鄭夢霞,李會娟,陳淑娜,趙 真,劉馨秋,黎星輝,陳 暄*
(南京農業(yè)大學茶葉研究所,江蘇 南京 210095)
香氣是茶葉的重要品質因素,茶葉中的芳香物質即揮發(fā)性香氣成分,是茶葉中所有易揮發(fā)性物質的總稱。不同的栽培技術和加工工藝造就了不同類型的茶葉擁有其獨特的香氣特征[1-4]。
冠突散囊菌(Eurotium cristatum),俗稱“金花菌”,是茯磚茶獨特的“發(fā)花”工藝中的一種優(yōu)勢益生菌[5-6]。經(jīng)過“發(fā)花”工藝后的茯磚茶表面均勻地分布著冠突散囊菌產生的黃色閉囊殼——“金花”,而“金花”的數(shù)量和質量常被人們視作茯磚茶品質優(yōu)劣判定的標志。茯磚茶的獨特保健功能,不僅與黑毛茶本身含有的功能成分相關,而且更與茯磚茶“渥堆”、“發(fā)花”過程中因微生物代謝而產生的生物活性成分相關[7-9],因此發(fā)花過程形成的“金花菌”對茯磚茶保健功能的形成起著特殊的作用,是決定茯磚茶品質的關鍵因素。香氣也是構成茯磚茶獨特品質的重要因子,渥堆發(fā)酵過程中,由于冠突散囊菌等微生物形成的胞外酶與茶葉本身濕熱作用的協(xié)同下,形成茯磚茶典型獨特的“菌花香”香氣特征[10]。
應用冠突散囊菌制備發(fā)酵型茶飲料,可以有效地利用液體發(fā)酵工藝進行工業(yè)化生產,具備產量高、培養(yǎng)周期短、易于標準化等優(yōu)點,并可以促進低檔茶的增值開發(fā)利用。目前,針對冠突散囊菌液體發(fā)酵茶湯、發(fā)酵條件的優(yōu)化以及發(fā)酵過程中生化成分的動態(tài)變化等均有研究,表現(xiàn)為多酚、兒茶素、咖啡堿等成分含量的降低,酯型兒茶素的轉化等[11-14],但對香氣在此過程中的變化研究較少,多使用“菌花香”描述[15],目前對茯磚茶香氣的種類有所研究[16-19],但茯磚茶為固體發(fā)酵,過程較長,參與的微生物種類較多,環(huán)境濕熱對香氣物質也有較大影響,冠突散囊菌發(fā)酵產生的新增芳香物質及其物質基礎鮮見報道。
本實驗僅利用冠突散囊菌作為唯一菌種對中低檔綠茶和紅茶浸提液進行液體發(fā)酵,采用頂空固相微萃取法結合氣相色譜-質譜法鑒定茶葉審評樣、浸提液滅菌樣以及發(fā)酵前后的香氣成分,分析香氣成分的變化,探索冠突散囊菌對綠茶及紅茶香氣成分的影響,以期為茯磚茶香氣品質形成機理及發(fā)酵類茶飲料的增香技術研究提供理論依據(jù),為解決中低檔茶葉出路尋找有效的方法。
冠突散囊菌由湖南益陽茶廠生產的茯磚茶中分離得到并鑒定,保存于4 ℃冰箱。綠茶(二級炒青綠茶)、紅茶(二級工夫紅茶)均購于南京蘇果超市。葡萄糖、瓊脂、蔗糖均為國產分析純。
20 mL頂空萃取瓶 上海安普公司;手動固相微萃取進樣手柄、65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯萃取頭美國Supelco公司;450-GC 320-MS氣相色譜-質譜聯(lián)用儀德國Bruker公司。
1.3.1 冠突散囊菌的活化培養(yǎng)
取冠突散囊菌種,置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中活化24 h,挑取菌絲體在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(potato dextrose agar,PDA)斜面上劃線,然后放置到28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d。
1.3.2 冠突散囊菌孢子懸液的制備
