORs的作用模式

迄今為止，ORs的激活機制提出兩個作用模型：第1個模型表明氣味物質(zhì)本身單獨激活了受體，而第2個模型支持ORs被特定的OBP-氣味復(fù)合物激活的觀點。上述關(guān)于蛾類和蚊類的研究支持第一種假設(shè)，即氣味分子被包裹在OBPs的結(jié)合腔中，協(xié)助其通過感器淋巴液，從而避免被ODEs降解；當(dāng)復(fù)合物到達神經(jīng)元樹突區(qū)域時，OBPs-配體復(fù)合物在較低的pH下快速分離，配體以獨立的方式激活ORs(Horstetal., 2001)。有研究表明，在OBPs缺失的情況下，ORs可以被其特定配體激活，與該模型完全一致(Nakagawaetal., 2005)。

然而，黑腹果蠅的氣味結(jié)合蛋白LUSH的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方式與第一種假設(shè)完全相反(Xuetal., 2005)。Lush缺陷突變體的研究表明，LUSH蛋白對于典型的cVA-誘導(dǎo)行為和T1神經(jīng)元的正常敏感性是必要的(Stowers and Logan, 2008)。結(jié)構(gòu)研究指出，LUSH不是cVA的被動載體，其構(gòu)象變化主要通過OR67d和SNMP介導(dǎo)激活T1神經(jīng)元，而LUSH從靜息狀態(tài)的非活性形式轉(zhuǎn)化為能夠觸發(fā)T1神經(jīng)元激活的活性構(gòu)象正是由cVA刺激引起的(Jinetal., 2008; Laughlinetal., 2008)。這些結(jié)果與OBP-氣味復(fù)合物激活ORs的模型相一致。也有學(xué)者對上述模型提出質(zhì)疑，他們認(rèn)為cVA可以在沒有LUSH蛋白的情況下激活神經(jīng)元，但不能沒有SNMP或OR67d(Gomez-Diazetal., 2013)。

7 昆蟲OBPs的應(yīng)用現(xiàn)狀

明確候選化合物與嗅覺相關(guān)蛋白的分子互作，有利于研制新的昆蟲引誘劑或驅(qū)蟲劑，對于制定能夠干擾嗅覺介導(dǎo)行為反應(yīng)的傳播媒介控制新策略至關(guān)重要。由于氣味分子在沒有OBPs的情況下不能到達ORs，因此功能性O(shè)BPs可以作為篩選昆蟲引誘劑或驅(qū)蟲劑的分子靶點，其方法類似于“反向化學(xué)生態(tài)學(xué)”。此外，與ORs相比，OBPs具有分子量小、可溶性強、穩(wěn)定性好、易于操作和修飾等優(yōu)點，是更容易體外獲得的研究對象。反向化學(xué)生態(tài)學(xué)方法依據(jù)化合物與嗅覺蛋白的結(jié)合親和力，從而減少了氣味候選化合物的數(shù)量，與在該領(lǐng)域常用的傳統(tǒng)試錯篩選法相比，節(jié)省時間并降低研究成本。該策略首次成功應(yīng)用于臍橙螟引誘劑的研制(Lealetal., 2005b)。之后Leal(2013)以CquiOBP1為結(jié)合靶點，結(jié)合反向和常規(guī)化學(xué)生態(tài)學(xué)方法來鑒定非天然配體，該研究促進了商品化的致倦庫蚊產(chǎn)卵引誘劑的研發(fā)。

目前，主要通過電腦模擬方法對“反向化學(xué)生態(tài)學(xué)”進行改進，以減少候選化合物的數(shù)量和加速新化學(xué)物質(zhì)發(fā)現(xiàn)，具體方法為：先采用電腦模擬方法進行篩選，隨后通過熒光光譜法、量熱法、核磁共振或者測量結(jié)合配體的數(shù)量等不同方法來體外評估OBPs和預(yù)選配體之間的結(jié)合親和力。最后，通過生物測定和田間試驗驗證昆蟲對最佳配體的行為反應(yīng)(Jayanthietal., 2014)。鑒于此，閻偉等(2017)結(jié)合同源建模和分子對接方法篩選潛在的活性揮發(fā)物用于防控銹色棕櫚象Rhynchophorusferrugineus。

