于凱慧，張夢涵，高 菁，駱健美*

（天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457）

山西老陳醋在我國有3 000多年的歷史，通過固態(tài)發(fā)酵過程中多種微生物的不斷繁殖和演替，產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，進(jìn)而賦予產(chǎn)品獨(dú)特的口感與風(fēng)味。酒精發(fā)酵階段，糖類物質(zhì)在微生物及其酶系液化糖化的作用下發(fā)酵生成酒精等，醋酸發(fā)酵階段，糖類和醇類物質(zhì)在醋酸菌、乳酸菌等微生物的共同作用下分解代謝生成乙酸、乳酸等酸類物質(zhì)，同時(shí)產(chǎn)生多種風(fēng)味物質(zhì)，形成特有的風(fēng)味[1]。聶志強(qiáng)等[2-3]發(fā)現(xiàn)，乳酸菌在山西老陳醋中豐度較高，且存在于食醋釀造各個(gè)階段，主要包括食竇魏斯氏菌（Weissella cibaria）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）、乳酸片球菌（Pediococcus acidiactici）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、鼠李糖乳桿菌（Lactob acillus rhamnosus）等。這些不同種類的乳酸菌產(chǎn)生的乳酸、琥珀酸、蘋果酸等有機(jī)酸對(duì)食醋風(fēng)味和品質(zhì)具有重要的作用[4]。反過來，食醋釀造過程中積累的這些有機(jī)酸也會(huì)對(duì)乳酸菌產(chǎn)生脅迫作用。山西老陳醋固態(tài)釀造過程中總酸度最高可達(dá)5.64 g/100 mL，與之對(duì)應(yīng)的pH在3.5～4.5內(nèi)波動(dòng)[3]。因此，研究乳酸菌的耐酸機(jī)制，對(duì)于深入理解該類微生物在山西老陳醋固態(tài)釀造過程中的作用具有重要的科學(xué)意義。

目前研究者主要對(duì)一些模式微生物（如干酪乳桿菌[5-6]、植物乳桿菌[7-9]、乳酸乳球菌（Lactococcuslactis）[8-9]、鼠李糖乳桿菌[10]、戊糖乳桿菌[11）]在單一酸壓力（如鹽酸[7-12]和乳酸[13）]下的耐性機(jī)制展開了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乳酸菌的耐酸機(jī)制主要包括：維持胞內(nèi)pH穩(wěn)態(tài)[14-15]；改變細(xì)胞膜的組成和流動(dòng)性[16，17]；脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）和蛋白質(zhì)對(duì)酸耐受的保護(hù)和修復(fù)作用[18-19]；糖酵解/糖異生、丙酮酸代謝等代謝調(diào)控[20-21]。目前，以來源于復(fù)雜酸性環(huán)境的山西老陳醋的乳酸菌為對(duì)象，研究其在多種酸壓力下的耐性機(jī)制還未見報(bào)道。

課題組前期對(duì)山西老陳醋固態(tài)釀造過程中不同階段（大曲；酒精發(fā)酵1d、4d、7d、10d；醋酸發(fā)酵0d、3d、5d、7d；陳釀）的樣品總酸度及乳酸菌菌群的耐醋酸性能進(jìn)行了初步分析。結(jié)果表明，醋酸發(fā)酵3 d和7 d的樣品總酸度分別為5.24 g/100 mL和6.35 g/100 mL，乳酸菌菌群在3%（V/V）醋酸下混合培養(yǎng)后的培養(yǎng)液具有較高的OD600nm值，這暗示該菌群中的乳酸菌具有較高的酸耐受能力[22]。在此基礎(chǔ)上，本論文對(duì)上述菌群中分離純化得到的8株乳酸菌分離株（瑞士乳桿菌AAF3-1、干酪乳桿菌AAF3-2、乳酸片球菌AAF3-3、干酪乳桿菌AAF3-5，來源于醋酸發(fā)酵3 d；食竇魏斯氏菌AAF7-1、食竇魏斯氏菌AAF7-2、干酪乳桿菌AAF7-4、乳酸片球菌AAF7-5，來源于醋酸發(fā)酵7 d）的耐醋酸性能展開進(jìn)一步分析，篩選獲得了耐醋酸性能優(yōu)良的乳酸片球菌，利用定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)初篩得到的在三種酸壓力（醋酸、乳酸、鹽酸）下表達(dá)水平均顯著上調(diào)的蛋白——乙酰輔酶A羧化酶編碼基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測。之后，利用過表達(dá)技術(shù)，探討該基因?qū)θ樗崞蚓退嵝阅艿挠绊懀瑸樯轿骼详惔坠虘B(tài)釀造過程中乳酸菌的耐酸機(jī)制和耐酸性能調(diào)控研究提供了重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

