李攀陽 王凌霄 高麗 趙婷婷 宋爽

【摘 要】為進一步提高我國心血管疾病的治療效果和研究效果，醫(yī)學界已經(jīng)加強了對心肌細胞的培養(yǎng)工作，也廣泛應(yīng)用在我國心血管疾病防治研究領(lǐng)域。對于相關(guān)科學研究進展來說，成功培養(yǎng)心肌細胞對其具有重要的影響，而且目前經(jīng)濟細胞培養(yǎng)的技術(shù)也得到了廣泛關(guān)注?，F(xiàn)如今，國內(nèi)外對于培養(yǎng)心肌細胞的研究比較多，本文主要針對心肌細胞培養(yǎng)進展進行了分析和探討。

【關(guān)鍵詞】心肌細胞;培養(yǎng);進展

在全世界范圍內(nèi)心臟疾病的發(fā)生率正呈逐年提高的趨勢，對于人類的生命健康產(chǎn)生了重要的威脅，目前根據(jù)心臟疾病的治療方式，主要根據(jù)心血管疾病的防治機制以及相關(guān)治療藥物進行了大量深入的研究和探討。在相關(guān)研究中以心肌細胞為主要實驗對象，目的是為了進行心肌細胞培育，這也是相關(guān)研究的主要目的。通過體外培養(yǎng)心肌細胞，能夠有效的維持心肌細胞原有的結(jié)構(gòu)功能以及特點，也能夠減少體液神經(jīng)等因素對其的影響，因此通過體外培養(yǎng)心肌細胞是一項比較理想的實驗方式。經(jīng)過國內(nèi)外相關(guān)學者的研究，進一步推進了心肌細胞培養(yǎng)技術(shù)的改良和更新，具體內(nèi)容如下。

1 心肌細胞培養(yǎng)方法

在進行新的細胞培養(yǎng)工作的時候，主要包括兩種細胞的培養(yǎng)，第一種為未成熟心肌細胞，也就是ECM，第二種是成熟心肌細胞，也就是ACM。未成熟心肌細胞具有部分增值能力，主要是通過電生理以及細胞膜離子通道等方面進行研究。而成熟心肌細胞主要為一種終末分化細胞，不具有增殖能力，所以在研究的時候，多采用單因素干預(yù)實驗來進行研究[1]。在心肌細胞培養(yǎng)的過程當中，會受到其他很多因素的影響，其中主要包括化學試劑污染，操作過程污染以及培養(yǎng)環(huán)境污染等，所以培養(yǎng)實驗的進行必須要保證在無菌條件下，而且要合適的對化學試劑進行選擇，才能夠保證心肌細胞有效培養(yǎng)。

1.1 未成熟心肌細胞培養(yǎng)

未成熟心肌細胞在培養(yǎng)的過程中主要分為四個階段，第一個階段為心肌細胞分離，在這個階段過程中要通過組織塊消化法或者酶消化法來對單個細胞進行分解，同時還要確保細胞能夠存活下來，相關(guān)研究調(diào)查報告表示說明，培養(yǎng)法細胞存活率大于87%，通過酶消化法來培養(yǎng)細胞的細胞存活率為（94.70±2.31）%[2]。第二個階段為心肌細胞收集，主要指的是對紅細胞以及壞死心肌細胞或者未消化的組織塊進行分離去除。第三個階段為心肌細胞培養(yǎng)，也就是在不同的培養(yǎng)液中根據(jù)不同密度的細胞進行培養(yǎng)。

