范昊安，薛淑龍，王高堅，陳小偉，方 晟，沙如意，毛建衛(wèi)*

（1.浙江省農產品化學與生物加工技術重點實驗室，浙江 杭州 310023；2.浙江省農業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江 杭州 310023；3.浙江科技學院 生物與化學工程學院，浙江 杭州 310023；4.紹興文理學院 元培學院，浙江 紹興 312000；5.浙江工業(yè)職業(yè)技術學院，浙江 紹興 312000）

食用植物酵素[1]是以一種或多種新鮮蔬菜、水果和谷豆類、海藻類、食藥兩用本草類等食材為原料，加（或不加）糖類物質，經多種有益菌通過較長時間發(fā)酵而生產的功能性微生物發(fā)酵產品，擁有豐富的次生代謝產物、植物本身營養(yǎng)成分和益生菌等功能性成分，特別是富含小分子功能成分，研究表明該類產品具有抗衰老、抗菌消炎、凈化血液、增強機體免疫能力及解毒抗癌等多種保健功能[2-4]。由于酵素的發(fā)酵過程屬于復雜的間歇性過程，其發(fā)酵周期的控制需要結合期間多種微生物的基質代謝與產物生成情況綜合考慮[5-6]。研究發(fā)酵過程中代謝產物及其活性的變化規(guī)律，不僅有利于酵素產品的質量控制，還可為其發(fā)酵終點的確定提供理論支撐。

紫蘇葉為唇形科植物紫蘇（Perilla frutescens L.Britt.）的干燥葉（或帶嫩枝）。具有解表散寒、行氣和胃之功效，用于風寒感冒，咳嗽嘔惡，妊娠嘔吐，魚蟹中毒[7]。紫蘇葉中富含多種營養(yǎng)成分以及多酚、黃酮等多種生物活性物質[8]，具有良好的抗氧化、抗癌、抗炎、抗菌、抗過敏、保肝、降血脂、調節(jié)血糖等藥理作用[9-12]。目前，以紫蘇葉為原料加工制成的保健食品較少，僅有紫蘇茶[13]與紫蘇果酒[14]等。通過微生物發(fā)酵制備紫蘇葉酵素，可以在保留紫蘇葉本身藥用活性成分的基礎上，進一步增強其營養(yǎng)價值及保健功效，對豐富紫蘇葉的加工形式，實現(xiàn)其高值化利用具有重大意義。

目前尚未有關于紫蘇葉酵素的相關研究報道，故本試驗以紫蘇葉為原料，探究紫蘇葉酵素發(fā)酵過程中有機酸、總糖、總酚、乙醇等代謝產物的變化以及1,1-二苯基-2-苦苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、羥基自由基清除率等抗氧化活性的變化，以期為紫蘇葉綜合開發(fā)提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗材料

紫蘇葉：采自浙江省農副產品加工重點實驗室植物園；酵液、糖漿：由浙江省農副產品加工重點實驗室提供。

1.1.2 試劑

DPPH：梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；福林酚、蒽酮、三羥甲基氨基甲烷（Tris（hydroxymethyl）methyl aminomethane，Tris）、水楊酸鈉、FeSO4、H2O2（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。L-乳酸（純度≥98%）、醋酸（純度≥99.9%）、無水乙醇（優(yōu)級純）、叔丁醇（純度≥99.5%）：上海阿拉丁化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

20 L不銹鋼（型號：316L）發(fā)酵罐：浙江省農產品化學與生物加工技術重點實驗室提供；PTX-FA210型電子天平：福州華志科學儀器有限公司；Allegra X-12R離心機：貝克曼庫爾特有限公司；PHS-3C型精密酸度計：杭州齊威儀器有限公司；KQ-300E型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；UV-5500PC型紫外分光光度計：上海市元析儀器有限公司；XMTD-204數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋：常州諾基儀器有限公司；Waters e2695高效液相色譜（配備Waters 2998二極管陣列紫外檢測器）：美國沃特世公司；GC-2010氣相色譜：日本島津公司；HSS86.50型頂空進樣器：意大利DANI公司；SpectraMax iD5多功能酶標儀：美國美谷分子儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 紫蘇葉酵素的制備