取活化后試管,在無菌操作條件下,倒入無菌水10 mL,用接種環(huán)將黃色閉囊殼刮下,懸浮于無菌水中,再將懸浮液倒入玻璃珠的錐形瓶中,振搖20 min,將其OD600值調整用于接種(孢子濃度為5.0×108~6.0×108CFU/mL)。
1.3.3 茶葉浸提液的制備
審評樣制備:按照GB/T 23776—2018《茶葉感官審評方法》,取3.0 g茶樣,加入150 mL沸水,5 min后取樣。
提取樣制備:按照茶水比1∶30(g/mL)稱取一定量預先磨碎的茶葉試樣于錐形瓶中,加入蒸餾水后立即移入沸水浴,浸提45 min(每隔10 min攪拌一次),立即減壓過濾,殘渣用少量蒸餾水洗2~3 次,合并濾液加蒸餾水定容備用。添加6%的蔗糖,調整初始pH值至5.5,混勻后分裝,滅菌(121 ℃,30 min)。
1.3.4 冠突散囊菌液體發(fā)酵培養(yǎng)
在250 mL錐形瓶中裝入上述茶汁發(fā)酵培養(yǎng)基100 mL,接入冠突散囊菌孢子懸液1 mL(即接種量為1%),在30 ℃、120 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng),每個平行設3 個重復。
1.3.5 綠茶和紅茶提取液冠突散囊菌發(fā)酵前后香氣成分的測定
1.3.5.1 香氣成分的提?。斂展滔辔⑤腿》ǎ?/p>
分別取12 mL樣品裝入20 mL萃取瓶中,然后將裝有萃取頭的手動進樣器插入萃取瓶的頂空部分(注意避免萃取纖維頭接觸樣品),在磁力攪拌條件下60 ℃萃取60 min,完成萃取后,迅速插入氣相色譜進樣口,250 ℃解吸5 min[20-22]。
1.3.5.2 色譜條件
色譜柱:BR-5MS毛細管色譜柱(30 mm×0.25 mm,0.25 μm);進樣口溫度250 ℃;檢測器溫度250 ℃;載氣:高純氦氣(純度>99.999%);流速1 mL/min;升溫程序:起始柱溫40 ℃,保持3 min,以3 ℃/min升至210 ℃,保持1 min,再以10 ℃/min升至250 min,保持5 min;不分流進樣。
1.3.5.3 質譜條件
電子電離源;轉接口溫度280 ℃;進樣口溫度250 ℃;離子源溫度230 ℃;電子能量70 eV;四極桿溫度150 ℃;質量掃描范圍40~500 u。
1.3.6 譜圖分析
定性分析:由氣相色譜-質譜分析得到的質譜數(shù)據(jù)通過計算機在NIST標準譜庫的檢索及參照已發(fā)表的質譜資料,對化合物進行定性分析,鑒定。
定量分析:用峰面積表示各成分的含量。
從綠茶原料中共檢測出58 種化合物(表1),其中含量最高的10 種成分分別為壬醛、芳樟醇、鄰苯二甲酸二異丁酯、硬脂酸、棕櫚油酸、L-香芹醇、植酮、橙花醇、β-環(huán)檸檬醛、吲哚。通過對香氣類型進行分析發(fā)現(xiàn)(表2),醇類7 種、醛類8 種、酮類7 種、酸類5 種、酯類9 種、碳氫化合物12 種、其他10 種。含量最高的是醇類,占香氣總量的19.3%,其次是醛類、酸類、酯類、酮類,各占18.5%、15.9%、15.8%、10.8%和12.1%。這些揮發(fā)性成分構成了綠茶原料的香氣特征。
由表1可以看出,浸提和滅菌對綠茶香氣的影響很大。香氣物質種類顯著減少,浸提后由58 種減少到26 種,滅菌后的綠茶浸提液僅檢測出11 種揮發(fā)性物質。絕大部分能檢測到的香氣物質含量也顯著減少,其中酸類物質變化最大,浸提以及滅菌后的浸提液未能檢測出任何酸類物質。
