趙加玲，武舒佳，王紅，李芊璘，孫金帥，常蕾，戴二黑，武軍駐，張瑤,6，徐平

結(jié)核分枝桿菌H37Rv新基因克隆表達(dá)及純化

趙加玲1,3，武舒佳2,3，王紅3,4，李芊璘4，孫金帥3,5，常蕾3，戴二黑4，武軍駐2，張瑤3,6，徐平1,3

1 武漢大學(xué) 藥學(xué)院，湖北 武漢 430000 2 武漢大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430000 3 軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院生命組學(xué)研究所 國家蛋白質(zhì)科學(xué)中心 (北京) 北京蛋白質(zhì)組研究中心 蛋白質(zhì)組學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206 4 華北理工大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院和附屬石家莊市第五醫(yī)院，河北 唐山 063210 5 河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071000 6 中山大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275

是本課題組前期基于蛋白質(zhì)基因組學(xué)策略從結(jié)核分枝桿菌H37Rv中發(fā)現(xiàn)、鑒定的遺漏注釋基因。文中旨在建立結(jié)核分枝桿菌H37Rv漏注釋蛋白Rv2742的可溶性誘導(dǎo)表達(dá)、純化體系，為進(jìn)一步探索基因參與的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)構(gòu)建的pGEX-4T- 2-、pET-28a-、pET-32a-及pMAL-c2X-原核表達(dá)載體均無法實(shí)現(xiàn)目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。但經(jīng)密碼子優(yōu)化后，僅有pMAL-c2X-載體能夠?qū)崿F(xiàn)目的蛋白的可溶性誘導(dǎo)表達(dá)。此外，通過比較不同宿主菌、溫度及IPTG濃度對目的蛋白表達(dá)量的影響，發(fā)現(xiàn)目的蛋白在(DE3)中，16℃及0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)條件下表達(dá)量最高。直鏈淀粉樹脂 (Amylose resin) 親和層析柱純化獲得較純的產(chǎn)物，經(jīng)LC-MS/MS驗(yàn)證確認(rèn)是Rv2742融合蛋白肽段序列。成功獲得結(jié)核分枝桿菌H37Rv新基因的重組蛋白，可進(jìn)一步開展其潛在相互作用及免疫原性研究工作。

結(jié)核分枝桿菌，新基因，原核表達(dá)，親和純化

結(jié)核分枝桿菌(，MTB) 是引起人類結(jié)核病的病原菌[1]，可入侵多種組織、器官如胸膜、淋巴管、泌尿生殖器和骨關(guān)節(jié)炎等[2]，但以肺結(jié)核最為常見。據(jù)2018年WHO報(bào)道，2017年全球約有130 萬人死于該病，有1 000萬新病例發(fā)生。結(jié)核病仍然是傳染性疾病中的頭號殺手。我國依然是全球結(jié)核高發(fā)病、高耐藥、高HIV共感染負(fù)擔(dān)國家之一[3]。因此，有效的早期診斷新方法和及時治療是控制結(jié)核疫情蔓延的重要手段[4]。

目前，臨床常用的診斷方法包括涂片顯微鏡法、細(xì)菌培養(yǎng)法、核酸擴(kuò)增試驗(yàn)(如GeneXpert MTB/RIF)、結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)(TST)、γ干擾素釋放試驗(yàn)(IGRA) 等[5]，但存在涂片染色檢出率低、培養(yǎng)周期長、結(jié)核抗原特異性差和靈敏度不高等問題。其中，結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)因與卡介苗(BCG) 及非結(jié)核分枝桿菌之間存在交叉反應(yīng)而導(dǎo)致特異性不高[6]，而基于ESAT-6與CFP-10研發(fā)的T-SPOT試劑盒雖被廣泛地用于臨床結(jié)核菌感染的篩查，但仍存在“陽性不能確證，陰性不能排除”的弊端，不能有效區(qū)分活動性結(jié)核患者和潛伏感染者[7]。因此，尋找能夠有效區(qū)分活動性結(jié)核患者和潛伏感染者高特異性、靈敏性的有效抗原可解決結(jié)核臨床診斷的難題。