本實(shí)驗(yàn)所用菌株和質(zhì)粒見表1。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in the experiment

1.1.2 材料與試劑

TransStart Fast Pfu DNA Polymerase酶（2.5 U/μL）：北京全式金生物技術(shù)有限公司；DL 5000 marker、PrimeScript RT reagent Kit、SYBR Premix ExTaqGC試劑盒：寶生物（大連）有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒（DP302）：北京天根生化科技有限公司；Plasmid Mini Kit I、Gel Extraction Kit、Cycle-Pure Kit：美國Omega公司；EastepTM總RNA提取試劑盒：上海普洛麥格生物有限公司；ClonExpress One Step Cloning Kit：南京諾唯贊生物科技有限公司；其余試劑為生化試劑或化學(xué)純?cè)噭?，均購自天津市福晨化學(xué)試劑廠。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 000 mL，調(diào)節(jié)pH 7.2，121℃滅菌20 min。

LB固體培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基中加入20 g/L的瓊脂，121℃滅菌20 min。

MRS液體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，牛肉提取物10 g，酵母提取物5 g，無水乙酸鈉5 g，吐溫80 1mL，檸檬酸銨2 g，磷酸氫二鉀2 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，調(diào)節(jié)pH至6.2～6.8，蒸餾水1 000 mL，121℃滅菌20 min。

MRS固體培養(yǎng)基：MRS液體培養(yǎng)基中加入20 g/L的瓊脂，121℃滅菌20 min。

復(fù)蘇培養(yǎng)基：MRS液體培養(yǎng)基中加入0.5mol/L的蔗糖，115℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

GHP-9270恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；GI54D高壓蒸汽滅菌鍋：美國Zealway公司；DYY-2C電泳儀、Gel Doc XR凝膠成像儀：美國Bio-Rad公司；ECM 399高壓脈沖電轉(zhuǎn)儀：北京市六一儀器廠；PHS-3C標(biāo)準(zhǔn)pH計(jì)：上海梅特勒-托利多儀器有限公司；UVmini-1240紫外分光光度計(jì)：上海分析儀器廠；SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；Bioscreen C全自動(dòng)生長曲線分析儀：芬蘭Bioscreen公司；ABI Step-One Plus Real Time PCR System：美國Applied Biosystems公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌菌株的活化和培養(yǎng)

從甘油管中分別吸取菌液，以2%（V/V）接種量接種到裝有5 mL MRS培養(yǎng)基的試管中，37℃恒溫箱中靜置活化培養(yǎng)8h。以2%（V/V）接種量將上述培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接入裝有新鮮的5 mL MRS液體培養(yǎng)基的試管中，37℃恒溫箱中靜置進(jìn)行一級(jí)培養(yǎng)，培養(yǎng)8 h后菌體生長進(jìn)入對(duì)數(shù)期（OD600nm值≈1.0）。以1%（V/V）的接種量將一級(jí)培養(yǎng)液接入裝液量為100 mL/250 mL的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫箱中靜置進(jìn)行二級(jí)培養(yǎng)。對(duì)于工程菌株，培養(yǎng)基中需要加入10μg/mL的氯霉素維持質(zhì)粒的穩(wěn)定性。

1.3.2 乳酸菌分離株的生長曲線測定

按照1.3.1的方法進(jìn)行菌株的活化和一級(jí)培養(yǎng)，在二級(jí)培養(yǎng)初始將OD600nm值調(diào)節(jié)為0.1，取300 μL培養(yǎng)液接入殺菌消毒的微生物生長板的微孔中，每株菌設(shè)三個(gè)平行，放入全自動(dòng)生長曲線分析儀中，設(shè)置溫度環(huán)境37℃，設(shè)置菌體濃度檢測頻率30 min，培養(yǎng)至微生物生長穩(wěn)定期。