經(jīng)過冠突散囊菌發(fā)酵后的綠茶浸提液中共檢測到38 種化合物(表1),其中含量較高的10 種香氣物質分別為對甲氧基苯乙烯、芳樟醇、3,4-二甲基苯甲酸甲酯、香葉酸甲酯、芳樟醇氧化物I、α-松油醇、2,5-二叔丁基酚、咖啡堿、鄰苯二甲酸二異丁酯、β-大馬士酮。部分浸提和滅菌后消失的香氣組分經(jīng)過冠突散囊菌發(fā)酵后再次出現(xiàn),包括芳樟醇氧化物I、芳樟醇氧化物II、癸醛、β-環(huán)檸檬醛、反-2-癸烯醛、2-甲基萘、(Z)-己酸-3-己烯酯、順茉莉酮、α-紫羅酮、植酮等。同時發(fā)酵后的浸提液新檢測出10 種化合物,分別為苯甲酸甲酯、異佛爾酮、對甲氧基苯乙烯、對乙基苯甲醛、香葉醇、香葉酸甲酯、3,4-二甲基苯甲酸甲酯、4-甲基-2-苯基-2-戊烯醛、β-大馬士酮、2,2,4-三甲基-1,2-二氫呋喃。7 種化合物在發(fā)酵后與原料相比含量增加,芳樟醇為原料的2.30 倍,芳樟醇氧化物I為3.15 倍,芳樟醇氧化物II為3.04 倍,苯乙酸甲酯為1.29 倍,α-松油醇為4.18 倍,反-2-癸烯醛為1.10 倍,α-紫羅酮為3.08 倍。發(fā)酵后與原料相比含量減少的有壬醛、藏花醛、癸醛、β-環(huán)檸檬醛、2-甲基萘、(Z)-己酸-3-己烯酯、順茉莉酮、β-紫羅酮、肉豆蔻醛等,以醛類居多。
表1 氣相色譜-質譜測定綠茶提取液冠突散囊菌發(fā)酵前后揮發(fā)性香氣成分Table 1 GC-MS analysis of volatile flavor compounds of green tea infusion fermented with E. cristatum
續(xù)表1
表2 綠茶提取液冠突散囊菌發(fā)酵過程中不同類型香氣總量變化Table 2 Changes in concentrations of different chemical groups of aroma components during fermentation of green tea infusion with E. cristatum
從紅茶原料中共檢測出49 種化合物(表3),其中含量較高的10 種成分分別為橙花醇、β-紫羅酮、芳樟醇、苯乙醇、壬醛、苯乙醛、β-環(huán)檸檬醛、芳樟醇氧化物II、水楊酸甲酯、苯乙酸甲酯、鄰苯二甲酸二異丁酯。通過對香氣類型進行分析(表4),醇類6 種、醛類13 種、酮類5 種、酸類1 種、酯類8 種、碳氫化合物10 種、其他6 種。含量最高醇類,占香氣總量的31.0%,其次是醛類、酮類、酯類、碳氫化合物、酸類,各占28.0%、14.7%、11.6%、9.0%和3.1%。這些揮發(fā)性成分構成了紅茶原料的香氣特征。
表3 氣相色譜-質譜測定紅茶提取液冠突散囊菌發(fā)酵前后揮發(fā)性香氣成分Table 3 GC-MS analysis results of volatile flavor compounds of black tea infusion fermented with E. cristatum
續(xù)表3
由表3可以看出,浸提和滅菌對紅茶茶香氣物質種類的影響不大。香氣物質種類無顯著變化,浸提后仍有44 種,而滅菌后的紅茶浸提液檢測出45 種揮發(fā)性物質。浸提后能檢測到的香氣物質含量不同程度的下降,變化的最大是酸類和酯類,比起原料,酸類減少了75.9%,酯類減少了57.7%。