1998年，Cole等[8-9]基于全基因組鳥槍法和系統(tǒng)測序法，完成了結(jié)核分枝桿菌H37Rv的基因組測序和注釋工作。2002年，Camus等[10]通過EMBL、TrEMBL和SWISS-PROT三個數(shù)據(jù)庫序列同源性比較，補(bǔ)充了82個新編碼基因。傳統(tǒng)的基因組注釋是利用已知的基因特征和同源性比較實(shí)現(xiàn)的，難以發(fā)現(xiàn)人類未知的、新基因結(jié)構(gòu)特征的基因，造成這些生物學(xué)功能和對菌株鑒別可能重要的基因遺漏，逃離人類研究的視線，形成盲區(qū)。國內(nèi)外研究者基于算法優(yōu)化[10]、基因預(yù)測軟件及注釋工具開發(fā)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)[11-15]、比較基因組學(xué)[16]等策略，一直在校正和完善H37Rv基因組注釋數(shù)據(jù)庫。然而，MTB屬于原核生物，受基因組測序質(zhì)量影響以及缺乏合適的校正評估方法，原核生物基因組注釋中尚可能存在注釋錯誤[17](過度注釋；ORF起始、終止位點(diǎn)注釋錯誤；可變剪接；核糖體移位；漏注釋等)，給準(zhǔn)確解析相應(yīng)物種的生物學(xué)機(jī)制帶來了困擾[18]。

利用蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，結(jié)合基因組數(shù)據(jù)、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來研究基因組注釋問題，被稱為蛋白質(zhì)基因組學(xué)(Proteogenomics)[19]。近10年來，蛋白質(zhì)組學(xué)直接用于基因組的注釋已經(jīng)越來越受到相關(guān)領(lǐng)域的關(guān)注。本課題組前期基于深度覆蓋的精準(zhǔn)蛋白質(zhì)基因組學(xué)技術(shù)[20,24]和比較基因組學(xué)策略，完成了H37Rv基因組數(shù)據(jù)庫的重注釋，發(fā)現(xiàn)了22個結(jié)核遺漏注釋基因，矯正了28個N端注釋錯誤基因(圖1，尚未發(fā)表)。此發(fā)現(xiàn)有利于結(jié)核新型特異性免疫原性分子標(biāo)志物篩選，為結(jié)核病的快速、精準(zhǔn)臨床檢測提供基礎(chǔ)理論和原始創(chuàng)新技術(shù)支持。

從TubercuList庫中下載了H37Rv (http:// genolist.pasteur.fr/TubercuList/) 基因組注釋數(shù)據(jù)庫，共4 031個基因，包含4 018個編碼基因和13個假基因。六閱讀框翻譯數(shù)據(jù)庫由中國科學(xué)院計(jì)算技術(shù)研究所pFind團(tuán)隊(duì)與我們課題組合作開發(fā)的蛋白質(zhì)基因組學(xué)軟件pAnno對NCBI中結(jié)核分枝桿菌H37Rv的基因組文件(NC000962.3.fna) 按照正鏈和互補(bǔ)鏈上連續(xù)的3個核苷酸翻譯一個氨基酸的規(guī)則翻譯，使用終止子到終止子的翻譯模式，采用MTB特殊的3種起始密碼子ATG、GTG和TTG，共翻譯得到141 851個開放閱讀框(Opening reading frame，ORF)。與已注釋的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行合并，經(jīng)過嚴(yán)格FDR篩選，結(jié)合譜圖人工核實(shí)、肽段合成驗(yàn)證、轉(zhuǎn)錄豐度、基因組多序列比對，獲得了一批質(zhì)量可信的新肽段，完成了H37Rv新編碼基因的驗(yàn)證和原先注釋錯誤基因的矯正。

圖1 結(jié)核分枝桿菌H37Rv蛋白質(zhì)基因組學(xué)分析流程圖

基因是我們發(fā)現(xiàn)的H37Rv遺漏注釋基因之一(根據(jù)基因在染色體的坐標(biāo)位置及結(jié)核基因命名法進(jìn)行命名)。前期深度覆蓋質(zhì)譜數(shù)據(jù)共鑒定到兩條肽段即“PNPWQYIR”和“VHNLDPEL VDEHAR”，化學(xué)合成肽段與原先鑒定肽段譜圖相似性分別為0.94和0.96，意味著基因成功被轉(zhuǎn)錄、翻譯。T細(xì)胞表位預(yù)測(https://www.iedb. org/) 發(fā)現(xiàn)，Rv2742新蛋白中高可信的T細(xì)胞表位數(shù)有19個(>0.5分)，高可信T細(xì)胞表位覆蓋到該蛋白66.42%的序列，與已知表位庫比較，都是新型的表位，該蛋白具有很好的免疫原性。此外，經(jīng)NCBI-BLASTP后，數(shù)據(jù)庫中沒有比對到相似序列，屬于功能未知蛋白。為進(jìn)一步探索新基因功能及其潛在臨床應(yīng)用價值，有必要建立其表達(dá)、純化體系。