1.3.3 乳酸菌分離株的耐酸性能分析

菌株在適當(dāng)酸壓力下的生長性能分析：按照1.3.1的方法進(jìn)行菌株的活化和一級(jí)培養(yǎng)，在二級(jí)培養(yǎng)的初始（OD600nm值調(diào)節(jié)為0.1）向培養(yǎng)基中加入不同的酸壓力（包括2%、3%（V/V）醋酸；1%、2%（V/V）乳酸；pH 5.0、4.0、3.5、3.0（鹽酸調(diào)節(jié)）），37℃恒溫箱中靜置培養(yǎng)，于不同時(shí)間取樣，利用紫外分光光度計(jì)測定OD600nm值或者采用平板活菌計(jì)數(shù)法測定培養(yǎng)24 h時(shí)的活菌數(shù)，并以不添加壓力條件作為空白對(duì)照，計(jì)算相對(duì)活菌數(shù)，其計(jì)算公式如下：

菌株在高濃度酸壓力沖擊下的存活性能分析：按照1.3.1的方法進(jìn)行菌株的活化、一級(jí)和二級(jí)培養(yǎng)，待二級(jí)培養(yǎng)至OD600nm值≈1.0（約8 h）時(shí)收集菌體（5 000 r/min、10 min、4℃），并將其重懸于5 mL MRS液體培養(yǎng)基中。將其分成兩份，分別接種到添加壓力（包括含5%（V/V）醋酸，3%（V/V）乳酸，pH 2.5（鹽酸調(diào)節(jié)））和不添加壓力的裝有新鮮的50mLMRS液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中。37℃靜置培養(yǎng)，于不同時(shí)間取樣，利用平板活菌計(jì)數(shù)法37℃恒溫箱中培養(yǎng)36～48 h，測定活菌數(shù)，計(jì)算相對(duì)活菌數(shù)，或稀釋不同梯度后拍照觀察菌落的存活情況。

1.3.4 基因轉(zhuǎn)錄水平分析

按照1.3.3的方法將菌株在5%（V/V）醋酸、3%（V/V）乳酸、pH 2.5（鹽酸調(diào)節(jié)）條件下沖擊90 min后，收集菌體（6 000 r/min、4℃、10 min）。按照EastepTM總RNA提取試劑盒的說明書提取總RNA。按照PrimeScript real-time reagent Kit說明書以RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。設(shè)計(jì)上游引物5'-CTTACCCAGGAATGGATGCTGAATA-3'，下游引物5'-CAATTACGCTGATGTATGGTACCCG-3'，根據(jù)SYBR Premix ExTaqGC試劑盒的說明書，利用ABI Step-One Plus Real Time PCR System儀器進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。以編碼16S rRNA的基因作為內(nèi)參，通過比較Ct（2-ΔΔCt方法）計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)水平，然后歸一化至未經(jīng)壓力處理的條件，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行，結(jié)果取平均值，并用標(biāo)準(zhǔn)偏差顯示其數(shù)據(jù)的波動(dòng)。

1.3.5 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

（1）克隆載體的線性化

線性化克隆載體由反向PCR擴(kuò)增制備。上游引物5'-TCTAGAGAGCTCAAGCTTTC-3'，下游引物5'-CCATGGTGAGTGCCTCCTTA-3'，反應(yīng)條件：95 ℃、3 min；95 ℃、10s，55℃、15s，72℃、3min30s，30個(gè)循環(huán)，使用1%的瓊脂糖凝膠核酸電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行驗(yàn)證。之后加入1μL快切酶DpnI，37℃酶切2 h，進(jìn)行回收。