用無菌水沖洗新鮮摘取的紫蘇葉，置于陰暗處晾干，粗粉碎，將紫蘇葉和糖漿按質量比3∶4加入高壓蒸汽滅菌過的20 L不銹鋼發(fā)酵罐中，加入10%體積分數(shù)的酵液（菌體濃度：1×105CFU/mL）。于室溫（20±5）℃條件下發(fā)酵，定期取樣，將樣品于6 000 r/min條件下離心10 min，取上清液保存于-80℃超低溫冰箱中，待測。

1.3.2 總酚含量測定

采用福林酚法[15]測定紫蘇葉酵素中總酚含量。取5 μL酵素離心液，加純水至0.5mL，加入體積分數(shù)為10%的福林酚溶液2.5mL，常溫避光靜置反應3min后加入75g/LNa2CO3溶液2 mL，混勻。于25℃反應1 h，以0.5 mL水按上述方法進行空白調零，在波長765 nm處測定吸光度值。

1.3.3 pH值測定

參照GB 10468—1989《水果和蔬菜產品pH值的測定方法》[16]，使用精密pH計直接測定酵素樣品pH值。

1.3.4 可滴定酸含量測定

可滴定酸含量的測定方法參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定方法》[17]，并加以調整：取酵素樣品1 mL，用去離子水定容至50 mL，取10 mL稀釋液于錐形瓶中，以0.1g/L酚酞試劑為指示劑，記錄消耗0.002mol/L的氫氧化鈉溶液滴定體積，測定結果以蘋果酸質量濃度（g/100mL）計。

1.3.5 有機酸含量測定[18]

樣品配制：取離心后的紫蘇葉酵素上清液200 μL，使用0.01 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液（pH 2.7）稀釋5倍，經過0.22 μm微孔濾膜過濾，待測。

標品配制：配制乳酸和醋酸的混合標準溶液，其質量濃度均為1 mg/mL，經過0.22 μm微孔濾膜過濾。

檢測條件：色譜柱為AgilentTCC18柱（250mm×4.6mm，5 μm）；流動相為甲醇∶磷酸二氫鉀緩沖液（pH 2.7）=2∶98；流速1.0mL/min；柱溫25℃；進樣體積10μL；檢測波長210nm。檢測器為二極管陣列檢測器。

1.3.6 總糖含量測定

采用蒽酮-硫酸法[19]測定紫蘇葉酵素中總糖含量。將樣品液用純水稀釋5 000倍，取稀釋液200 μL，置于冰浴中，加入800 μL 2 mg/mL的蒽酮-硫酸溶液，混合均勻后置于沸水浴中反應10 min，冰浴中冷卻至室溫后，使用酶標儀在波長620 nm處測定其吸光度值。并配制質量濃度梯度為20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL、120 μg/mL、160 μg/mL的葡萄糖溶液，按照上述步驟繪制標準曲線。

1.3.7 乙醇含量測定[20]

樣品配制：取離心后紫蘇葉酵素上清液990 μL，加入10 μL叔丁醇作為內標，待測。

標準曲線的繪制：分別配制體積分數(shù)為0.1%、0.2%、0.5%、1.0%、2.0%、4.0%、5.0%的乙醇溶液，上述溶液中均含有體積分數(shù)1%的叔丁醇作為內標，待測。

自動頂空條件：爐溫85℃，平衡時間40 min；進樣閥溫度105℃；傳輸線溫度110℃。

氣相色譜條件：RTX-5毛細管柱（30m×0.25mm×0.25μm）；柱溫40℃，平衡時間3.0 min，10℃/min升溫至180℃，保溫5 min；進樣口/氣化室溫度200 ℃；分流比30∶1；檢測器溫度250℃。