經(jīng)過冠突散囊菌發(fā)酵后的紅茶浸提液中共檢測到35 種化合物(表4),其中含量較高的10 種香氣物質分別為苯甲酸甲酯、香葉醇、芳樟醇、3,4-二甲基苯甲酸甲酯、苯乙醛、鄰苯二甲酸二異丁酯、季酮酸、2-莰烯、β-大馬士酮、2,5-二叔丁基苯酚。發(fā)酵后,紅茶發(fā)酵液中各香氣物質含量呈現(xiàn)下降趨勢,其中醛類的變化最大,比起原料減少了91.1%,部分醛類物質在發(fā)酵后未檢出,包括反-2-壬烯醛、2-苯基巴豆醛、順檸檬醛、4-甲基-2-苯基-2-戊烯醛、月桂醛、肉豆蔻醛;而苯乙醇、橙花醇、水楊酸甲酯、茴香腦、茶螺烷、1,1,6-三甲基-1,2-二氫萘、1,2,3,4-四氫-1,1,6-三甲基萘、(Z)-己酸-3-己烯酯、香葉基丙酮、十五烷、順式-3-己烯醇、苯甲酸酯、十七烷、植烷、肉豆蔻酸異丙酯、棕櫚酸甲酯等物質在發(fā)酵后也未檢出。同時發(fā)酵后的浸提液出現(xiàn)了6 種原料中沒有的化合物,分別為苯甲酸甲酯、異佛爾酮、對甲氧基苯乙烯、對乙基苯甲醛、香葉酸甲酯、3,4-二甲基苯甲酸甲酯。
表4 紅茶提取液冠突散囊菌發(fā)酵過程中不同類型香氣總量變化Table 4 Changes in concentrations of different chemical groups of aroma components during fermentation of black tea infusion with E. cristatum
在綠茶和紅茶原料中,均檢出苯乙醇、芳樟醇及其氧化物、水楊酸甲酯等特征香氣成分,這與已有研究結果吻合[23-27]。但綠茶和紅茶原料中的香氣物質在組成和含量上有顯著差別[28]。雖然綠茶原料中檢出的化合物種類比紅茶多,但大部分測得的香氣物質含量在紅茶中更高。
茶葉中絕大部分揮發(fā)性成分在浸提以及滅菌過程中揮發(fā)丟失或減少。浸提過程中水浴溫度約為100 ℃,而滅菌鍋工作的溫度為121 ℃、壓強為0.1 MPa。原料中測得的揮發(fā)性成分在常壓下的沸點基本為190~210 ℃左右,因此在浸提以及滅菌的過程中丟失或減少。但也有極少數(shù)的揮發(fā)性物質經(jīng)過浸提或者滅菌后含量增加,這可能與某些物質的氧化降解有關,比如有研究顯示胡蘿卜素熱降解生成紫羅酮等物質。
苯甲酸甲酯、異佛爾酮、對甲氧基苯乙烯、對乙基苯甲醛、香葉酸甲酯、3,4-二甲基苯甲酸甲酯,這6 種物質是綠茶和紅茶浸提液原料不存在而在發(fā)酵后新生成的共有化合物。其中苯甲酸甲酯,又名安息香酸甲酯,具有濃郁的冬青油和尤南迦油香氣。異佛爾酮帶有薄荷香或樟腦味。這些新生成的香氣物質賦予發(fā)酵后的茶湯新的香氣特征。
綠茶湯經(jīng)冠突散囊菌發(fā)酵后,芳樟醇為原料的2.30 倍,芳樟醇氧化物I為3.15 倍,芳樟醇氧化物II為3.04 倍,苯乙酸甲酯為1.29 倍,α-松油醇為4.18 倍,反-2-癸烯醛為1.10 倍,α-紫羅酮為3.08 倍。但紅茶湯經(jīng)冠突散囊菌發(fā)酵后香氣物質含量比起原料基本是降低的,因此冠突散囊菌發(fā)酵紅茶帶來香氣種類與含量的下降,并沒有改善效果,其原因可能是冠突散囊菌發(fā)酵形成香氣的底物在紅茶加工過程中已經(jīng)發(fā)生了較大的消耗,而發(fā)酵又讓原本形成的很多香氣成分損失。因此,利用冠突散囊菌發(fā)酵來開發(fā)深加工茶產品應以低檔綠茶為原料為主,這將更有利于改善產品香氣組成,形成“菌花香”。
王華夫等[29]研究了傳統(tǒng)茯磚茶香氣成分的變化,發(fā)現(xiàn)醛類香氣物質含量呈現(xiàn)上升的趨勢,但在本實驗中則出現(xiàn)下降的趨勢。這種可能由于發(fā)酵工藝、萃取方式以及所用茶樣不同導致。何紅霞等[30]運用同時蒸餾萃取-氣相色譜-質譜聯(lián)用法測定茯茶“散茶發(fā)花”過程中香氣成分,發(fā)現(xiàn)變化最為顯著的1-辛烯-3-醇、芳樟醇、芳樟醇氧化物I和II對形成散茯茶的特征香氣有重要貢獻。本實驗中未測得1-辛烯-3-醇,但芳樟醇、芳樟醇氧化物I和II的變化趨勢相同。