（2）目的基因的獲得

按照G+細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的說明書提取乳酸片球菌AAF3-3的基因組DNA。用核酸分析儀測定DNA的濃度，通過1%瓊脂糖凝膠核酸電泳檢測，-20℃保存，備用。以基因組為模板，利用上游引物5'-TAAGGAGGCACTCA CCATGGGGATGACAAAAACAGCATATGAAACGG-3'，下游引物5'-GAAAGCTTGAGCTCTCTAGACTAAAATTT ACTAAACCGTTCGTGGC-3'擴(kuò)增基因acc。該方法應(yīng)用同源重組原理連接，引物由與線性化質(zhì)粒兩端互補(bǔ)的堿基序列（下劃線部分）和與目的基因兩端互補(bǔ)的堿基序列（其余部分）兩部分構(gòu)成。PCR反應(yīng)條件見1.3.5（1），使用1%瓊脂糖凝膠核酸電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行驗(yàn)證。

（3）重組質(zhì)粒的構(gòu)建

按照ClonExpress One Step Cloning Kit的說明書配制連接體系。反應(yīng)條件：37℃、30 min。將連接產(chǎn)物采用化轉(zhuǎn)入E.coliMC1061感受態(tài)中。挑取轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒后進(jìn)行PCR和Hind III單酶切驗(yàn)證。選擇條帶大小正確的重組質(zhì)粒送到金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測序。

1.3.6 過表達(dá)菌株的構(gòu)建

參照RODRíGUEZMC等[23]的方法制備感受態(tài)細(xì)胞。具體過程為菌株二級(jí)培養(yǎng)的初始加入40mmol/L蘇氨酸，37℃恒溫靜置培養(yǎng)8 h至OD600nm值≈1.0，收集菌體（6 000 r/min、4℃、10 min），用含7 mmol/L磷酸鉀緩沖液、1 mmol/L氯化鎂的0.5 mol/L蔗糖溶液洗滌三次，然后再用2 000 U/mL的溶菌酶重懸菌體，37℃、20 min，重復(fù)3次，最后用含10%甘油的0.5 mol/L蔗糖溶液重懸分裝。

將測序正確的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)（2 kV/cm，5 ms）進(jìn)入乳酸片球菌AAF3-3的感受態(tài)細(xì)胞中，復(fù)蘇培養(yǎng)基中37℃靜置培養(yǎng)2 h后涂布于含10 μg/mL氯霉素的MRS固體平板上。37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36～48 h后隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化子，通過質(zhì)粒PCR和Hind III單酶切進(jìn)行驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)中，以含有空質(zhì)粒的重組菌株作為對(duì)照菌株。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌分離株在無壓力下的生長性能

山西老陳醋醋酸發(fā)酵3d的4株乳酸菌分離株（AAF3-1、AAF3-2、AAF3-3、AAF3-5）和7d的4株乳酸菌分離株（AAF7-1、AAF7-2、AAF7-4、AAF7-5）在無壓力下的生長曲線見圖1。由圖1可知，8株菌的生長速率和生理階段劃分沒有明顯差異，均存在明顯的延滯期（0～2 h）、對(duì)數(shù)期（2～12 h）、穩(wěn)定期（12～24 h），培養(yǎng)24 h后的最終OD600nm值在1.2～1.4之間波動(dòng)。這表明上述8株乳酸菌分離株在無壓力下的生長性能沒有明顯差異。

圖1 來源于醋酸發(fā)酵3 d和7 d的乳酸菌分離株在無壓力下的生長曲線Fig.1 Growth curves of lactic acid bacteria isolated from acetic acid fermentation for 3 d and 7 d under non-stress condition

