繆輝宇 曲崇正 黃宏興
(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院,廣東 廣州 510407)
針刺療法在治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(KOA),尤其是在鎮(zhèn)痛方面的確切療效已被臨床實(shí)踐所驗(yàn)證。以往的研究較多局限于針刺療法對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的病變及炎性因子的刺激上,但對(duì)針刺鎮(zhèn)痛的臨床研究并不多見(jiàn)。因此,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立KOA動(dòng)物模型,以大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜為研究對(duì)象,引入神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)和P物質(zhì)(SP),采用免疫組化技術(shù)研究針刺對(duì)NGF、SP的影響,為針刺治療KOA的鎮(zhèn)痛機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年SD大鼠75只,體質(zhì)量220~280 g,雌性40只,雄性35只,來(lái)源于廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。所有大鼠均飼養(yǎng)于恒溫恒濕的清潔環(huán)境中,環(huán)境溫度為(25±1)℃,濕度70%,每天12 h光照/12 h黑暗,所選大鼠在實(shí)驗(yàn)室喂養(yǎng)并適應(yīng)飼養(yǎng)1周,實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物的處理符合《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》的規(guī)定。
1.2 試藥與儀器 1)試藥:木瓜蛋白酶(廣西南寧杰沃利生物制品有限公司生產(chǎn)),配制成0.1 mL 4%木瓜蛋白酶生理鹽水。即用型兔抗人NGF及SP、SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程公司生產(chǎn))。西樂(lè)葆(輝瑞制藥有限公司生產(chǎn),國(guó)藥準(zhǔn)字J20140072,0.2 g)。戊巴比妥鈉(成都華夏公司生產(chǎn),批號(hào)922L0314,50 mg)。2)儀器:撳針(北京中研太和醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn);長(zhǎng)度為5 mm、直徑為0.28 mm,蘇食藥監(jiān)械生產(chǎn)許20010168號(hào))。
1.3 分組與造模 采用隨機(jī)數(shù)字表將大鼠分為5組,各15只,其中4組進(jìn)行木瓜蛋白酶造模,另1組不做任何干預(yù)作為對(duì)照的正常組,造模方法為:將大鼠用戊巴比妥鈉(30 mg/kg)進(jìn)行靜脈注射麻醉,對(duì)左側(cè)膝關(guān)節(jié)皮膚進(jìn)行常規(guī)消毒,然后在麻醉起效后將0.1 mL 4%木瓜蛋白酶生理鹽水經(jīng)大鼠的髕上韌帶兩側(cè)注入至左膝關(guān)節(jié)腔內(nèi),每3日注射1次,連續(xù)注射3次完成造模。造模術(shù)后持續(xù)1周肌注青霉素5萬(wàn)U/d以預(yù)防感染。造模大鼠分為造模組、西樂(lè)葆組、針刺穴位組、針刺非穴組。
1.4 干預(yù)方法 動(dòng)物常規(guī)飼養(yǎng),干預(yù)方法在木瓜蛋白酶末次注入后2周后進(jìn)行。1)造模組和正常組:正常飼養(yǎng)不做其他處理。2)針刺穴位組:取穴參照華興邦等制定的《大鼠穴位圖譜的研制》[1]中大鼠穴位定位,取左側(cè)膝眼、血海、陽(yáng)陵泉穴。操作方法:常規(guī)消毒局部皮膚,左手固定大鼠左膝部,右手用鑷子夾住針柄,針尖在穴位垂直穿刺,然后用膠帶固定針柄30 min,每日1次。所有大鼠在7 d后都被處死。處死后取下滑膜。3)針刺非穴組:選擇穴位組選擇的3個(gè)穴位旁開(kāi)2 cm的非穴位進(jìn)行針灸,其余操作均同穴位組。4)西樂(lè)葆組:按24 mg/kg溶于2 mL純凈水中灌胃,每日1次,連續(xù)7 d后處死全部大鼠。
