蔣自衛(wèi)

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞(T regulatory lymphoey cell,Treg )可抑制T細胞免疫反應,正常外周血中 CD4+CD25+Treg 約占CD4+T細胞的5%～10%。越來越多的研究表明CD4+CD25+Treg在人類體內(nèi)對誘導和維持免疫耐受起著重要作用且與多種疾病的免疫有關(guān)[1-6]。CD25既是CD4+CD25+Treg的特征性標志,又是T細胞激活的標志,因此,不能僅借助CD25將兩者鑒別開來,而Foxp3是Treg的主要轉(zhuǎn)錄因子,可調(diào)控Treg的生長發(fā)育與功能效應[6-7],故以CD4+CD25+Foxp3+標志Treg更為可靠。本研究旨在探討HCV感染時外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg出現(xiàn)的頻率及其與HCVRNA含量的相關(guān)性。

資料與方法

一、材料

(一)研究對象 收集2015年1月至2016年12月南京二院所收治的慢性丙型肝炎患者50例、以及獻血人群中HCV攜帶者50例和正常健康對照者50例。各組年齡、性別比具有可比性。HCV 攜帶者及慢性丙型肝炎患者最近半年未使用抗病毒或免疫調(diào)節(jié)治療，均未重疊HBV、HIV等感染,未合并自身免疫性疾病和糖尿病等。

二、方法

(一)主要儀器和試劑 FACSCalibur流式細胞儀(BD公司)lighteyeler熒光定量PCR儀(瑞士),Biofuge pico 離心機(Germany ),CD4、CD25抗體(BD公司),PE anti一human Foxp3染色試劑(eBioscinece公司)HCV RNA定量試劑(深圳匹基生物工程公司)。

(二)CD4+CD25+Foxp3+Treg檢測 取枸椽鈉抗凝血100 μL,經(jīng)Fieoll分離出PBMC,先與熒光標記的CD4,CD25抗體,孵育再和PEanti-human Foxp3+試劑孵育,利用FACSCalibur流式細胞儀檢測,可得CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞在CD4+T細胞中比率。

(三)HCVRNA定量檢測[8]采用熒光定量聚合酶鏈反應(FQ-PCR )樣本處理:各取血清樣本100 μL,加入300 μL核酸提取液(200 mL Trizol,3 mol/L NaAc 6 mL,10 mg/mL tRNA 120 μL),用移液器反復吹打混勻,室溫放置5 min,加100 μL三氯甲烷,用手來回振蕩混勻15 s,室溫放置5 min,4 ℃ 1 200 rpn 離心15 min,將上清移入新的離心管,加入200 μL異丙醇,振蕩5 s,室溫沉淀10 min ,4 ℃ 1 200 rpn 離心10 min ,棄上清,再加入500 μL預冷的乙醇洗滌,上下顛倒10次,4 ℃ 1 200 rpn 離心5 min ,吸干上清,沉淀室溫干燥15 min ,即可定量檢測。陰性對照處理方法與標本相同。

PCR擴增:按待擴增樣本數(shù)n ,取PCR緩沖液(500 mmol/L Tris-HCI,10 mmo1/L MgCl2,250 mmol/L KCI,1 mg/mL明膠)n x×2.5 μL,MgCl2n×2.5 μL,HCV熒光探針n×2.5 μL,Taq酶n×2.5 μL混于一個離心管中,旋渦振蕩器上振蕩10 s,按每反應管20 μL分裝。取上述處理樣本5 μL,加入反應管中,振蕩混勻,低速離心數(shù)30 s,每個反應管中取出20 μL加入對應的毛細管中,低速離心15 s,取出置lightcycler檢測儀上。

擴增條件:在50 ℃反應2 min,然后94 ℃ 保溫5 min,再93 ℃ 20 s,52 ℃ 20 s,65 ℃ 15 s循環(huán)40次。在Proportional計算方式下判斷結(jié)果,檢測靈敏度500拷貝/mL,>500拷貝/mL為陽性。