2.2 耐醋酸性能優(yōu)良乳酸菌的篩選

2.2.1 耐醋酸性能優(yōu)良乳酸菌的初篩

8株乳酸菌分離株在2%（V/V）醋酸下的生長性能見圖2。由圖2（a）可知，8株乳酸菌分離株在2%（V/V）醋酸下沒有明顯的延滯期，分離株AAF3-3、AAF3-1、AAF3-5不僅具有比其他5個(gè)分離株更快的生長速率，而且具有更長的對(duì)數(shù)期（2～12 h）。分離株AAF3-3、AAF3-1、AAF3-5培養(yǎng)12 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，菌液OD600nm值分別達(dá)到了0.46、0.37、0.33，而其他5個(gè)分離株則在培養(yǎng)5h后生長趨于平緩，菌液OD600nm值在0.22～0.28之間波動(dòng)。為更好的反映菌株在醋酸壓力條件下的生長情況，進(jìn)一步選取上述8株菌培養(yǎng)24 h后的菌液進(jìn)行活菌數(shù)測定并計(jì)算相對(duì)活菌數(shù)。由圖2（b）可知，AAF3-3、AAF3-5、AAF3-1的相對(duì)活菌數(shù)較高，分別為0.19%、0.18%、0.13%，而分離株AAF7-5、AAF3-2、AAF7-1、AAF7-2、AAF7-4的相對(duì)活菌數(shù)較低（均＜0.05%）。綜合上述結(jié)果，選取AAF3-1、AAF3-3、AAF3-5用于后續(xù)復(fù)篩。

圖2 8株乳酸菌株在2%（V/V）醋酸下的生長曲線（a）和24 h時(shí)的相對(duì)活菌數(shù)（b）Fig.2 Growth curves(a)and relative number of viable bacteria at 24 h(b)of eight lactic acid bacteria under 2%(V/V)acetic acid stress

2.2.2耐醋酸性能優(yōu)良乳酸菌的復(fù)篩

醋酸發(fā)酵3 d的總酸度為5.24 g/100 mL，體積比約為3%（V/V）醋酸。因此，進(jìn)一步考察了AAF3-1、AAF3-3、AAF3-5三個(gè)菌株在3%（V/V）醋酸壓力的生長性能見圖3。由圖3（a）可知，AAF3-3培養(yǎng)6 h后菌液的相對(duì)活菌數(shù)為0.26%，比AAF3-1（0.066%）和AAF3-5（0.14%）分別高出315.01%和98.65%。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，三個(gè)菌株的相對(duì)活菌數(shù)均明顯下降，其中，AAF3-1和AAF3-5的相對(duì)活菌數(shù)分別在培養(yǎng)12h和24h后下降為0，而AAF3-3在培養(yǎng)24 h仍保持0.001%的相對(duì)活菌數(shù)。由圖3（b）可知，5%（V/V）醋酸沖擊30 min后，AAF3-3的相對(duì)活菌數(shù)為10.67%，相比AAF3-1（0.016%）和AAF3-5（0.29%）分別高出651.93倍和34.92倍。隨著沖擊時(shí)間的延長，3個(gè)菌株的相對(duì)活菌數(shù)明顯下降，其中乳酸片球菌AAF3-3在90 min時(shí)仍保持將近0.08%的相對(duì)活菌數(shù)，而AAF3-1、AAF3-5的相對(duì)活菌數(shù)在沖擊60 min和90 min后分別變?yōu)?。因此，3個(gè)乳酸菌分離株的耐醋酸性能由高到低排序?yàn)锳AF3-3＞AAF3-5＞AAF3-1，選取乳酸片球菌AAF3-3作為后續(xù)研究對(duì)象。

圖3 三個(gè)乳酸菌分離株在3%（V/V）醋酸壓力下的生長性能（a）和5%（V/V）醋酸沖擊下的存活性能（b）Fig.3 Growth performance of three lactic acid isolates under 3%(V/V)acetic acid stress(a)and survival performance shocked by 5%(V/V)acetic acid stress(b)

2.3 乳酸片球菌AAF3-3對(duì)其他酸壓力的耐受性能

考慮到乳酸片球菌AF3-3是來源于復(fù)雜酸環(huán)境的食醋固態(tài)釀造過程，因此，進(jìn)一步考察了該菌株對(duì)其他酸壓力的耐受性能。