1.1.1 心肌細胞分離

主要采用的方式為Simpon 經(jīng)典培養(yǎng)方法。首先積極研究對象的選擇，所有研究對象均為消毒乳鼠，由相關(guān)人員在超凈工作臺中對乳鼠的胸壁進行打開，并且要將心臟迅速取出，將其裝進具有冷緩沖液的培養(yǎng)皿中清洗，將多余的心房組織進行去除。相關(guān)的緩沖液主要包括即消毒乳鼠，在超凈工作臺上剪開胸壁，迅速夾取心臟，放入裝有預(yù)冷緩沖液的培養(yǎng)皿中清洗，剪去心房組織。常用緩沖液有PBS液、Ringer氏液、KRB 液、D-Hanks液等[3]。其中運用PBS液對心室肌組織進行漂洗，主要原因是由于該緩沖液中具有青霉素和鏈霉素雙抗，選擇的時候要保證緩沖液中具有1%雙抗。接下來再將紅細胞以及凝血塊清理干凈，將其剪成1mm的塊狀，再通過組織塊培養(yǎng)法或者酶消化法對組織進行分離?，F(xiàn)如今，臨床研究較為廣泛的采用酶消化法來進行心肌細胞的培養(yǎng)，該種方法主要是將組織塊內(nèi)加入酶消化液，能夠?qū)⑵浞稚閱蝹€細胞。而常用的消化酶主要有，透明質(zhì)酸酶，胰蛋白酶以及膠原酶。其中胰蛋白酶的消化強度比較大，但是對心肌細胞的破壞程度也比較大。相比之下膠原酶的作用比較溫和，對心肌細胞的損傷較小，可以通過水解細胞間膠原蛋白來達到分離組織的目的[4]。

1.1.2 心肌細胞收集

在進行心肌細胞收集的時候，可以將分離后的混合液進行靜止，達到分層的目的，最后將上層的液體去除，反復(fù)操作，直到混合液達到半透明的狀態(tài)。然后再將10～%20%的胎牛血清DMEM培養(yǎng)液注入到其中，并且達到終止消化的目的，同時再用不銹鋼篩網(wǎng)將其過濾，將離心機調(diào)制到4℃、800～1000r/min，并將相關(guān)液體送至到離心機中進行離心工作，時間持續(xù)5～10分鐘，結(jié)束之后將上層的液體清除，最后重懸心肌細胞。

1.1.3 心肌細胞純化

收集工作完成之后要對心肌細胞進行純化，主要是由于收集心肌細胞工作，并沒有保證所有細胞都是心肌細胞，其中還含有其它細胞，主要包括成纖維細胞F。所以在進行心肌細胞純化工作的時候，主要目的就是將F細胞進行去除。在進行心肌細胞純化工作的時候，主要有不同種類的方式，其中主要包括離心法，差速貼壁分離法，調(diào)節(jié)溫度法，無血清培養(yǎng)法以及化學試劑抑制法。其中離心法、調(diào)節(jié)溫度法以及無血清培養(yǎng)法，對于心肌細胞的收縮以及生長功能產(chǎn)生了一定的影響，所以在目前研究中很少應(yīng)用[5]。最常見的方法為化學試劑抑制法，主要是對F細胞的DNA以及蛋白質(zhì)合成產(chǎn)生一定的抑制作用，同時起到心肌細胞純化的效果。其中的化學試劑主要包括阿糖胞苷、5-溴脫氧尿嘧啶核苷、谷氨酰氨，最常使用的試劑為5-溴脫氧尿嘧啶核苷。

1.1.4 心肌細胞培養(yǎng)

最后工作就是對心肌細胞進行培養(yǎng)，在此期間進行心肌細胞貼壁，但是該工作困難程度比較高，主要是依靠纖維蛋白、I型、IV型膠原以及層粘蛋白對相關(guān)物質(zhì)進行貼壁。在工作之前要選擇相關(guān)的排行榜和培養(yǎng)瓶，并選擇一定的培養(yǎng)液，其中要保證培養(yǎng)液含有1%的雙抗，首先要選擇適當?shù)呐囵B(yǎng)液，對細胞懸液進行密度的調(diào)整，最后將調(diào)整好的細胞懸液置入培養(yǎng)液中，然后統(tǒng)一放置在37℃的培養(yǎng)箱中，在48小時之后進行培養(yǎng)液更換[6]。更換一次過后換為隔日更換培養(yǎng)液的頻率。在對心肌細胞進行接種工作的時候，如果密度過大會影響心肌細胞貼壁情況，細胞容易出現(xiàn)營養(yǎng)不良。然而如果密度過小，就會導(dǎo)致細胞的間隙比較大，細胞之間各個組織之間的交流溝通比較困難，容易縮短持續(xù)收縮時間，細胞容易自動凋亡。一般情況下可以將接種密度保持在5×104～5×106/m L。

