董文珠，陳杭萍，陳賽貞，夏哲林，章 欣，姚 立△

(1.臺州市中心醫(yī)院藥劑科，浙江臺州 318000；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院研究所，杭州 310053)

乳腺癌是當(dāng)今最常見的惡性腫瘤，病死率為所有女性惡性腫瘤的第二位，僅次于肺癌[1]。不論是在發(fā)達地區(qū)還是其他地區(qū)，乳腺癌發(fā)病率都呈現(xiàn)上升趨勢。2016年來自于美國的官方統(tǒng)計數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)：美國女性中乳腺癌的患病人數(shù)達到246 660例，占所有女性癌癥患者的29.00%，高居所有癌癥的榜首，其死亡人數(shù)達到40 450例，占總死亡人數(shù)的14.00%。美國國家腫瘤研究所預(yù)測，每個女性至少有13.20%的風(fēng)險患乳腺癌[2-4]。盡管乳腺癌治療在現(xiàn)代技術(shù)的發(fā)展中已經(jīng)取得了諸多成就，但乳腺癌背后的分子機制仍是癌癥研究領(lǐng)域的焦點。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類由非蛋白編碼基因轉(zhuǎn)錄物形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)前體，剪切成熟后形成的長度為20～25 nt的小RNA分子，與其他蛋白質(zhì)編碼基因mRNA轉(zhuǎn)錄本反向互補，由DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生，但并不翻譯成蛋白質(zhì)，而是通過調(diào)節(jié)其他基因的功能來影響目標(biāo)蛋白的合成，miRNA生物學(xué)效應(yīng)廣泛，對個體發(fā)育、細胞分化、增殖和凋亡等生理調(diào)控起著重要的作用[5]。研究表明，超過50%的編碼基因位于與腫瘤相關(guān)的基因位點，這說明可能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色[6]。ZENG等[7]發(fā)現(xiàn)，miRNA-133b能夠通過靶向調(diào)控表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)，進而抑制食管鱗狀癌細胞的增殖、遷移和侵襲。YANG等[8]發(fā)現(xiàn)，miRNA-20a和miRNA-486是結(jié)腸癌潛在的腫瘤標(biāo)志物。目前已有研究表明miRNA-628-3p在胃癌中表達，且與其癌旁配對正常組織相比表達降低[9-10]；并有研究指出上調(diào)miRNA-628-3p的表達能夠促進胃癌細胞凋亡，抑制細胞增殖[11]。然而，miRNA-628-3p在乳腺癌當(dāng)中的作用及機制并未明確。因此，本文旨在研究miRNA-628-3p對乳腺癌細胞增殖作用的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞 正常乳腺上皮細胞(MCF-10A)與乳腺癌細胞(MCF-7、MDA-MB-231)購自中國科學(xué)院上海細胞庫。

1.1.2試劑 DMEM/F-12(1∶1)、胎牛血清購自美國Hyclone公司；青霉素-鏈霉素購自杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；霍亂霉素、胰島素、氫化可的松、噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自上海碧云天公司； Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime Script RT Reagent Kit 和SYBR Prime Script miRNA RT-PCR Kit購自日本Takara公司；miR-628-3p模擬物(miR-628-3p mimic)和多聚腺苷酸結(jié)合蛋白互作蛋白1(PAIP1)-siRNA轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 Transfection購自山東維真生物科技有限公司；一抗(PAIP1，GAPDH)、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗購自美國Cell Signaling Technology公司；電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影液購自美國Bio-Rad公司。