2.3.1 乳酸片球菌AAF3-3在乳酸壓力下的耐酸性能

由圖4（a）可知，菌株AAF3-3在1%（V/V）乳酸下的相對(duì)活菌數(shù)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長呈現(xiàn)增長趨勢，其中，培養(yǎng)6 h的相對(duì)活菌數(shù)為5.61%，培養(yǎng)24 h后增長為9.01%，這說明，AAF3-3在1%的乳酸壓力下保持良好的生長性能。當(dāng)乳酸濃度提高至2%（V/V），培養(yǎng)6 h和12 h后的AAF3-3菌液的相對(duì)活菌數(shù)為0.51%和0.11%，而24 h后下降為0。由圖4（b）可知，AAF3-3在3%（V/V）乳酸下沖擊30 min后的相對(duì)活菌數(shù)為29.84%。隨著沖擊時(shí)間的延長，其相對(duì)活菌數(shù)明顯下降，當(dāng)沖擊120 min時(shí)，相對(duì)活菌數(shù)僅為0.0005%。這些結(jié)果表明，乳酸片球菌AAF3-3對(duì)2%（V/V）和3%（V/V）的乳酸壓力表現(xiàn)出一定的耐受性。

圖4 乳酸片球菌AAF3-3在1%、2%（V/V）乳酸壓力下的生長性能（a）和3%（V/V）乳酸沖擊下的存活性能（b）Fig.4 Growth performance of P.acidilactici AAF3-3 under 1%,2%(V/V)lactic acid stress(a)and survival performance shocked by 3%(V/V)lactic acid stress(b)

2.3.2乳酸片球菌AAF3-3在鹽酸壓力下的耐酸性能

由圖5（a）可知，菌株AAF3-3在pH 5.0下的相對(duì)活菌數(shù)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢。這說明AAF3-3在pH 5.0的酸壓力下保持一定的生長能力。當(dāng)pH降至4.0以下時(shí)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，菌株的相對(duì)活菌數(shù)呈現(xiàn)下降趨勢。其中pH 3.5條件下，相對(duì)活菌數(shù)由6 h的1.08%急劇下降為24 h的0.32%，下降了237.50%。pH 3.0條件下，培養(yǎng)6 h后菌液相對(duì)活菌數(shù)為0.63%，而培養(yǎng)24h后降為0.0013%。這說明pH＜4.0時(shí)，鹽酸對(duì)菌株產(chǎn)生一定的毒害作用。圖5（b）表明，AAF3-3在pH 2.5條件下沖擊30 min時(shí)相對(duì)活菌數(shù)仍保持在25.98%，而后相對(duì)活菌數(shù)急劇下降，120 min時(shí)僅為0.005 9%。因此，AAF3-3在pH 3.0和pH 2.5的鹽酸壓力下表現(xiàn)出一定的耐受性。

DONATIEN K等[24]對(duì)來源于非洲baobab樹種子發(fā)酵液中的乳酸片球菌進(jìn)行了分離純化，并通過檢測菌株在pH 2.5條件下沖擊不同時(shí)間后的活菌數(shù)對(duì)其耐酸性能進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，野生型乳酸片球菌菌株L87在pH 2.5條件下呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢，對(duì)數(shù)活菌數(shù)由0 h的6.20逐漸增長至2 h的6.69，之后不再增長，而分離菌株L169在pH 2.5條件下的生長則受到了抑制，其對(duì)數(shù)活菌數(shù)由0 h的6.32下降至4 h的6.08。這些結(jié)果和本論文的結(jié)果共同說明，乳酸片球菌對(duì)酸壓力表現(xiàn)出一定的耐受性能。

圖5 乳酸片球菌AAF3-3在pH 5.0、4.0、3.5、3.0（鹽酸調(diào)節(jié)）下的生長性能（a）和pH 2.5（鹽酸調(diào)節(jié)）下的存活性能（b）Fig.5 Growth performance ofP.acidilactici AAF3-3 under pH 5.0,4.0,3.5,3.0(adjusted by hydrochloric acid)(a)and survival performance under pH 2.5(adjusted by hydrochloric acid)(b)