1.3.8 DPPH自由基清除能力測定[21]

取5 μL離心后紫蘇葉酵素上清液，加水稀釋至2 mL，加入0.1 mmol/L DPPH-甲醇溶液4 mL，再加入50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH7.4）450 μL，25℃恒溫水浴反應30 min，以純水為參比溶液，于波長517 nm處測定吸光度值。

式中：A0為空白對照吸光度值；A1為樣品吸光度值；A2為樣品本底管吸光度值。

1.3.9 羥自由基清除能力測定[22]

取250μL離心后紫蘇葉酵素上清液，加水稀釋至2mL，加入6mmol/LH2O2溶液1.4mL，再加入20mmol/L水楊酸鈉0.6 mL和1.5 mmol/L FeSO42 mL，混勻，37℃恒溫水浴反應1 h。以純水為參比溶液，于波長510 nm處測定吸光度值。

式中：A0為空白對照吸光度值；A1為樣品吸光度值；A2為樣品本底管吸光度值。

1.3.10 綜合評價指標分析

通過主成分分析法進行多指標綜合評價，以各主成分所對應的特征值除以所提取主成分的特征值之和，再線性加權求和得到綜合評價指標（composite evaluation index，CEI）。

式中：λ1為主成分1的特征值；λ2為主成分2的特征值；F1為主成分1的因子得分；F2為主成分2的因子得分。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵過程中總酚含量的變化

紫蘇葉中的酚類物質具有較強的抗氧化活性[23]，紫蘇葉酵素發(fā)酵過程中總酚含量變化如圖1所示。

圖1 紫蘇葉酵素發(fā)酵過程中總酚含量的變化Fig.1 Changes of total phenolic content during the Perilla leaves jiaosu fermentation

由圖1可知，隨著發(fā)酵時間的延長，總酚含量呈現(xiàn)先波動上升后下降的趨勢，于發(fā)酵63d時達到最大值3.96mg/mL。研究表明，蘋果酵素、葡萄酵素的總酚含量分別為259.4mg/L、2.31 mg/mL[3，6]，本實驗紫蘇葉酵素總酚含量較高，可能是由于物料本身及其自身菌種的差異導致的。GAO K等[24]研究發(fā)現(xiàn)，微生物發(fā)酵可將類黃酮物質轉化為酚酸產物，致使總酚含量上升。過量的多酚類物質會抑制益生菌的生長，同時體系自身的微生物也會影響多酚類物質的生物功能，故而紫蘇葉酵素中的優(yōu)勢菌種可能降解部分酚類物質，從而維持酚類物質含量平衡，導致酵素中總酚含量下降[25]。

2.2 發(fā)酵過程中pH值與可滴定酸含量的變化

pH值是酵素發(fā)酵程度的一個代表性的重要指標，總酸是反映酵素發(fā)酵過程狀況的理化指標，同時也在一定程度上反映了微生物代謝情況。紫蘇葉酵素在發(fā)酵過程中pH值和可滴定酸的變化如圖2所示。

圖2 紫蘇葉酵素發(fā)酵過程中pH值與可滴定酸含量的變化Fig.2 Changes of pH value,total titratable acidity during the Perilla leaves jiaosu fermentation

由圖2可知，隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵pH值由4.67持續(xù)下降至3.91?？傻味ㄋ峥傮w呈現(xiàn)上升趨勢。前49 d上升速率較快，后期趨于平緩，最終達到0.918 g/100 mL（以蘋果酸計）。發(fā)酵過程中紫蘇葉中的有機酸的溶出及醋酸菌等大量微生物代謝使得乙醇轉化為乳酸、醋酸等有機酸[26]，導致酵素中可滴定酸含量的快速上升。為更好地解釋發(fā)酵過程中pH值與可滴定酸含量的變化趨勢，本實驗對乳酸、醋酸的含量變化進行了跟蹤檢測。

