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        冠突散囊菌發(fā)酵對(duì)茶湯香氣成分的影響

        2019-10-08 03:48:58鄭夢(mèng)霞李會(huì)娟陳淑娜劉馨秋黎星輝
        食品科學(xué) 2019年18期
        關(guān)鍵詞:磚茶芳樟醇甲酯

        鄭夢(mèng)霞,李會(huì)娟,陳淑娜,趙 真,劉馨秋,黎星輝,陳 暄*

        (南京農(nóng)業(yè)大學(xué)茶葉研究所,江蘇 南京 210095)

        香氣是茶葉的重要品質(zhì)因素,茶葉中的芳香物質(zhì)即揮發(fā)性香氣成分,是茶葉中所有易揮發(fā)性物質(zhì)的總稱。不同的栽培技術(shù)和加工工藝造就了不同類型的茶葉擁有其獨(dú)特的香氣特征[1-4]。

        冠突散囊菌(Eurotium cristatum),俗稱“金花菌”,是茯磚茶獨(dú)特的“發(fā)花”工藝中的一種優(yōu)勢(shì)益生菌[5-6]。經(jīng)過(guò)“發(fā)花”工藝后的茯磚茶表面均勻地分布著冠突散囊菌產(chǎn)生的黃色閉囊殼——“金花”,而“金花”的數(shù)量和質(zhì)量常被人們視作茯磚茶品質(zhì)優(yōu)劣判定的標(biāo)志。茯磚茶的獨(dú)特保健功能,不僅與黑毛茶本身含有的功能成分相關(guān),而且更與茯磚茶“渥堆”、“發(fā)花”過(guò)程中因微生物代謝而產(chǎn)生的生物活性成分相關(guān)[7-9],因此發(fā)花過(guò)程形成的“金花菌”對(duì)茯磚茶保健功能的形成起著特殊的作用,是決定茯磚茶品質(zhì)的關(guān)鍵因素。香氣也是構(gòu)成茯磚茶獨(dú)特品質(zhì)的重要因子,渥堆發(fā)酵過(guò)程中,由于冠突散囊菌等微生物形成的胞外酶與茶葉本身濕熱作用的協(xié)同下,形成茯磚茶典型獨(dú)特的“菌花香”香氣特征[10]。

        應(yīng)用冠突散囊菌制備發(fā)酵型茶飲料,可以有效地利用液體發(fā)酵工藝進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn),具備產(chǎn)量高、培養(yǎng)周期短、易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn),并可以促進(jìn)低檔茶的增值開發(fā)利用。目前,針對(duì)冠突散囊菌液體發(fā)酵茶湯、發(fā)酵條件的優(yōu)化以及發(fā)酵過(guò)程中生化成分的動(dòng)態(tài)變化等均有研究,表現(xiàn)為多酚、兒茶素、咖啡堿等成分含量的降低,酯型兒茶素的轉(zhuǎn)化等[11-14],但對(duì)香氣在此過(guò)程中的變化研究較少,多使用“菌花香”描述[15],目前對(duì)茯磚茶香氣的種類有所研究[16-19],但茯磚茶為固體發(fā)酵,過(guò)程較長(zhǎng),參與的微生物種類較多,環(huán)境濕熱對(duì)香氣物質(zhì)也有較大影響,冠突散囊菌發(fā)酵產(chǎn)生的新增芳香物質(zhì)及其物質(zhì)基礎(chǔ)鮮見報(bào)道。