2.4 acc在不同種類酸壓力下的轉(zhuǎn)錄水平

課題前期的蛋白組學(xué)工作中，發(fā)現(xiàn)在醋酸、乳酸、鹽酸三種壓力高濃度沖擊后，乳酸片球菌AAF3-3中乙酰輔酶A羧化酶（編碼基因?yàn)閍cc）的蛋白表達(dá)水平較無壓力條件下均出現(xiàn)了顯著上調(diào)，分別為1.26、2.35和2.45倍。乙酰輔酶A羧化酶是催化“乙酰輔酶A+ATP+HCO3-→丙二酰輔酶A+ADP+Pi”反應(yīng)的生物素酶。此反應(yīng)制約著脂肪酸合成第一階段的速度，是脂肪酸合成的限速酶[25]，其底物乙酰輔酶A和產(chǎn)物丙二酰輔酶A也分別在丙酮酸代謝和三羧酸循環(huán)中扮演重要作用。利用qRT-PCR的方法對(duì)acc基因在三種酸壓力下的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了檢測，結(jié)果見圖6。由圖6可知，acc基因在5%（V/V）醋酸、3%（V/V）乳酸、pH 2.5（鹽酸）三種壓力高濃度沖擊下的轉(zhuǎn)錄水平均出現(xiàn)了顯著上調(diào)，分別是菌株在無壓力條件下轉(zhuǎn)錄水平的4.32倍、2.02倍和1.13倍，這一結(jié)果與蛋白組學(xué)結(jié)果一致，也暗示了該基因在菌株的耐酸機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。

圖6 基因acc在三種酸壓力沖擊下的轉(zhuǎn)錄水平Fig.6 Transcription level ofaccafter shocked by high concentration acid stresses

2.5 過表達(dá)菌株P(guān).acidilactici/pNZ8148-acc的構(gòu)建

如圖7（a）所示，重組質(zhì)粒PCR在770 bp左右出現(xiàn)條帶，與基因acc的理論大小768bp相符合。如圖7（b）所示，質(zhì)粒單酶切在4000bp左右出現(xiàn)條帶，相比空質(zhì)粒pNZ8148（3167bp）高出約770 bp，與目的基因acc（768 bp）理論大小相符。測序結(jié)果進(jìn)一步證明，重組質(zhì)粒pNZ8148-acc構(gòu)建成功。將驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入乳酸片球菌菌株中，通過質(zhì)粒PCR和Hind III單酶切進(jìn)一步驗(yàn)證過表達(dá)菌株P(guān).acidilactici/pNZ8148-acc構(gòu)建成功。

圖7 重組質(zhì)粒PCR（a）和Hind III單酶切（b）驗(yàn)證Fig.7 Identification of PCR(a)and single restriction enzyme Hind III digestion(b)of recombinant plasmid

2.6 過表達(dá)菌株P(guān).acidilactici/pNZ8148-acc的耐酸性能

對(duì)上述構(gòu)建成功的過表達(dá)菌株在適當(dāng)酸壓力下（包括3%（V/V）醋酸、2%（V/V）乳酸、pH 3.0（鹽酸調(diào)節(jié)））的生長性能和高濃度酸沖擊下（包括5%（V/V）醋酸，3%（V/V）乳酸和pH 2.5（鹽酸調(diào)節(jié)））的存活性能進(jìn)行分析。由圖8（a）可知，過表達(dá)菌株在3%（V/V）醋酸下培養(yǎng)6 h和24 h的相對(duì)活菌數(shù)分別為12.93%和0.04%，相比對(duì)照菌株分別提高了46.10%和24倍。如圖9（a）所示，過表達(dá)菌株經(jīng)5%（V/V）醋酸沖擊90 min后及沖擊180 min后的活菌數(shù)仍分別保持在104、103數(shù)量級(jí)，而對(duì)照菌株則分別保持在102數(shù)量級(jí)及沒有明顯存活。這些結(jié)果表明，acc基因?qū)θ樗崞蚓拇姿崮褪苄跃哂姓蛘{(diào)控作用。

圖8 過表達(dá)菌株P(guān).acidilactici/pNZ8148-acc在3%（V/V）醋酸壓力（a）、2%（V/V）乳酸壓力下（b）以及pH 3.0（鹽酸調(diào)節(jié)）下的生長性能（c）Fig.8 Growth performance ofP.acidilactici/pNZ8148-accunder 3%(V/V)acetic acid stress(a),2%(V/V)lactic acid stress(b)and pH 3.0(adjusted by hydrochloric acid)(c)