昆蟲OBPs除了作為開發(fā)昆蟲種群管理新產(chǎn)品的分子靶點之外，還在其他技術(shù)目的領(lǐng)域方面有一定的應(yīng)用。OBPs對小分子有機物質(zhì)具有親和力和特異性?；诖?，有學(xué)者合成了由家蠶BmorPBP1和致倦庫蚊CquiOBP1衍生的親和色譜柱(Margaryanetal., 2006)。同時，OBPs對酸堿、高溫的耐受性高，也可作為一種生物敏感材料，通過模擬生物嗅覺來檢測復(fù)雜環(huán)境中的不同化學(xué)物質(zhì)(盧妍利, 2017; Pelosietal., 2018b)。Larisika等(2015)就設(shè)計了一種基于還原石墨烯氧化物晶體管的嗅覺生物傳感器，該晶體管與AmelOBP14共同發(fā)揮作用，能夠?qū)崟r監(jiān)測環(huán)境中的各種氣味。類似地，桔小實蠅OBPs也被用于高阻抗嗅覺傳感器來檢測寄主植物揮發(fā)物(Luetal., 2015)。近年來，根據(jù)完整OBPs的結(jié)合域合成有效長度的小分子肽段，為高選擇性生物傳感器的研發(fā)提供了新的仿生材料(Wasilewskietal., 2019)。此外，OBPs對熱變性和蛋白降解的特殊穩(wěn)定性使其可以作為活性色譜相，直接用于分辨信息素或其他天然化合物的外消旋混合物(Pelosietal., 2014)。

8 小結(jié)與展望

盡管近十年來昆蟲嗅覺領(lǐng)域的研究取得了顯著的進展，但對于昆蟲嗅覺感知的進一步研究還很匱乏，仍然無法揭示OBPs參與化學(xué)感受的分子機制。OBPs如何向ORs釋放氣味, ORs如何被激活, OBPs在這些分子的特異性選擇中是否發(fā)揮作用,以及不同OBPs之間是否存在相關(guān)性等等，這些問題仍然是昆蟲嗅覺領(lǐng)域爭論的焦點。已有研究發(fā)現(xiàn)，昆蟲嗅覺相關(guān)蛋白的作用和作用機制似乎在朝著不同的方向發(fā)展，但考慮到昆蟲種類繁多，這也是正常的。不過，OBPs可以作為氣味和信息素的載體，使其免受降解并順利通過感器淋巴液，仍然是最廣泛接受的假說。深入開展OBPs的生理功能研究有助于進一步揭示昆蟲的化學(xué)感受機制，為昆蟲引誘劑或驅(qū)蟲劑、生長發(fā)育調(diào)節(jié)劑的研制提供新思路。此外，通過計算機軟件模擬篩選OBPs的最佳作用配體，正在成為化學(xué)生態(tài)學(xué)領(lǐng)域的一個非常重要的工具，該技術(shù)的發(fā)展將為昆蟲行為監(jiān)控，蟲媒傳播疾病預(yù)防以及進一步的害蟲防治提供一種有效策略。

OBPs能夠行使除嗅覺以外的其他生理功能，值得進一步驗證與研究。這將意味著昆蟲OBPs不僅可以作為嗅覺傳感器的仿生材料，還可用于環(huán)境、食品質(zhì)量監(jiān)控及醫(yī)療設(shè)備等領(lǐng)域。另外，由于昆蟲OBPs易于修飾和表達，在不改變OBPs結(jié)構(gòu)的情況下通過定點突變技術(shù)來獲得更加穩(wěn)定、高選擇性、高靈敏度的特定OBPs，為生化檢測和疾病診斷提供新機遇。