        本實(shí)驗(yàn)僅利用冠突散囊菌作為唯一菌種對(duì)中低檔綠茶和紅茶浸提液進(jìn)行液體發(fā)酵,采用頂空固相微萃取法結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜法鑒定茶葉審評(píng)樣、浸提液滅菌樣以及發(fā)酵前后的香氣成分,分析香氣成分的變化,探索冠突散囊菌對(duì)綠茶及紅茶香氣成分的影響,以期為茯磚茶香氣品質(zhì)形成機(jī)理及發(fā)酵類茶飲料的增香技術(shù)研究提供理論依據(jù),為解決中低檔茶葉出路尋找有效的方法。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        冠突散囊菌由湖南益陽(yáng)茶廠生產(chǎn)的茯磚茶中分離得到并鑒定,保存于4 ℃冰箱。綠茶(二級(jí)炒青綠茶)、紅茶(二級(jí)工夫紅茶)均購(gòu)于南京蘇果超市。葡萄糖、瓊脂、蔗糖均為國(guó)產(chǎn)分析純。

        1.2 儀器與設(shè)備

        20 mL頂空萃取瓶 上海安普公司;手動(dòng)固相微萃取進(jìn)樣手柄、65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯萃取頭美國(guó)Supelco公司;450-GC 320-MS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀德國(guó)Bruker公司。

        1.3 方法

        1.3.1 冠突散囊菌的活化培養(yǎng)

        取冠突散囊菌種,置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中活化24 h,挑取菌絲體在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(potato dextrose agar,PDA)斜面上劃線,然后放置到28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d。

        1.3.2 冠突散囊菌孢子懸液的制備

        取活化后試管,在無(wú)菌操作條件下,倒入無(wú)菌水10 mL,用接種環(huán)將黃色閉囊殼刮下,懸浮于無(wú)菌水中,再將懸浮液倒入玻璃珠的錐形瓶中,振搖20 min,將其OD600值調(diào)整用于接種(孢子濃度為5.0×108~6.0×108CFU/mL)。

        1.3.3 茶葉浸提液的制備

        審評(píng)樣制備:按照GB/T 23776—2018《茶葉感官審評(píng)方法》,取3.0 g茶樣,加入150 mL沸水,5 min后取樣。

        提取樣制備:按照茶水比1∶30(g/mL)稱取一定量預(yù)先磨碎的茶葉試樣于錐形瓶中,加入蒸餾水后立即移入沸水浴,浸提45 min(每隔10 min攪拌一次),立即減壓過(guò)濾,殘?jiān)蒙倭空麴s水洗2~3 次,合并濾液加蒸餾水定容備用。添加6%的蔗糖,調(diào)整初始pH值至5.5,混勻后分裝,滅菌(121 ℃,30 min)。

        1.3.4 冠突散囊菌液體發(fā)酵培養(yǎng)

        在250 mL錐形瓶中裝入上述茶汁發(fā)酵培養(yǎng)基100 mL,接入冠突散囊菌孢子懸液1 mL(即接種量為1%),在30 ℃、120 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng),每個(gè)平行設(shè)3 個(gè)重復(fù)。

        1.3.5 綠茶和紅茶提取液冠突散囊菌發(fā)酵前后香氣成分的測(cè)定

        1.3.5.1 香氣成分的提?。斂展滔辔⑤腿》ǎ?/p>

        分別取12 mL樣品裝入20 mL萃取瓶中,然后將裝有萃取頭的手動(dòng)進(jìn)樣器插入萃取瓶的頂空部分(注意避免萃取纖維頭接觸樣品),在磁力攪拌條件下60 ℃萃取60 min,完成萃取后,迅速插入氣相色譜進(jìn)樣口,250 ℃解吸5 min[20-22]。

        1.3.5.2 色譜條件

        色譜柱:BR-5MS毛細(xì)管色譜柱(30 mm×0.25 mm,0.25 μm);進(jìn)樣口溫度250 ℃;檢測(cè)器溫度250 ℃;載氣:高純氦氣(純度>99.999%);流速1 mL/min;升溫程序:起始柱溫40 ℃,保持3 min,以3 ℃/min升至210 ℃,保持1 min,再以10 ℃/min升至250 min,保持5 min;不分流進(jìn)樣。

        1.3.5.3 質(zhì)譜條件

        電子電離源;轉(zhuǎn)接口溫度280 ℃;進(jìn)樣口溫度250 ℃;離子源溫度230 ℃;電子能量70 eV;四極桿溫度150 ℃;質(zhì)量掃描范圍40~500 u。