2.3 發(fā)酵過程中乳酸、醋酸含量的變化

酵素中存在的最常見的3種菌種為酵母菌、醋酸菌和乳酸菌[1]。其代謝產物乳酸、醋酸等有機酸的含量變化為酵素品質的重要指標之一[27]。乳酸、醋酸標品的標準曲線見表1。由表1可知，乳酸、醋酸標準曲線方程具有良好線性相關性，相關系數(shù)R2均＞0.999 9。

表1 有機酸標準曲線Table1 Standard curves of organic acids

紫蘇葉酵素在發(fā)酵過程中乳酸、醋酸含量變化如圖3所示。由圖3可知，隨發(fā)酵時間的延長，乳酸、醋酸含量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，分別于發(fā)酵49 d、105 d到達最大值（4.82 mg/mL、0.90 mg/mL）。發(fā)酵前28 d，醋酸菌等微生物利用葡萄糖、果糖代謝生成醋酸等物質，使得乳酸、醋酸含量快速增加[28]；91 d后乳酸、醋酸含量緩慢下降可能是因為酵母菌等菌種在發(fā)酵后期會降解部分有機酸，導致乳酸、醋酸含量有所下降[29]。結合圖2，醋酸、乳酸含量在前28 d的上升導致了可滴定酸的同期上升以及pH值的快速下降。

圖3 紫蘇葉酵素發(fā)酵過程中乳酸、醋酸含量的變化Fig.3 Changes of lactic acid,acetic acid production during the Perilla leaves jiaosu fermentation

2.4 發(fā)酵過程中總糖含量的變化

糖作為酵素發(fā)酵過程中微生物利用的主要碳源，其含量變化是研究紫蘇葉酵素發(fā)酵過程中微生物代謝的核心指標之一。紫蘇葉酵素發(fā)酵過程中，總糖含量隨發(fā)酵時間變化結果如圖4所示。由圖4可知，隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵液中總糖含量先快速下降，而后逐漸升高直至平緩，且在發(fā)酵21 d時達到最低值636.33 mg/mL。前期的變化趨勢可能是由于發(fā)酵過程中總糖被水解成葡萄糖和果糖并被乳酸菌等微生物利用消耗[30]，結合圖3可知，前期消耗的總糖有可能被轉化為乳酸，導致總糖含量下降以及乳酸含量的上升。發(fā)酵21d后，總糖含量的波動可能是由于發(fā)酵過程中乳酸菌等菌種逐漸利用糖類物質導致的。

圖4 紫蘇葉酵素發(fā)酵過程中總糖含量的變化Fig.4 Changes of total sugar concentration during the Perilla leaves jiaosu fermentation

2.5 發(fā)酵過程中乙醇含量的變化

乙醇是一種典型的初級代謝產物，其含量變化與酵母菌緊密相關，故而將其作為研究紫蘇葉酵素發(fā)酵過程中微生物代謝的核心指標之一[31]。紫蘇葉酵素在發(fā)酵過程中乙醇含量的變化如圖5所示。由圖5可知，紫蘇葉酵素在發(fā)酵過程中乙醇含量的變化呈先增長后下降趨勢，并于發(fā)酵105 d達到最高值1.66%vol。D'AMORE T等[32]研究表明，高糖滲透壓條件會導致酵母菌細胞內乙醇濃度的增加，從而抑制其生長和發(fā)酵速率，導致紫蘇葉酵素前21天乙醇含量增長速率緩慢。發(fā)酵21天總糖含量降至最低，酵母菌發(fā)酵進入旺盛期，酵母菌代謝生成乙醇含量速率與前期降糖速率具有一致性。發(fā)酵28 d后乙醇含量的增長速率減緩可能是由于部分乙醇被醋酸菌利用轉化為乙酸，但由于乙醇生成速率仍大于其消耗速率，故乙醇含量仍呈現(xiàn)上升趨勢。發(fā)酵105 d后乙醇含量降低可能是因為釀酒酵母與非釀酒酵母混合發(fā)酵引起了較好的降醇效果[33-34]。通過對乳酸、醋酸和乙醇含量變化的研究，可據此推斷紫蘇葉酵素中乳酸菌、酵母菌等微生物的生長、代謝情況，但具體微生物種類與菌落總數(shù)的變化有待進一步研究。