1.1.3儀器 MCO-15AC型二氧化碳培養(yǎng)箱購自日本SANYO； Nikon ECLIPSE TT-E型熒光倒置顯微鏡購自Nikon EclipSE Ti；Bio-Rad電泳儀、Bio-Rad多功能酶標(biāo)儀和Bio-Rad熒光定量PCR儀均購自美國Bio-Rad公司；Chemiscope 3300min化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購自CLinx Science Instruments。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) MCF-7、MDA-MB-231細胞株培養(yǎng)于含10%的胎牛血清、青霉素200 U/mL、鏈霉素200 U/mL的完全培養(yǎng)液DMEM/F12(1∶1)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2天換液1次，待80%～90%融合后，以0.25%胰蛋白酶消化，按1∶3傳代，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，取對數(shù)期細胞用于實驗。MCF-10A細胞株培養(yǎng)于含5%馬血清、胰島素10 μg/mL、霍亂霉素100 ng/mL、內(nèi)皮生長因子(ECGS)20 ng/mL、氫化可的松0.50 μg/mL、青霉素200 U/mL、鏈霉素200 U/mL的完全培養(yǎng)液DMEM/F12(1∶1)。

1.2.2RT-PCR實驗檢測miR-628-3p表達量 使用Trizol試劑從MCF-7細胞中提取總RNA。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime Script RT Reagent Kit和SYBR Prime Script miRNA RT-PCR Kit反轉(zhuǎn)錄并進行RT-PCR。miR-628-3p上游引物序是5′-CTT CGA CTG CCA CTC TTA-3′， 5′-TGT CAC TTC CTC ATG CTG-3′為下游引物序列。miR-628-3p內(nèi)參是U6，U6上游引物序列5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′， 5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′為下游引物序列。

1.2.3miRNA-628-3p mimic、空載體陰性對照(NC)、PAIP1-siRNA及si-NC轉(zhuǎn)染 將miR-628-3p mimic、NC及PAIP1-siRNA干粉用RNase-free水配制成20 μmol/L的母液后分裝、凍存?zhèn)溆?。將MCF-7細胞消化后鋪在6 cm的培養(yǎng)皿中，過夜至細胞密度達70%左右。培養(yǎng)基后加入無血清MEM培養(yǎng)基，按照Lipofectamine 2000 Transfection試劑盒要求進行轉(zhuǎn)染。孵育6～8 h后，棄去培養(yǎng)基，換成完全培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。NC及PAIP1-siRNA的轉(zhuǎn)染同miR-628-3p mimic的轉(zhuǎn)染步驟。

1.2.4MTT法檢測細胞相對存活率 收集對數(shù)期細胞，調(diào)整細胞密度為3 000個/孔，每孔100 μL加入96孔板，置37 ℃含有5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細胞經(jīng)轉(zhuǎn)染后，繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48、72 h，每孔加入20 μL濃度為5 mg/mL的MTT溶液，培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，吸掉上清液，每孔加入100 μL DMSO后振蕩10 min，用酶標(biāo)儀在570 nm處測定吸光度(A)值。重復(fù)實驗3次，以平均值統(tǒng)計結(jié)果，計算各濃度下細胞相對存活率。

1.2.5miRNA-628-3p靶基因預(yù)測和熒光素酶報告基因檢測 通過TargetScan靶點預(yù)測軟件預(yù)測context score值和context score percentile值，context score值越小和context score percentile值越大表示蛋白靶點概率越大。將miRNA-628-3p mimic、空載體陰性對照(NC)分別與PAIP1的3′-UTR野生型(pGL3-PAIP1 3′-UTR-WT)報告載體和突變型(pGL3-PAIP1 3′-UTR-MUT)報告載體共轉(zhuǎn)入MCF-7細胞中，轉(zhuǎn)染48 h后，吸取上清液，利用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測螢火蟲和海腎熒光素酶活性。

1.2.6Western blot檢測PAIP1蛋白表達 提取轉(zhuǎn)染后的各組細胞蛋白，Western blot檢測PAIP1蛋白表達水平。細胞裂解液裂解并提取蛋白，BCA檢測蛋白水平，經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)印，5%脫脂奶粉封閉，封閉后加入相應(yīng)一抗4 ℃搖床過夜，第2天加入相應(yīng)二抗，室溫孵育2 h 后TBST洗膜3次。ECL浸泡后用化學(xué)發(fā)光熒光成像系統(tǒng)對圖像進行掃描和分析。