圖9 過表達(dá)菌株P(guān).acidilactici/pNZ8148-acc在3%（V/V）醋酸壓力（a）、2%（V/V）乳酸壓力下（b）以及pH 3.0（鹽酸調(diào)節(jié)）下的存活性能（c）Fig.9 Survival performance ofP.acidilactici/pNZ8148-accunder 3%(V/V)acetic acid stress(a),2%(V/V)lactic acid stress(b)and pH 3.0(adjusted by hydrochloric acid)(c)

由圖8（b）和圖9（b）可知，2%（V/V）乳酸壓力下，P.acidilactici/pNZ8148-acc培養(yǎng)6 h時(shí)的生長性能不及對(duì)照菌株，推測可能是還未適應(yīng)該環(huán)境。而培養(yǎng)24 h后的相對(duì)活菌數(shù)為0.46%，比對(duì)照菌株（0.17%）高出170.59%。在3%（V/V）乳酸下，隨著沖擊時(shí)間的延長，P.acidilactici/pNZ8148-acc在90 min后活菌數(shù)比對(duì)照菌株高出1個(gè)數(shù)量級(jí)，沖擊時(shí)間延長到180 min后，過表達(dá)菌株仍能保持103的活菌數(shù)，而對(duì)照菌株的菌落數(shù)極少。這表明，基因acc可以明顯改善菌株對(duì)乳酸壓力的耐受性。

由圖8（c）可知，P.acidilactici/pNZ8148-acc在pH3.0下培養(yǎng)6 h時(shí)與對(duì)照菌株生長性能無明顯差別，培養(yǎng)24 h的相對(duì)活菌數(shù)（6.61%）較對(duì)照菌株（1.47%）高出349.66%。由圖9（c）可知，pH 2.5下沖擊90 min后，P.acidilactici/pNZ8148-acc無活菌數(shù)，而對(duì)照菌株仍保持在103數(shù)量級(jí)。沖擊180 min后P.acidilactici/pNZ8148-acc與對(duì)照菌株均未有存活。表明基因acc可以在一定pH范圍內(nèi)改善菌株對(duì)鹽酸壓力的耐受性。

綜上所述，acc基因的過表達(dá)可以顯著改善菌株P(guān).acidilactici/pNZ8148-acc在醋酸、乳酸、鹽酸壓力下的耐受性能，這證明acc基因是能夠影響乳酸片球菌多種耐酸性能的關(guān)鍵基因。XIAN M等[26]通過acc基因的過表達(dá)和敲除發(fā)現(xiàn)，該基因在大腸桿菌對(duì)鹽（6%NaCl）和堿壓力（pH9）耐受實(shí)驗(yàn)中發(fā)揮著重要的正向調(diào)控作用。本論文的結(jié)果與該基因提高大腸桿菌耐受性能的結(jié)果是相一致的，這是acc基因在乳酸菌耐酸性能中發(fā)揮重要作用的首次報(bào)道。

3 結(jié)論

本研究從山西老陳醋釀造過程中醋酸發(fā)酵階段篩選出一株對(duì)醋酸具有一定耐受性的乳酸片球菌AAF3-3，在培養(yǎng)6 h和24 h后菌液的相對(duì)活菌數(shù)分別為0.26%和0.001%。該菌株對(duì)其他的酸壓力（如乳酸、鹽酸）也表現(xiàn)出耐受性，其中在3%（V/V）乳酸和pH 2.5（鹽酸調(diào)節(jié)）沖擊120 min后相對(duì)活菌數(shù)分別為0.000 5%和0.005 9%。以該菌株為對(duì)象，通過轉(zhuǎn)錄水平分析、過表達(dá)菌株構(gòu)建及其耐酸性能發(fā)現(xiàn)，基因acc在醋酸、乳酸、鹽酸下轉(zhuǎn)錄水平均發(fā)生明顯上調(diào)。乙酰輔酶A羧化酶對(duì)菌株在多種酸壓力（醋酸、乳酸、鹽酸）下的耐受性能具有重要的正向調(diào)控作用，其中3%（V/V）乳酸沖擊180 min后，過表達(dá)菌株的存活數(shù)仍能達(dá)到104以上，而對(duì)照菌株沒有存活。研究成果為乳酸片球菌耐酸機(jī)制的研究和耐酸性能的調(diào)控提供了重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論支持。