李 揚(yáng) 任開(kāi)明 左新河 姜 楠

（1.湖北省中醫(yī)院，湖北 武漢 430061；2.武漢大學(xué)人民醫(yī)院，湖北 武漢 430060）

世界各地痛風(fēng)患病率逐年增加，2015年的綜述報(bào)告顯示痛風(fēng)的患病率升至1%～4%，年發(fā)病率約為2.6‰，在西方，男性發(fā)病率約為3%～6%，女性約為1%～2%，在毛利族人中甚至高達(dá)10%［1］。隨著人們生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，我國(guó)痛風(fēng)的發(fā)病率也在上升，其中以臺(tái)灣地區(qū)居民居高，2010年的調(diào)查研究顯示其患病率為6.24%［2］。高嘌呤飲食、酒精攝入、肥胖是痛風(fēng)的重要致病因素，痛風(fēng)常常與2型糖尿病、高血壓病、高脂血癥以及心腦血管疾病相伴發(fā)［3］。

目前臨床上控制痛風(fēng)急性發(fā)作的藥物主要有秋水仙堿、非甾體抗炎藥、糖皮質(zhì)激素等藥物，但這些藥物所帶來(lái)的胃腸道不良反應(yīng)以及對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟、造血系統(tǒng)的損害不容忽視，尤其對(duì)于老年患者，往往由于存在全身多個(gè)器官系統(tǒng)疾病，對(duì)這些藥物的耐受力更低。本文通信作者任開(kāi)明教授長(zhǎng)期致力于痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的中醫(yī)中藥研究，遵循中醫(yī)外病外治的思路，根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)研制出治療急性痛風(fēng)的外敷膏劑——威柏膏（由威靈仙等8味中藥組成），通過(guò)局部用藥直接緩解痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作期癥狀，減輕炎癥反應(yīng)，以期達(dá)到療效佳、不良反應(yīng)少的治療目的。

本課題組前期的研究結(jié)果［4］發(fā)現(xiàn)，威柏膏能顯著減輕大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的炎性反應(yīng)，下調(diào)關(guān)節(jié)滑膜組織中重要炎性介質(zhì)白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）的表達(dá)。既往研究表明，IL-1β的成熟和釋放依賴(lài)于NALP-3炎性體［5-6］，本實(shí)驗(yàn)擬進(jìn)一步研究威柏膏外敷治療對(duì)NALP-3炎性體表達(dá)的影響，試圖從更深層面來(lái)解釋威柏膏治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)理，為威柏膏臨床應(yīng)用提供有力依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 32只雄性SPF級(jí)Wistar大鼠，體質(zhì)量180～220 g，由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)SYXK（鄂）2015-0018。SPF動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 試藥與儀器 威柏膏：由威靈仙、黃柏等8味中藥制成膏劑，武漢大學(xué)人民醫(yī)院藥事部制。秋水仙堿片（西雙版納版納藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，規(guī)格0.5 mg），以1 mg︰100 mL注射用水比例配制成0.01 mg/mL濃度溶液。尿酸鈉溶液（25 mg/mL），配制方法同前期研究［4］。尿酸鈉晶體參考 Coderre經(jīng)典法［4，7］配制：194 mL 蒸餾水加6 mL 1 mol/L NaOH，煮沸，加1 g尿酸，用1 mol/L HCL調(diào)pH至7.2，攪拌冷卻，-4℃冰箱保存24 h，去上清，用濾紙將沉淀物水分吸干，放入70℃干燥箱烘2 h，取出，刮下粉末，放入研缽內(nèi)研成細(xì)末，用孔徑250 μm的金屬篩過(guò)篩，高溫高壓滅菌以去除內(nèi)毒素，裝瓶備用。取500 mg尿酸鈉晶體加18 mL 0.9%氯化鈉注射液，再加2 mL吐溫80，加熱攪拌，配制成20mL尿酸鈉溶液。NALP-3一抗（HPA012878，Sigma）、Caspase-1（BM4291，Boster）一抗，SABC免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒均購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司。HVE-50型高壓消毒鍋，Hirayama，USA；HMIAS-2000W高清晰彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)，武漢千屏；石蠟組織切片機(jī)，Leica Germany；普通光學(xué)顯微鏡、顯微照相機(jī)，Olympus Japan。