圖5 紫蘇葉酵素發(fā)酵過程中乙醇含量的變化Fig.5 Changes of ethanol content during the Perilla leaves jiaosu fermentation

2.6 發(fā)酵過程中DPPH自由基消除率的變化

圖6 紫蘇葉酵素發(fā)酵過程中DPPH自由基清除能力的變化Fig.6 Changes of DPPH free radical scavenging ability during the Perilla leaves jiaosu fermentation

不同發(fā)酵時間的紫蘇葉酵素DPPH自由基消除率變化如圖6所示。由圖6可知，發(fā)酵前63 d紫蘇葉酵素DPPH自由基消除率呈緩慢上升的趨勢，清除率達到最大值61.03%，隨后緩慢下降。郭曉青等[35]報道紫蘇葉提取物的DPPH自由基清除率明顯低于同濃度維生素C（vitamin C，VC），分析比較可得同等稀釋倍數(shù)下紫蘇葉酵素DPPH自由基清除能力遠大于紫蘇葉提取物，說明適當發(fā)酵可提高紫蘇葉的DPPH自由基清除能力。韋仕靜等[36]通過酵母菌、乳酸菌和醋酸桿菌復合發(fā)酵西蘭花酵素，并研究發(fā)現(xiàn)隨著發(fā)酵時間延長其DPPH自由基清除率快速上升后緩慢下降，這與紫蘇葉酵素趨勢相近。

2.7 發(fā)酵過程中羥基自由基消除率的變化

羥基自由基是一種較活潑的自由基，同時也是一種毒性最強的活性氧自由基[37]。會引起間充質干細胞以及脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）的氧化損傷，故其清除率是體現(xiàn)酵素抗氧化能力的重要指標之一[38]。不同發(fā)酵時間的紫蘇葉酵素羥基自由基消除率變化如圖7所示。由圖7可知，隨著發(fā)酵時間的延長，紫蘇葉酵素的羥基自由基清除率逐漸上升，于第91天達到最大值83.49%，相較發(fā)酵7 d的清除率增長了92.64%。發(fā)酵91 d后清除率變化趨于穩(wěn)定?？梢娺m當延長發(fā)酵時間同樣有利于提升紫蘇葉酵素羥基自由基的消除能力。肖翔等[39]研究發(fā)現(xiàn)，紫蘇葉提取物可提高發(fā)酵液的抗氧化活性，紫蘇葉自身活性成分可與微生物代謝產物相互作用，使得紫蘇葉酵素羥基自由基清除率呈現(xiàn)上升趨勢。GU L等[40]通過薄層色譜法（thin-layer chromatography，TLC）自顯影等技術鑒定得出紫蘇中的迷迭香酸與木犀草素等多酚類物質發(fā)揮了主要的清除羥基自由基作用。

圖7 紫蘇葉酵素發(fā)酵過程中羥自由基清除能力的變化Fig.7 Changes of hydroxyl free radical scavenging ability during the Perilla leaves jiaosu fermentation