        1.3.6 譜圖分析

        定性分析:由氣相色譜-質(zhì)譜分析得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過(guò)計(jì)算機(jī)在NIST標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)的檢索及參照已發(fā)表的質(zhì)譜資料,對(duì)化合物進(jìn)行定性分析,鑒定。

        定量分析:用峰面積表示各成分的含量。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 綠茶提取液冠突散囊菌發(fā)酵前后揮發(fā)性組分特征

        從綠茶原料中共檢測(cè)出58 種化合物(表1),其中含量最高的10 種成分分別為壬醛、芳樟醇、鄰苯二甲酸二異丁酯、硬脂酸、棕櫚油酸、L-香芹醇、植酮、橙花醇、β-環(huán)檸檬醛、吲哚。通過(guò)對(duì)香氣類型進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)(表2),醇類7 種、醛類8 種、酮類7 種、酸類5 種、酯類9 種、碳?xì)浠衔?2 種、其他10 種。含量最高的是醇類,占香氣總量的19.3%,其次是醛類、酸類、酯類、酮類,各占18.5%、15.9%、15.8%、10.8%和12.1%。這些揮發(fā)性成分構(gòu)成了綠茶原料的香氣特征。

        由表1可以看出,浸提和滅菌對(duì)綠茶香氣的影響很大。香氣物質(zhì)種類顯著減少,浸提后由58 種減少到26 種,滅菌后的綠茶浸提液僅檢測(cè)出11 種揮發(fā)性物質(zhì)。絕大部分能檢測(cè)到的香氣物質(zhì)含量也顯著減少,其中酸類物質(zhì)變化最大,浸提以及滅菌后的浸提液未能檢測(cè)出任何酸類物質(zhì)。

        經(jīng)過(guò)冠突散囊菌發(fā)酵后的綠茶浸提液中共檢測(cè)到38 種化合物(表1),其中含量較高的10 種香氣物質(zhì)分別為對(duì)甲氧基苯乙烯、芳樟醇、3,4-二甲基苯甲酸甲酯、香葉酸甲酯、芳樟醇氧化物I、α-松油醇、2,5-二叔丁基酚、咖啡堿、鄰苯二甲酸二異丁酯、β-大馬士酮。部分浸提和滅菌后消失的香氣組分經(jīng)過(guò)冠突散囊菌發(fā)酵后再次出現(xiàn),包括芳樟醇氧化物I、芳樟醇氧化物II、癸醛、β-環(huán)檸檬醛、反-2-癸烯醛、2-甲基萘、(Z)-己酸-3-己烯酯、順茉莉酮、α-紫羅酮、植酮等。同時(shí)發(fā)酵后的浸提液新檢測(cè)出10 種化合物,分別為苯甲酸甲酯、異佛爾酮、對(duì)甲氧基苯乙烯、對(duì)乙基苯甲醛、香葉醇、香葉酸甲酯、3,4-二甲基苯甲酸甲酯、4-甲基-2-苯基-2-戊烯醛、β-大馬士酮、2,2,4-三甲基-1,2-二氫呋喃。7 種化合物在發(fā)酵后與原料相比含量增加,芳樟醇為原料的2.30 倍,芳樟醇氧化物I為3.15 倍,芳樟醇氧化物II為3.04 倍,苯乙酸甲酯為1.29 倍,α-松油醇為4.18 倍,反-2-癸烯醛為1.10 倍,α-紫羅酮為3.08 倍。發(fā)酵后與原料相比含量減少的有壬醛、藏花醛、癸醛、β-環(huán)檸檬醛、2-甲基萘、(Z)-己酸-3-己烯酯、順茉莉酮、β-紫羅酮、肉豆蔻醛等,以醛類居多。