1.3 分組與造模 適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，32只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、威柏膏組、秋水仙堿組4個(gè)組，每組8只。急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型建立：按Coderre經(jīng)典方法略做改進(jìn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物各組用10%水合氯醛（300 mg/kg）麻醉，然后消毒踝關(guān)節(jié)周?chē)つw，用1 mL注射針在受試大鼠右側(cè)踝關(guān)節(jié)背側(cè)45°方向插入脛骨肌腱內(nèi)側(cè)，正常對(duì)照組注入0.25 mL 0.9%氯化鈉注射液；模型對(duì)照組、威柏膏組、秋水仙堿組均將0.25 mL尿酸鈉溶液注入踝關(guān)節(jié)腔［7］。給藥方法：威柏膏組于造模后1 h即開(kāi)始用威柏膏外敷于受試關(guān)節(jié)，每日2次；秋水仙堿組用秋水仙堿溶液灌胃，0.15 mg/kg，每日3次。各組給藥均為3 d。

1.4 標(biāo)本采集與檢測(cè) 造模后步態(tài)評(píng)分、關(guān)節(jié)腫脹度測(cè)量，方法同前期研究［4］。造模后1 h開(kāi)始觀(guān)察大鼠步態(tài)，并在24、48、72 h 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行評(píng)分。步態(tài)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：0分為正常步態(tài)，雙足均勻著地；1分為足著地減輕，足趾未展開(kāi)，輕度跛行；2分為足屈起，趾背著地，明顯跛行；3分為足完全離地，三足步態(tài)。關(guān)節(jié)腫脹度=造模后關(guān)節(jié)周徑測(cè)量值—造模前關(guān)節(jié)周徑測(cè)量值。標(biāo)本取材、固定、脫鈣、切片流程如下：各組大鼠于造模及用藥78 h后處死，無(wú)菌條件下取各組大鼠受試踝關(guān)節(jié)上下0.5 cm之間的組織，去掉皮膚，分別放入含有固定液（4%多聚甲醛）的50 mL無(wú)菌量杯中，置-4℃冰箱保存24 h。用10%EDTA脫鈣10周后石蠟包埋，切成5 μm薄片。關(guān)節(jié)組織切片HE染色，光鏡下觀(guān)察滑膜病理改變。免疫組化法檢測(cè)踝關(guān)節(jié)滑膜組織中NALP-3、Caspase-1的相對(duì)表達(dá)量。具體步驟為：脫蠟后3%過(guò)氧化氫液封閉過(guò)氧化物酶，血清封閉，再分別加抗大鼠NALP-3、Caspase-1的一抗，按SABC試劑盒標(biāo)準(zhǔn)步驟操作，最后經(jīng)DAB溶液顯色。陰性對(duì)照除了用PBS代替一抗外，所有步驟相同，以有棕黃色顆粒沉著為陽(yáng)性細(xì)胞。每張玻片隨機(jī)選擇20個(gè)視野（×200），用HMIAS-2000千屏高清彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行吸光度測(cè)量并自動(dòng)轉(zhuǎn)換為A（吸光度）值，每個(gè)標(biāo)本的NALP-3、Caspase-1相對(duì)表達(dá)含量用20個(gè)視野的平均A值表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠步態(tài)觀(guān)察結(jié)果比較 見(jiàn)表1。造模后1 h，各組大鼠步態(tài)均不正常：正常對(duì)照組大鼠輕度跛行；其余3組大鼠足屈起，趾背著地，明顯跛行或呈三足步態(tài)。造模24 h后可見(jiàn)：正常對(duì)照組大鼠步態(tài)恢復(fù)正常，其余3組大鼠仍明顯跛行。隨時(shí)間推移，與模型對(duì)照組比較，威柏膏組及秋水仙堿組評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。威柏膏組較秋水仙堿組恢復(fù)快（P＜0.05）。

表1 各組大鼠步態(tài)評(píng)分比較（分，±s）

表1 各組大鼠步態(tài)評(píng)分比較（分，±s）

與正常對(duì)照組比較，?P＜0.05；與模型對(duì)照組比較，△P＜0.05；與秋水仙堿組比較，▲P＜0.05。下同

組別n 1 h 24 h 48 h 72 h正常對(duì)照組模型對(duì)照組威柏膏組秋水仙堿組8 8 8 80.625±0.1712.250±0.233*1.875±0.117△1.875±0.211△02.875±0.117*2.250±0.153△2.375±0.238△02.250±0.153*1.500±0.177△▲1.875±0.113△02.000±0.005*1.375±0.171△▲1.625±0.246△