本研究比較了4種不同的原核表達(dá)載體(pGEX-4T-2、pET-32a、pET-28a和pMAL-c2X)、密碼子利用偏性、5種宿主(JM109 (DE3)、BL21、BL21 (DE3)、BL21 (DE3) pLysS和(DE3))、不同誘導(dǎo)溫度(16 ℃和28 ℃)、不同IPTG濃度(0.5 mmol/L和1.0 mmol/L) 等條件下，目的蛋白的表達(dá)量。旨在最優(yōu)實(shí)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌H37Rv新編碼基因克隆、可溶性誘導(dǎo)表達(dá)，從而能高效純化Rv2742蛋白，為后續(xù)開展該蛋白的潛在相互作用及免疫原性研究奠定基礎(chǔ)。后期實(shí)驗(yàn)采用的質(zhì)譜方法是基于“自下而上”(Bottom-up) 鳥槍法的策略[21]，其基本流程是首先將蛋白質(zhì)酶解為肽段，再用反相液相色譜進(jìn)行分離，被洗脫的肽段用串聯(lián)質(zhì)譜(一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜) 檢測，最后利用搜庫軟件對樣品中的肽段和蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒

H37Rv菌株DNA來自河北省石家莊市第五醫(yī)院。大腸桿菌DH5α、BL21 (DE3) 及BL21 (DE3) pLysS感受態(tài)細(xì)胞均購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。大腸桿菌BL21及(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。JM109 (DE3) 感受態(tài)細(xì)胞購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。pGEX-4T-2為本實(shí)驗(yàn)室保存質(zhì)粒；pET-28a質(zhì)粒由國家蛋白質(zhì)科學(xué)中心田春艷博士饋贈；pET-32a質(zhì)粒由德陽生物技術(shù)(固安) 有限責(zé)任公司技術(shù)總監(jiān)趙明治博士饋贈；pMAL-c2X質(zhì)粒由華大青蘭生物科技(無錫)有限公司饋贈。引物合成和測序均由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司完成。

1.1.2 主要試劑

DNA marker (DL 1 000、λ-d Ⅲ)、pMD18-T 載體試劑盒均購自寶生物工程有限公司(大連)；2×PCR Master Mix、DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA提取試劑盒均購自天根生化科技有限公司(北京)；限制性內(nèi)切酶(HⅠ、d Ⅲ、RⅠ、Ⅰ、Ⅰ、Ⅰ及直鏈淀粉樹脂均購自紐英倫生物技術(shù)公司(美國)；注射用氨芐西林鈉購自石藥集團(tuán)中諾藥業(yè)有限公司；蛋白marker (10 kDa) 購自富酶泰斯公司(加拿大)；瓊脂糖購自Biowest公司(法國)；耐自消化高活性乙?；鹊鞍酌竵碜员本┟钢瓷锟萍加邢薰綶22-23]。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

PCR儀、凝膠電泳電源、凝膠成像系統(tǒng)、DNA電泳儀、電泳槽均為BIO-RAD (美國) 公司產(chǎn)品；冷凍離心機(jī)、搖床、LTQ Orbitrap Velos質(zhì)譜儀均為Thermo Fisher Scientific (美國) 公司產(chǎn)品；紫外分光光度計(jì)為島津公司(日本) 產(chǎn)品；純水儀為Merck Millipore (德國) 公司產(chǎn)品；電熱恒溫水浴鍋為北京長風(fēng)公司產(chǎn)品；電熱恒溫培養(yǎng)箱為上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)為寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

以H37Rv DNA為模板，引物如表1所示，分別擴(kuò)增獲得新基因片段。PCR反應(yīng)體系均為：ddH2O 9.5 μL、2×PCR Master Mix 12.5 μL、DNA 1 μL、上下游引物各1 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性 1 min，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

PCR產(chǎn)物利用DNA回收試劑盒回收，與pMD18-T克隆載體于16 ℃過夜連接。連接體系為T4 DNA連接酶緩沖液1 μL、T4 DNA連接酶1 μL、ddH2O 3 μL、pMD18-T克隆載體0.5 μL、目的片段回收產(chǎn)物4.5 μL。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞。菌落PCR鑒定為陽性的質(zhì)粒送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。NCBI在線比對為陽性的質(zhì)粒命名為pMD18T-。