2.8 相關性分析

紫蘇葉酵素的總酚、pH值、可滴定酸、乳酸、醋酸、乙醇、總糖、DPPH自由基消除率、羥基自由基消除率進行相關性分析后的結果見表2。由表2可知，總酚與DPPH自由基消除率具有顯著的正相關性（P＜0.01），pH值、可滴定酸、乳酸、醋酸與羥基自由基消除率有顯著的正相關性（P＜0.01），可見紫蘇葉酵素中的多酚類物質與有機酸均具有一定的抗氧化活性[4]。乙醇與乳酸、醋酸呈現(xiàn)良好的相關性（P＜0.05），與可滴定酸、pH呈現(xiàn)顯著的相關性（P＜0.01），這與發(fā)酵過程中微生物利用乙醇代謝成有機酸有關。

表2 紫蘇葉酵素發(fā)酵過程中各參數(shù)相關性Table 2 Correlation of various parameters during the Perilla leaves jiaosu fermentation

2.9 主成分分析

由相關性分析可知，紫蘇葉酵素各指標變量間存在信息冗余，為了更好地研究紫蘇葉酵素發(fā)酵過程中代謝產物與抗氧化活性等綜合指標信息，對上述參數(shù)進行降維處理，即主成分分析。

紫蘇葉酵素主成分的初始特征值及指標變化對主成分的累積貢獻率見表3。由表3可知，以特征值1.0為納入標準，從影響紫蘇葉酵素的9種變量指標中提取出2個主成分。紫蘇葉酵素的第1主成分（principal component 1，PC1）的方差貢獻率為58.903%，第2主成分的方差貢獻率為27.509%，前2個主成分的累積方差貢獻率高達86.413%，說明前2個主成分能夠反映原始變量86.413%的信息，符合主成分分析的要求。因子載荷旋轉成分矩陣見表4。由表4可知，PC1反映了pH值、可滴定酸、乳酸、醋酸、乙醇和羥基自由基清除率的變異信息，PC2反映了總酚以及DPPH自由基清除率的變異信息。故通過降維獲得F1、F2來代替原先的9種變量指標，為后續(xù)綜合評價指標的計算奠定基礎。

表3 主成分的初始特征值及指標變量對主成分的累積貢獻率Table 3 Initial eigenvalues of the principal components and cumulative contribution rate of indicator variables to principal components

表4 因子載荷旋轉成分矩陣Table 4 Factor load rotation component matrix

不同發(fā)酵時間紫蘇葉酵素的CEI值見圖8。由圖8可知，發(fā)酵第63天CEI值最高為0.627，發(fā)酵第7天CEI值最低為-2.078。發(fā)酵前28 d，CEI值快速上升；在28～91 d時CEI值較為穩(wěn)定，稍有波動；發(fā)酵91 d之后，CEI值逐漸下降。因此可判斷適當延長發(fā)酵時間有利于紫蘇葉酵素的綜合評價指標的上升。

圖8 發(fā)酵過程中紫蘇葉酵素綜合評價的變化Fig.8 Charges of comprehensive evaluation indexes of Perilla leaves jiaosu during fermentation process

3 結論

根據綜合評價指標結果，本研究將發(fā)酵過程分為三個階段：發(fā)酵前期（0～28 d）、發(fā)酵中期（28～91 d）、發(fā)酵末期（91～147 d）。發(fā)酵前期，紫蘇葉酵素發(fā)酵過程中總酚含量、可滴定酸含量、乳酸含量、醋酸含量、乙醇含量、DPPH自由基清除率和羥自由基清除率呈上升趨勢；發(fā)酵中期，總糖與乳酸、醋酸含量趨于穩(wěn)定，乙醇含量、可滴定酸、羥自由基清除率、總酚含量和DPPH自由基清除率緩慢上升且后兩者已于發(fā)酵63 d出現(xiàn)下降趨勢；發(fā)酵末期，紫蘇葉酵素中總酚、乳酸、醋酸等生物活性物質含量開始下降，抗氧化活性呈現(xiàn)輕微減弱趨勢。綜合考慮時間成本與CEI值，發(fā)酵至63d時CEI值達到最大，且發(fā)酵末期CEI值逐漸下降，故基本確定紫蘇葉酵素的發(fā)酵終點為63 d。