2.2 各組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度動(dòng)態(tài)測(cè)量結(jié)果比較 見(jiàn)表2。造模后1 h，各組大鼠踝關(guān)節(jié)處均腫脹，正常對(duì)照組大鼠輕度紅腫，模型對(duì)照組、威柏膏組、秋水仙堿組踝關(guān)節(jié)處均明顯紅腫。造模24 h后觀(guān)察可見(jiàn)：正常對(duì)照組大鼠關(guān)節(jié)外觀(guān)恢復(fù)正常，模型對(duì)照組、威柏膏組、秋水仙堿組大鼠踝關(guān)節(jié)仍然嚴(yán)重紅腫。隨時(shí)間推移，與模型對(duì)照組比較，威柏膏組及秋水仙堿組，腫脹度下降明顯（P＜0.05）。威柏膏組較秋水仙堿組下降更明顯（P＜0.05）。

2.3 各組大鼠滑膜病理觀(guān)察結(jié)果 見(jiàn)圖1。正常對(duì)照組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織偶見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，滑膜組織厚度正常，未見(jiàn)增生。模型對(duì)照組大鼠滑膜組織可見(jiàn)大量中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血。與模型對(duì)照組比較，威柏膏組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少。

表2 各組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度比較（cm，±s）

表2 各組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度比較（cm，±s）

組別正常對(duì)照組模型對(duì)照組威柏膏組秋水仙堿組n 8 8 8 81 h 0.28±0.0410.73±0.104*0.62±0.089△0.65±0.094△24 h 0.17±0.0250.78±0.111*0.71±0.101△0.72±0.103△48 h 0.14±0.0200.65±0.092*0.29±0.042△▲0.44±0.063△72 h 0.06±0.0120.61±0.087*0.11±0.015△▲0.28±0.040△

圖1 各組大鼠滑膜組織觀(guān)察（HE染色，200倍）

2.4 各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中NALP-3、Caspase-1相對(duì)表達(dá)含量比較 見(jiàn)圖2～圖3，表3。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組踝關(guān)節(jié)滑膜組織中NALP-3、Caspase-1相對(duì)表達(dá)含量明顯增加（P＜0.05）；與模型對(duì)照組比較，威柏膏組、秋水仙堿組滑膜組織中NALP-3、Caspase-1相對(duì)表達(dá)含量顯著減低（P＜0.05），威柏膏組與秋水仙堿組之間無(wú)明顯差異（P＞0.05）。

圖2 各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織NALP-3的表達(dá)（免疫組化染色，200倍）

圖3 各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織Caspase-1的表達(dá)（免疫組化染色，200倍）

表3 各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織NALP-3、Caspase-1相對(duì)表達(dá)含量（±s）

表3 各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織NALP-3、Caspase-1相對(duì)表達(dá)含量（±s）

組別正常對(duì)照組模型對(duì)照組威柏膏組秋水仙堿組n8888 NALP-30.1323±0.01650.2012±0.0245*0.1751±0.0218△0.1685±0.0175△Caspase-10.1389±0.01950.2162±0.0285*0.1652±0.0163△0.1725±0.0115△

3 討 論

中醫(yī)理論認(rèn)為痛風(fēng)發(fā)生的主要原因在于先天稟賦不足、脾腎功能失調(diào)，濕熱之邪痹阻于肢體、經(jīng)絡(luò)，氣血運(yùn)行失暢所致，與遺傳、體質(zhì)、飲食、外感、環(huán)境等因素有關(guān)。急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎多表現(xiàn)為風(fēng)濕熱痹，治法以清熱除濕、通絡(luò)止痛為主。據(jù)中藥典籍《唐本草》《海上集驗(yàn)方》《藥品化義》《廣西中草藥》等記載，威靈仙具有祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)、止痹痛、消骨鯁等功效。本文通信作者任開(kāi)明教授課題組多年來(lái)以威靈仙為核心，研究其對(duì)痛風(fēng)性腎病、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的作用，實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)威靈仙能顯著減少尿酸性腎病模型大鼠尿酸鹽結(jié)晶在腎小管間質(zhì)的沉積，從而保護(hù)腎小管間質(zhì)［8］，抑制了腎小管和腎間質(zhì)的上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化及下調(diào)NF-κB的表達(dá)［9］。在臨床研究中同樣證實(shí)威靈仙、草決明復(fù)方膠囊能降低血尿酸及血脂、改善腎功能、減少蛋白尿［10］。在此基礎(chǔ)上，任開(kāi)明教授遵循中醫(yī)外病外治的治則，根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)研制出治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的外敷膏劑——威柏膏，此方由威靈仙配伍黃柏、蒼術(shù)、乳香、沒(méi)藥等8味中藥而成，其中威靈仙祛風(fēng)除濕、促進(jìn)尿酸溶解；黃柏、蒼術(shù)燥濕清熱；乳香、沒(méi)藥、當(dāng)歸活血調(diào)氣止痛；五加皮祛風(fēng)濕、利筋骨；冰片促進(jìn)透皮吸收，引藥直達(dá)痛風(fēng)炎癥部位，全方共奏清熱祛濕、活血止痛之功效。本課題組前期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究［4］發(fā)現(xiàn)，該方能顯著減輕急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠的關(guān)節(jié)腫脹度，減少滑膜組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，并能顯著降低受試關(guān)節(jié)滑膜組織中IL-1β的表達(dá)。