(四)統(tǒng)計學處理 采用方差分析比較慢性丙型肝炎患者、HCV感染者與正常對照者之間CD4+CD25+Foxp3+Treg的差異,采用直線相關(guān)性分析HCVRNA載量(轉(zhuǎn)為自然對數(shù))與CD4+CD25+Foxp3+Treg 的相關(guān)性。

結(jié) 果

一、各組外周血CD4+CD25+Foxp3+ Treg在CD4+中的頻率

外周血CD4+T細胞中CD4+CD25+Foxp3+Treg 出現(xiàn)的頻率慢性活動性丙型肝炎者和HCV攜帶者均高于健康對照者(P<0.01),慢性丙型肝炎者高于HCV攜帶者(P<0.05)，見表1。

表1 各組人群外周血CD4+CD25+Foxp3+ Treg在CD4+T細胞中的頻率

*P<0.01;#P<0.05

二、CD4+CD25+Foxp3+ Treg與HCVRNA病毒載量的相關(guān)性

HCVRNA病毒載量轉(zhuǎn)化為自然對數(shù)后與CD4+CD25+Foxp3+Treg在CD4+T 細胞中的頻率進行直線相關(guān)性分析,見表2。外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg在CD4+T 細胞中的頻率與HCVRNA病毒載量呈正相關(guān)性(r=0.79 ,P<0.01)。

表2 HCVRNA載量與CD4+CD25+ Foxp3+ Treg頻率相關(guān)性(±s %)

r=0.79;P=0.006

討 論

CD4+CD25+Treg具有免疫抑制性及免疫無能性,主要表現(xiàn)在:經(jīng)TCR介導的信號刺激活化后能抑制CD4+、CD8+T細胞的活化與增殖以及細胞因子的分泌;對高濃度IL-2 的單獨刺激、固相包被或可溶性抗-C3 單抗以及抗C3單抗、抗CD28單抗的聯(lián)合作用呈無應答狀態(tài)[9]被人們認為與機體免疫耐受有關(guān)。一些研究[10-11]表明Tregs起著免疫自穩(wěn)的功能,避免引起自身免疫反應過度及自身免疫疾病的發(fā)生,Treg Foxp3過度表達會導致機體免疫應答下降,產(chǎn)生免疫耐受。

本次結(jié)果顯示外周血CD4+T 細胞中CD4+CD25+Foxp3+Treg的比例數(shù)在慢性丙型肝炎組和HCV攜帶組均高于健康對照組(P<0.01 ),且慢性丙型肝炎組高于HCV攜帶組(P<0.05)。表明慢性肝炎和HCV攜帶者存在著調(diào)節(jié)性T 細胞的Foxp3+過度表達,CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性細胞可能參與了丙型肝炎病毒感染慢性化的過程。在丙型肝炎患者中,CD4+CD25+Foxp3+Treg可能加強了對病毒特異性CD8+T淋巴細胞增殖的抑制作用[12],這種作用與外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg高頻率出現(xiàn)直接相關(guān)。慢性丙型肝炎CD4+CD25+Foxp3+Treg出現(xiàn)的頻率更高,說明慢性HCV感染導致CD4+CD25+Foxp3+Treg增多,而CD4+CD25+Foxp3+Treg能夠抑制CD8+T 淋巴細胞對不同病毒抗原的應答，這一現(xiàn)象也提示CD4+CD25+Foxp3+Treg可能促進了丙型肝炎患者感染的持續(xù)化。有資料顯示表型為CD4+CD25+Foxp3-的T 細胞在體外用TGFβ刺激,其表型可轉(zhuǎn)化CD4+CD25+Foxp3+,在體內(nèi)有可能慢性肝炎能產(chǎn)生某些因子,刺激CD4+CD25+Foxp3+Treg的增生與成熟。因此,我們認為HCV 感染導致了CD4+CD25+Foxp3+Treg 增殖與活化,患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg的頻率升高促進機體對病毒的免疫應答不完全,導致慢性活動性感染。