1.2 ACM

在培養(yǎng)成熟心肌細胞的時候，與未成熟心肌細胞相比，難度比較大，所以要對心肌細胞進行較好效果的急性分離，保證細胞培養(yǎng)環(huán)境無菌，具體培養(yǎng)過程與未成熟心肌細胞培養(yǎng)過程相似，在分離和培養(yǎng)過程中，具有較為明顯的差別。

1.2.1 心肌細胞分離

首先要對重復(fù)心肌細胞進行分離所采用的方式主要包括三種，第一種為貼塊培養(yǎng)法，第二種為心肌細胞浸泡法，第三種為離體心臟生物酶灌注法。在利用心肌細胞浸泡法的時候主要是通過浸泡來使生物酶對心肌細胞產(chǎn)生機制作用，但是時間不均，對心肌細胞組織塊外表的破壞程度較大，所以很容易導(dǎo)致心肌細胞在培養(yǎng)過程中凋亡，所以，臨床研究很少使用該種方式。另外貼塊培養(yǎng)法所獲取的細胞較少，也很少使用。相比之下只有離心心臟生物酶灌注法的應(yīng)用比較廣泛，多采用Langendorff灌注法[7]，雖然操作比較困難，但是分離較為徹底，值得進一步研究。

1.2.2 心肌細胞培養(yǎng)

根據(jù)相關(guān)學者對心肌細胞培養(yǎng)的定義，主要分為兩種培養(yǎng)成熟心室肌細胞的方法，主要包括快速吸附法和去分化法。其中去分化法主要是對心肌細胞所保存于含血清的培養(yǎng)基中。但是細胞在培養(yǎng)基中會始終呈現(xiàn)著懸浮狀態(tài)，從而導(dǎo)致原有的柱狀形態(tài)逐漸變?yōu)榍蛐涡螒B(tài)。在細胞懸浮兩天至4天之后，細胞開始向別的方向進行突起發(fā)展。在拓展的過程當中，細胞超微結(jié)構(gòu)就表現(xiàn)出了去分化，但是這種方式培養(yǎng)出來的細胞在功能以及結(jié)構(gòu)方面與其他細胞有差別，所以現(xiàn)如今已經(jīng)很少使用。

2 結(jié)束語

總而言之，在體外進行心肌細胞的培養(yǎng)已經(jīng)是目前相關(guān)細胞培養(yǎng)的重要方式，通過對心肌細胞的培養(yǎng)，能夠有效的解決目前的心血管疾病，隨著相關(guān)技術(shù)的日益成熟，該項研究也在逐漸發(fā)展中。

參考文獻

[1]太原市羅塞塔石生物技術(shù)有限公司.一種心肌細胞和神經(jīng)細胞專用培養(yǎng)皿：中國，CN201810917581.3[P].2018-12-14.

[2]同濟大學.定向誘導(dǎo)大鼠胚胎干細胞分化為心肌細胞的培養(yǎng)基及方法：中國，CN201810497255.1[P].2018-09-14.

[3]重慶斯德姆生物技術(shù)有限公司.一種HCM心肌細胞培養(yǎng)液誘導(dǎo)iPSCs定向心肌分化的方法：中國，CN201711449694.7[P].2018-06-22.

[4]王佳南，林建安，杜苗苗.乳鼠心肌細胞原代培養(yǎng)方法的再改良[J].中外醫(yī)療，2018，37（33）：29-31.

[5]上海產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，上海人類基因組研究中心.用于促進干細胞來源心肌細胞成熟的無血清培養(yǎng)體系：中國，CN201810154071.5[P].2018-08-28.

[6]東南大學.用于三維培養(yǎng)細胞和原位實時監(jiān)測心肌組織的芯片裝置及其應(yīng)用：中國，CN201810224292.5[P].2018-08-07.

[7]中山大學附屬第一醫(yī)院.一種體外培養(yǎng)誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)型巨噬細胞用于心肌保護的方法：中國，CN201810200942.2[P].2018-08-14.