1.5 標(biāo)本采集及檢測(cè) 造模組和正常組在造模結(jié)束兩周后以空氣栓塞法處死造模組和正常組的大鼠,無(wú)菌條件下取大鼠左膝內(nèi)下方滑膜,0.9%氯化鈉注射液沖洗后用10%的甲醛溶液固定,常規(guī)石蠟包埋,備用。針刺穴位組、針刺非穴位組、西樂(lè)葆組均在干預(yù)7 d后處死大鼠并取大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜。具體處死方法和取材同造模組及正常組。1)免疫組化染色:將石蠟包埋好的滑膜標(biāo)本切片,厚約4 μm,分別進(jìn)行NGF和SP免疫組化染色。常規(guī)脫蠟至水后,于0.3%H2O2的甲醇內(nèi)進(jìn)行室溫孵育20 min,再在92℃~98℃的醫(yī)用微波下抗原修復(fù)10 min。一抗:正常山羊血清密封劑在室溫下孵育20 min,用適當(dāng)稀釋的抗NGF或SP滴注(一部分切片滴NGF抗體,剩下一部分滴SP抗體),濕盒內(nèi)4℃恒溫過(guò)夜。二抗:PBS溶液沖洗3次,每次間隔5 min,生物素化二抗,滴加SABC試劑后37℃孵育20 min。DAB顯色液顯色,蘇木素復(fù)染,脫水,透明,封片。2)免疫組化觀察及等級(jí)標(biāo)準(zhǔn):用顯微鏡觀察各組陽(yáng)性細(xì)胞形態(tài)及分布,進(jìn)行真彩色圖像分析(德國(guó)Koutron公司IBAS真彩色圖像分析儀)。根據(jù)陽(yáng)性血管分布占比分為3級(jí):<40%為-,40%~70%為+,>70%為++。每張病理切片選擇3個(gè)視野進(jìn)行分析,分別記錄陽(yáng)性表達(dá)的數(shù)量,陽(yáng)性表達(dá)數(shù)取切片3個(gè)觀察視野的平均值。根據(jù)圖像分析系統(tǒng),算出陽(yáng)性面積和陽(yáng)性區(qū)域平均灰度值,折算成陽(yáng)性單位值(PU),并按文獻(xiàn)[2]方法PU=[(區(qū)域陽(yáng)性產(chǎn)物灰度值-區(qū)域灰度值)/(區(qū)域背景面積密度×最大灰度分級(jí))]×100%。PU大小與反應(yīng)強(qiáng)度成正比。
1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以(±s),組間比較用t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料用(%),組間比較用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 各組滑膜切片NGF表達(dá) 見(jiàn)圖1。NGF在血管周圍表達(dá),為胞漿著色,棕黃色,呈半環(huán)形或環(huán)形,顆粒狀。陽(yáng)性細(xì)胞染色>血管周長(zhǎng)的40%即代表陽(yáng)性結(jié)果。每張病理切片選擇3個(gè)視野進(jìn)行分析,分別記錄陽(yáng)性表達(dá)的數(shù)量,陽(yáng)性表達(dá)數(shù)取切片3個(gè)觀察視野的平均值。正常組見(jiàn)少量NGF陽(yáng)性細(xì)胞;造模組較正常組明顯增多;西樂(lè)葆組、針刺非穴組與針刺穴位組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較造模組降低;但西樂(lè)葆組、針刺非穴組降低幅度更大。
圖1 滑膜切片NGF表達(dá)(免疫組化法,400倍)
2.2 各組滑膜切片SP表達(dá) 見(jiàn)圖2。SP位于血管壁,呈棕黃色顆粒狀。陽(yáng)性細(xì)胞染色>血管周長(zhǎng)的40%即代表陽(yáng)性結(jié)果。每張切片同樣選擇3個(gè)視野進(jìn)行分析,陽(yáng)性表達(dá)數(shù)取3個(gè)記錄的均值。正常組見(jiàn)少量SP陽(yáng)性細(xì)胞;造模組較正常組明顯增多;西樂(lè)葆組、針刺非穴組與針刺穴位組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較造模組降低;但西樂(lè)葆組、針刺非穴組降低幅度更大。
圖2 滑膜切片SP表達(dá)(免疫組化法,400倍)
2.3 各組大鼠NGF陰性、陽(yáng)性、強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)情況 見(jiàn)表1。針刺穴位組NGF總陽(yáng)性率為13.33%,明顯低于非針刺穴位組60.00%(P<0.01);而西樂(lè)葆組與針刺穴位組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
表1 各組大鼠NGF陰性、陽(yáng)性、強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)情況(n)
2.4 各組大鼠SP陰性、陽(yáng)性、強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)情況 見(jiàn)表2。針刺穴位組SP總陽(yáng)性率為6.67%,顯著低于針刺非穴組的SP總陽(yáng)性率53.33%(P<0.01);但針刺穴位組與西樂(lè)葆組比較差異不顯著(P>0.05)。
表2 各組大鼠SP陰性、陽(yáng)性、強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)情況(n)
2.5 各組大鼠NGF、SP水平比較 見(jiàn)表3。較之造模組大鼠,針刺穴位組、西樂(lè)葆組大鼠的NGF、SP陽(yáng)性表達(dá)率明顯降低(P<0.05或P<0.01);且針刺穴位組的NGF、SP陽(yáng)性表達(dá)低于針刺非穴組(P<0.05);但針刺穴位組與西樂(lè)葆組比較NGF、SP陽(yáng)性表達(dá)并無(wú)明顯差異(P>0.05)。