急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是由于嘌呤代謝紊亂使血尿酸水平升高，尿酸鈉鹽結(jié)晶沉積于關(guān)節(jié)腔內(nèi)，引起白細(xì)胞趨化、吞噬，從而形成了關(guān)節(jié)紅腫熱痛的急性炎癥反應(yīng)［11］。IL-1β是介導(dǎo)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的重要炎癥因子，在中性粒細(xì)胞趨化、激活過(guò)程中起重要作用［12-13］。Martinon等［5-6］研究提示IL-1β的成熟和釋放依賴(lài)于NALP-3炎性體（NACHT-LRR-PYD結(jié)構(gòu)域蛋白3），NALP-3炎性體介導(dǎo)了急性痛風(fēng)的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。NALP-3炎性體是一類(lèi)分子量約為700 kDa的大分子蛋白復(fù)合體，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)發(fā)揮外源性微生物或內(nèi)源性信號(hào)感受器的作用，是活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-1（Caspase-1）的分子平臺(tái)，直接調(diào)控著IL-1β、IL-18、IL-33等促炎細(xì)胞因子的成熟和分泌，在天然免疫、獲得性免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［14-15］。NALP-3炎性體主要由3個(gè)部分組成：核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體（NLRs）家族成員NALP-3、銜接蛋白ASC，以及效應(yīng)蛋白Caspase-1［16］。NALP-3是其中的核心蛋白，功能是將下游的銜接蛋白ASC和效應(yīng)分子Caspase-1前體（Pro-caspase-1）連接起來(lái)。NALP-3炎性體完成組裝后，使Pro-caspase-1自動(dòng)催化成Caspase-1，后者又稱(chēng)IL-1β轉(zhuǎn)化酶，進(jìn)一步將無(wú)活性IL-1β前體剪切為成熟的IL-1β［17］。

根據(jù)上述機(jī)理，在前期研究基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了威柏膏對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠關(guān)節(jié)滑膜中NALP-3炎性體的調(diào)控作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)威柏膏可以顯著降低滑膜組織中NALP-3炎性體的核心蛋白NALP-3及效應(yīng)分子Caspase-1的表達(dá)含量，從而有效減少其下游IL-1β前體向成熟IL-1β的轉(zhuǎn)化，最終減輕關(guān)節(jié)滑膜炎癥反應(yīng)，提示威柏膏對(duì)急性痛風(fēng)關(guān)節(jié)滑膜中NALP-3/Caspase-1/IL-1β通路的調(diào)控是其治療作用的核心環(huán)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為威柏膏的臨床應(yīng)用提供了較為有力的分子機(jī)制依據(jù)。

現(xiàn)有的治療痛風(fēng)急性發(fā)作的常用藥物為秋水仙堿，但其毒副作用十分明顯；常用外用藥主要為非甾體抗炎藥，如扶他林等，可以緩解輕、中度疼痛，但無(wú)法解決痛風(fēng)發(fā)作的根本問(wèn)題，還有抑制軟骨的合成的不良反應(yīng)，并能破壞軟骨細(xì)胞［18］。本實(shí)驗(yàn)中對(duì)急性痛風(fēng)模型大鼠步態(tài)與關(guān)節(jié)腫脹度的觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，威柏膏對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎止痛效果優(yōu)于秋水仙堿組，充分說(shuō)明中藥外治法治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的優(yōu)勢(shì)，威柏膏可以從病因?qū)用嬲{(diào)節(jié)痛風(fēng)受累關(guān)節(jié)滑膜組織的炎性反應(yīng)，其方法簡(jiǎn)單易行，便于患者使用，并可避免口服藥物的諸多不良反應(yīng)，因此擁有廣闊的臨床應(yīng)用前景。