2 結(jié) 果

2.1miRNA-628-3p 在MCF-10A、MCF-7和MDA-MB-231細胞中的表達 RT-PCR 檢測人正常乳腺上皮細胞MCF-10A與乳腺癌細胞MCF-7、MDA-MB-231中miR-628-3p的表達。與MCF-10A細胞組相比，乳腺癌細胞MCF-7、MDA-MB-231中miRNA-628-3p的表達水平顯著降低(P<0.05)，見圖1。此結(jié)果表明miRNA-628-3p在乳腺癌細胞中呈現(xiàn)低表達，本研究選取MCF-7細胞株進行后續(xù)實驗。

2.2miR-628-3p在乳腺癌細胞MCF-7中的轉(zhuǎn)染效率 RT-PCR檢測miRNA-628-3p的轉(zhuǎn)染情況，與NC組相比，轉(zhuǎn)染miRNA-628-3p mimic的過表達組中miR-628-3p的表達水平顯著增高(P<0.01)，見圖2。

2.3過表達miR-628-3p抑制乳腺癌細胞MCF-7的增殖 通過MTT檢測MCF-7細胞中過表達miR-628-3p之后細胞增殖的情況，繪制細胞生長曲線，空載體陰性對照組(NC)在48、72 h的相對細胞活力值為3.43±0.11、4.94±0.21，而miR-628-3p mimic組為2.32±0.19、2.93±0.20，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

a：P<0.05，與MCF-10A細胞組比較

圖1RT-PCR檢測各組細胞中miR-628-3p的表達

a：P<0.01，與NC比較

圖2RT-PCR檢測miR-628-3p和NC的轉(zhuǎn)染效率

a：P<0.05，與NC比較

圖3過表達miRNA-628-3p對MCF-7細胞增殖的影響

2.4miRNA-628-3p靶基因預(yù)測及驗證 該miRNA的context score值為-0.40和context score percentile值為98，推測PAIP1是miR-628-3p潛在的靶基因。熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，野生型(Wild type，WT)PAIP1 3′ UTR質(zhì)粒和miR-628-3p mimic共轉(zhuǎn)染組，其熒光素酶活性顯著低于野生型PAIP1 3′UTR質(zhì)粒和空載體陰性對照(NC)共轉(zhuǎn)染組(P<0.05)。而突變型(mutation，Mut)PAIP1 3′ UTR質(zhì)粒和miR-628-3p mimic共轉(zhuǎn)染組與突變型PAIP1 3′ UTR質(zhì)粒和NC共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，結(jié)果顯示PAIP1是miR-628-3p的靶點(圖4A)。此外，Western blot結(jié)果顯示，與NC組相比，miR-628-3p mimic組細胞中PAIP1蛋白水平顯著降低(P<0.05，圖4B)。

A：熒光素酶報告基因驗證miR-628-3p靶基因PAIP1；B：Western blot檢測上調(diào)miR-628-3p后PAIP1蛋白的表達水平。a：P<0.05，與NC比較

圖4miR-628-3p的下游靶點的預(yù)測及驗證

2.5抑制PAIP1的表達能夠抑制乳腺癌細胞MCF-7的增殖 為了分析沉默PAIP1基因?qū)CF-7細胞增殖的影響，將si-NC及3條PAIP1-siRNA轉(zhuǎn)染MCF-7細胞后，通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)S1和S2兩條siRNA較si-NC組可顯著下調(diào)PAIP1蛋白表達(圖5A)。另外通過MTT實驗，發(fā)現(xiàn)用S1和S2兩條siRNA抑制PAIP1的表達之后，48 、72 h時，S1和S2組細胞活力顯著低于si-NC組(P<0.05，圖5B)。

A：Western blot檢測3條siRNA轉(zhuǎn)染MCF-7細胞后PAIP1蛋白表達水平；B：抑制PAIP1表達之后MTT法檢測細胞活力變化。a：P<0.05，與陰性對照Si-NC組相比