        表1 氣相色譜-質(zhì)譜測(cè)定綠茶提取液冠突散囊菌發(fā)酵前后揮發(fā)性香氣成分Table 1 GC-MS analysis of volatile flavor compounds of green tea infusion fermented with E. cristatum

        續(xù)表1

        表2 綠茶提取液冠突散囊菌發(fā)酵過(guò)程中不同類型香氣總量變化Table 2 Changes in concentrations of different chemical groups of aroma components during fermentation of green tea infusion with E. cristatum

        2.2 紅茶提取液冠突散囊菌發(fā)酵前后揮發(fā)性組分特征

        從紅茶原料中共檢測(cè)出49 種化合物(表3),其中含量較高的10 種成分分別為橙花醇、β-紫羅酮、芳樟醇、苯乙醇、壬醛、苯乙醛、β-環(huán)檸檬醛、芳樟醇氧化物II、水楊酸甲酯、苯乙酸甲酯、鄰苯二甲酸二異丁酯。通過(guò)對(duì)香氣類型進(jìn)行分析(表4),醇類6 種、醛類13 種、酮類5 種、酸類1 種、酯類8 種、碳?xì)浠衔?0 種、其他6 種。含量最高醇類,占香氣總量的31.0%,其次是醛類、酮類、酯類、碳?xì)浠衔?、酸類,各?8.0%、14.7%、11.6%、9.0%和3.1%。這些揮發(fā)性成分構(gòu)成了紅茶原料的香氣特征。

        表3 氣相色譜-質(zhì)譜測(cè)定紅茶提取液冠突散囊菌發(fā)酵前后揮發(fā)性香氣成分Table 3 GC-MS analysis results of volatile flavor compounds of black tea infusion fermented with E. cristatum

        續(xù)表3

        由表3可以看出,浸提和滅菌對(duì)紅茶茶香氣物質(zhì)種類的影響不大。香氣物質(zhì)種類無(wú)顯著變化,浸提后仍有44 種,而滅菌后的紅茶浸提液檢測(cè)出45 種揮發(fā)性物質(zhì)。浸提后能檢測(cè)到的香氣物質(zhì)含量不同程度的下降,變化的最大是酸類和酯類,比起原料,酸類減少了75.9%,酯類減少了57.7%。

        經(jīng)過(guò)冠突散囊菌發(fā)酵后的紅茶浸提液中共檢測(cè)到35 種化合物(表4),其中含量較高的10 種香氣物質(zhì)分別為苯甲酸甲酯、香葉醇、芳樟醇、3,4-二甲基苯甲酸甲酯、苯乙醛、鄰苯二甲酸二異丁酯、季酮酸、2-莰烯、β-大馬士酮、2,5-二叔丁基苯酚。發(fā)酵后,紅茶發(fā)酵液中各香氣物質(zhì)含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì),其中醛類的變化最大,比起原料減少了91.1%,部分醛類物質(zhì)在發(fā)酵后未檢出,包括反-2-壬烯醛、2-苯基巴豆醛、順檸檬醛、4-甲基-2-苯基-2-戊烯醛、月桂醛、肉豆蔻醛;而苯乙醇、橙花醇、水楊酸甲酯、茴香腦、茶螺烷、1,1,6-三甲基-1,2-二氫萘、1,2,3,4-四氫-1,1,6-三甲基萘、(Z)-己酸-3-己烯酯、香葉基丙酮、十五烷、順式-3-己烯醇、苯甲酸酯、十七烷、植烷、肉豆蔻酸異丙酯、棕櫚酸甲酯等物質(zhì)在發(fā)酵后也未檢出。同時(shí)發(fā)酵后的浸提液出現(xiàn)了6 種原料中沒有的化合物,分別為苯甲酸甲酯、異佛爾酮、對(duì)甲氧基苯乙烯、對(duì)乙基苯甲醛、香葉酸甲酯、3,4-二甲基苯甲酸甲酯。

        表4 紅茶提取液冠突散囊菌發(fā)酵過(guò)程中不同類型香氣總量變化Table 4 Changes in concentrations of different chemical groups of aroma components during fermentation of black tea infusion with E. cristatum