表3 各組大鼠滑膜內(nèi)NGF、SP表達(dá)比較(Pu,±s)
表3 各組大鼠滑膜內(nèi)NGF、SP表達(dá)比較(Pu,±s)
組別正常組造模組西樂(lè)葆組針刺穴位組針刺非穴組n 1515151515 NGF-0.41±2.3127.39±20.771)2.17±2.861.81±2.742)11.23±10.21 SP-0.33±2.3729.29±13.16*2.61±2.18*1.75±1.99*△10.53±9.88
骨關(guān)節(jié)炎屬中醫(yī)學(xué)“骨痹”范疇,多因人體正氣虧虛,風(fēng)寒濕外邪侵襲,痹阻氣血,流注經(jīng)脈所致[3]。65歲以上老年人KOA發(fā)病率高達(dá)85%[4-5]?,F(xiàn)有西醫(yī)治療多以非甾體消炎藥緩解癥狀為主,但長(zhǎng)期使用后胃腸道毒副作用明顯,常使患者不能耐受而終止治療。目前臨床上已越來(lái)越多地使用針刺來(lái)達(dá)到鎮(zhèn)痛的效果,且針刺副作用小,患者能夠長(zhǎng)期治療。
NGF是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子中的一員,主要起著維持神經(jīng)元存活,調(diào)節(jié)周圍和中樞神經(jīng)元發(fā)育的作用,是人體中不可缺少的因子。有研究報(bào)道,神經(jīng)生長(zhǎng)因子主要是根據(jù)低親和力p75神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體(p75ntr)和高親和力酪氨酸激酶A(trka)調(diào)控疼痛,在疼痛的發(fā)生和發(fā)展中起著生物學(xué)作用,參與疼痛發(fā)生、發(fā)展的各個(gè)環(huán)節(jié)[6]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),NGF水平升高與疼痛呈正相關(guān)[7]。而針刺鎮(zhèn)痛與NGF相關(guān)研究鮮見(jiàn)發(fā)表,僅有熊鍵等發(fā)現(xiàn)電針可以通過(guò)抑制NGF的表達(dá)達(dá)到鎮(zhèn)痛的目的[8]。
SP是調(diào)節(jié)機(jī)體免疫和內(nèi)分泌的重要因素,可被免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)識(shí)別[9-10]。在機(jī)體不同系統(tǒng)具有不同的生理學(xué)效應(yīng),對(duì)針灸與P物質(zhì)的研究主要在鎮(zhèn)痛作用方面。徐小丹[11]研究顯示電針可抑制SP的釋放,從而產(chǎn)生明顯的鎮(zhèn)痛作用。郭奎奎等發(fā)現(xiàn)局部和遠(yuǎn)道取穴在抑制SP釋放及鎮(zhèn)痛方面無(wú)顯著性差異[12]。劉苗苗等發(fā)現(xiàn)針刺聯(lián)合中藥離子可緩解腰椎間盤(pán)突出癥引起的疼痛[13]。
針刺療法在治療KOA方面特別是鎮(zhèn)痛效果的確切療效已被臨床實(shí)踐所驗(yàn)證。以往的研究較多局限于關(guān)節(jié)軟骨的病變及炎性因子的刺激上。本課題通過(guò)建立KOA大鼠模型,以大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜為研究對(duì)象,引入NGF和SP細(xì)胞因子,采用免疫組化技術(shù)研究針刺對(duì)NGF、SP的影響,為針刺治療KOA的鎮(zhèn)痛機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究結(jié)果顯示,針刺穴位組與西樂(lè)葆組NGF、SP含量均顯著低于造模組,且兩者對(duì)比無(wú)顯著性差異(P>0.05),兩組在緩解疼痛方面療效相當(dāng),但針灸更加安全可靠,在今后KOA患者的長(zhǎng)期治療中更可取。
目前臨床上治療KOA主要是口服西樂(lè)葆,由于老年人患KOA較多,且易合并心血管、胃腸道等其他疾病,但西樂(lè)葆臨床適用性有限。且既往有臨床研究表明,西樂(lè)葆治療老年KOA易引起惡心、脹氣、便秘等不良反應(yīng)。而針灸療法可疏通經(jīng)絡(luò)、調(diào)和陰陽(yáng)、扶正去邪,具有許多優(yōu)點(diǎn):1)適應(yīng)證廣,可用于多科疾病;2)操作方法簡(jiǎn)便易行;3)醫(yī)療費(fèi)用經(jīng)濟(jì);4)副作用較小。陽(yáng)陵泉、血海、膝眼是臨床上治療KOA常用穴位[14-15]。針刺上述穴位可降低疼痛中樞的敏感性,改善關(guān)節(jié)疼痛癥狀以及局部組織微循環(huán)和全身血液循環(huán),加速關(guān)節(jié)積液和血腫的吸收,緩解關(guān)節(jié)腫脹癥狀,增強(qiáng)機(jī)體對(duì)外界刺激的承受能力[16]。
綜上所述,針刺能有效抑制KOA大鼠滑膜內(nèi)NGF、SP的表達(dá),這可能是針刺治療KOA有效的機(jī)制之一,但由于本研究數(shù)據(jù)較小,其具體作用機(jī)制以及滑膜是否有修復(fù)作用,還有待進(jìn)一步研究。