圖5抑制PAIP1表達對MCF-7細胞增殖的影響

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，miRNA與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切的關(guān)系，在腫瘤中有些miRNA呈現(xiàn)異常表達[12]。miRNA根據(jù)其在癌癥發(fā)生中的作用分為兩類：一類具有致癌作用，另一類具有抑癌作用。有些miRNA通過抑制抑癌基因的靶向mRNA，發(fā)揮致癌作用。例如miRNA-373-3p能夠通過調(diào)控去甲腎上腺素促進結(jié)腸癌細胞的體外增殖[13]。另外，有些miRNA抑制癌基因的靶向mRNA表達，發(fā)揮抑癌作用。例如miRNA-126能夠通過抑制核受體共激活因子7(nuclear receptor fibrosis,NCOA7)，影響芳香受體核轉(zhuǎn)入因子(aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator,ARNT)的表達，進而抑制肺鱗癌細胞的增殖[14]。

近年來，miRNA-628-3p在許多癌癥中異常表達，如結(jié)腸癌[15-16]、胃癌、胰腺癌[17]和肺癌。陳希媛等[11]研究發(fā)現(xiàn)miRNA-628-3p能有效抑制胃癌細胞HGC-27的增殖能力，并且促進細胞的凋亡；此外，PAN等[18]證實mir-628-3p通過負(fù)性調(diào)節(jié)熱休克蛋白90(hot shock protein 90,HSP90)促進肺癌細胞A549凋亡和抑制遷移。然而，目前對于miRNA-628-3p在乳腺癌中的功能研究甚少。本研究結(jié)果首先提示，相對于乳腺正常上皮細胞，miRNA-628-3p在乳腺癌細胞中明顯低表達，表明miRNA-628-3p可能參與乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展過程。因此，本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miRNA-628-3p mimic的細胞增殖受到抑制，較陰性對照組有顯著差異，這表明在乳腺癌發(fā)展過程中，miRNA-628-3p可通過抑制乳腺癌細胞的增殖從而發(fā)揮抑制癌基因的作用。

乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展受到多種基因和蛋白的調(diào)控，這些相關(guān)基因和蛋白的研究對乳腺癌的發(fā)病機制的進一步研究具有重要的意義。PAIP1編碼基因位于染色體5p12，由479個氨基酸組成[19]。PAIP1是一種翻譯調(diào)節(jié)因子，一方面能與poly A結(jié)合蛋白(poly A binding protein,PABP)相互作用形成穩(wěn)定的mRNA環(huán)形結(jié)構(gòu)，另一方面還能與真核起始因子4A(eukaryotic initiation factor 4A,EIF4A)及EI相互作用形成三元復(fù)合體，進而調(diào)控蛋白質(zhì)的翻譯起始過程[20]。研究表明，翻譯調(diào)控機制的異常，會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的合成發(fā)生異常，引起細胞增殖失調(diào)和惡性表型的轉(zhuǎn)化，可誘導(dǎo)腫瘤[21]等疾病的發(fā)生。LI等[22]研究顯示，敲除PAIP1抑制宮頸癌細胞生長，誘導(dǎo)細胞凋亡和細胞周期停滯，在體內(nèi)腫瘤模型中，其過表達則促腫瘤作用。PIAO等[23]通過多變量分析表明PAIP1的高表達與組織學(xué)分級、生存率低有關(guān)。本研究通過生物信息學(xué)軟件分析表明，PAIP1是miRNA-628-3p作用的靶基因，熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C了該結(jié)果，并且在乳腺癌細胞MCF-7中過表達miRNA-628-3p后，PAIP1蛋白的表達水平顯著降低，進一步說明PAIP1是miR-628-3p的直接靶點，miRNA-628-3p能夠抑制乳腺癌細胞中的PAIP1蛋白水平。此外，MTT實驗證明，抑制PAIP1基因的表達也跟過表達miRNA-628-3p的效果一樣，抑制乳腺癌細胞的增殖。以上結(jié)果提示， miRNA-628-3p在乳腺癌細胞中低表達，可以通過負(fù)調(diào)控靶基因PAIP1抑制乳腺癌細胞的增殖。

綜上所述，miRNA-628-3p可能是乳腺癌腫瘤發(fā)展過程中的重要因子，可能成為乳腺癌診斷或治療的新靶點、預(yù)后的生物標(biāo)志物，為乳腺癌的發(fā)病機制闡明提供新的思路。