        3 討 論

        在綠茶和紅茶原料中,均檢出苯乙醇、芳樟醇及其氧化物、水楊酸甲酯等特征香氣成分,這與已有研究結(jié)果吻合[23-27]。但綠茶和紅茶原料中的香氣物質(zhì)在組成和含量上有顯著差別[28]。雖然綠茶原料中檢出的化合物種類比紅茶多,但大部分測(cè)得的香氣物質(zhì)含量在紅茶中更高。

        茶葉中絕大部分揮發(fā)性成分在浸提以及滅菌過(guò)程中揮發(fā)丟失或減少。浸提過(guò)程中水浴溫度約為100 ℃,而滅菌鍋工作的溫度為121 ℃、壓強(qiáng)為0.1 MPa。原料中測(cè)得的揮發(fā)性成分在常壓下的沸點(diǎn)基本為190~210 ℃左右,因此在浸提以及滅菌的過(guò)程中丟失或減少。但也有極少數(shù)的揮發(fā)性物質(zhì)經(jīng)過(guò)浸提或者滅菌后含量增加,這可能與某些物質(zhì)的氧化降解有關(guān),比如有研究顯示胡蘿卜素?zé)峤到馍勺狭_酮等物質(zhì)。

        苯甲酸甲酯、異佛爾酮、對(duì)甲氧基苯乙烯、對(duì)乙基苯甲醛、香葉酸甲酯、3,4-二甲基苯甲酸甲酯,這6 種物質(zhì)是綠茶和紅茶浸提液原料不存在而在發(fā)酵后新生成的共有化合物。其中苯甲酸甲酯,又名安息香酸甲酯,具有濃郁的冬青油和尤南迦油香氣。異佛爾酮帶有薄荷香或樟腦味。這些新生成的香氣物質(zhì)賦予發(fā)酵后的茶湯新的香氣特征。

        綠茶湯經(jīng)冠突散囊菌發(fā)酵后,芳樟醇為原料的2.30 倍,芳樟醇氧化物I為3.15 倍,芳樟醇氧化物II為3.04 倍,苯乙酸甲酯為1.29 倍,α-松油醇為4.18 倍,反-2-癸烯醛為1.10 倍,α-紫羅酮為3.08 倍。但紅茶湯經(jīng)冠突散囊菌發(fā)酵后香氣物質(zhì)含量比起原料基本是降低的,因此冠突散囊菌發(fā)酵紅茶帶來(lái)香氣種類與含量的下降,并沒有改善效果,其原因可能是冠突散囊菌發(fā)酵形成香氣的底物在紅茶加工過(guò)程中已經(jīng)發(fā)生了較大的消耗,而發(fā)酵又讓原本形成的很多香氣成分損失。因此,利用冠突散囊菌發(fā)酵來(lái)開發(fā)深加工茶產(chǎn)品應(yīng)以低檔綠茶為原料為主,這將更有利于改善產(chǎn)品香氣組成,形成“菌花香”。

        王華夫等[29]研究了傳統(tǒng)茯磚茶香氣成分的變化,發(fā)現(xiàn)醛類香氣物質(zhì)含量呈現(xiàn)上升的趨勢(shì),但在本實(shí)驗(yàn)中則出現(xiàn)下降的趨勢(shì)。這種可能由于發(fā)酵工藝、萃取方式以及所用茶樣不同導(dǎo)致。何紅霞等[30]運(yùn)用同時(shí)蒸餾萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定茯茶“散茶發(fā)花”過(guò)程中香氣成分,發(fā)現(xiàn)變化最為顯著的1-辛烯-3-醇、芳樟醇、芳樟醇氧化物I和II對(duì)形成散茯茶的特征香氣有重要貢獻(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)中未測(cè)得1-辛烯-3-醇,但芳樟醇、芳樟醇氧化物I和II的變化趨勢(shì)相同。

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