上述測序正確的質(zhì)粒分別與其相應(yīng)的載體(pGEX-4T-2、pET-32a、pET-28a或pMAL-c2X)分別利用HⅠ/Ⅰ或RⅠ/d Ⅲ進(jìn)行雙酶切。雙酶切體系為ddH2O 24 μL、質(zhì)粒20 μL、NE緩沖液3.1 5 μL，HⅠ(0.3 μL)/Ⅰ(0.5 μL)或RⅠ/d Ⅲ (各0.3 μL) 37 ℃雙酶切6 h，DNA回收試劑盒分別回收目的基因及載體片段，經(jīng)T4 DNA連接酶16 ℃過夜連接。連接體系為T4 DNA連接酶緩沖液1 μL，T4 DNA連接酶 1 μL，ddH2O 3 μL，表達(dá)載體雙酶切產(chǎn)物1 μL，目的片段回收產(chǎn)物4 μL。將連接產(chǎn)物10 μL轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，菌落PCR為陽性的質(zhì)粒命名為pGEX-4T-2--1、pET-32a--1、pET-28a--1及pMAL-c2X--1。

1.2.2基因密碼子優(yōu)化及優(yōu)化產(chǎn)物重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

依據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性，將基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化。對優(yōu)化后的基因片段進(jìn)行引物設(shè)計(jì)(表1)，操作步驟同前。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，菌落PCR驗(yàn)證為陽性的質(zhì)粒分別命名為pGEX-4T-2--2、pET-32a--2、pET-28a--2、pMAL-c2X--2。

重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化BL21 (DE3) 宿主菌，挑取單菌落于5 mL LB (含100 μg/mL Amp/Kana) 液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)。以起始600=0.1接種于50 mL LB (含100 μg/mL Amp/Kana)液體培養(yǎng)基中。37 ℃振蕩培養(yǎng)至600為0.6–0.8時，加入終濃度為１ mmol/L的IPTG，28 ℃、200 r/min誘導(dǎo)6–8 ｈ。分別收取誘導(dǎo)前后14菌體，離心后用預(yù)冷的PBS洗滌兩次，加入等體積裂解液(PBS+1 mmol/L PMSF+0.5% Triton X-100)超聲破碎，分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE，比較IPTG誘導(dǎo)前后目的蛋白的表達(dá)情況。

1.2.4 Rv2742新蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化

將重組質(zhì)粒pMAL-c2X-Rv2742-2取0.5 μL分別轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主菌JM109 (DE3)、BL21、BL21 (DE3)、BL21 (DE3) pLysS及Rosetta (DE3) 中，28 ℃、終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)6–8 h，比較不同宿主菌對目的蛋白表達(dá)量的影響?；诒磉_(dá)量較高的宿主進(jìn)行不同溫度(16 ℃和28 ℃)、不同IPTG濃度(終濃度為0.5 mmol/L和1.0 mmol/L) 過夜誘導(dǎo)，比較誘導(dǎo)條件對目的蛋白表達(dá)量的影響。10% SDS-PAGE檢測目的蛋白表達(dá)情況。

表1 引物序列

.-1 represented the primer before codon optimization while -2 represented the primer after codon optimization. The single underlined sequences indicate restriction enzyme site.

1.2.5 Rv2742融合蛋白的純化及LC-MS/MS鑒定

將誘導(dǎo)后上清經(jīng)直鏈淀粉樹脂(Amylose resin)柱(100 μL) 4 ℃孵育1 h，用清洗液 (20 mmol/L Tris-HCl (pH 7.4)、200 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、1 mmol/L 二硫蘇糖醇、1 mmol/L 苯甲基磺酰氟、0.5% Triton X-100) 500 μL洗3次，用洗脫液(清洗液+10 mmol/L麥芽糖) 100 μL洗脫2次，純化得到目的融合蛋白，10% SDS-PAGE檢測。經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R-250染色并脫色后檢測目的融合蛋白的純化情況。

將純化的目的條帶切成1 mm3膠粒，脫色、脫水、蒸干、經(jīng)乙酰化胰蛋白酶(10 ng/μL) 37 ℃過夜消化、抽提肽段、蒸干后置?80 ℃凍存。

蒸干后的肽段使用上樣緩沖液(1% ACN+1% FA+98% ddH2O) 進(jìn)行充分溶解。通過超高壓液相色譜進(jìn)行分離，其中分離柱采用內(nèi)徑75 μm長 15 cm的C18反相色譜分析柱，內(nèi)部C18填料內(nèi)徑3 μm。洗脫組分經(jīng)納升級電噴霧離子源接口噴 出進(jìn)入LTQ Orbitrap Velos分析。毛細(xì)管離子傳輸溫度為250 ℃，電噴霧電壓為1.8 kV。質(zhì)譜采用一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)依賴的二級質(zhì)譜掃描模式(Data dependent MS/MS scan) 碰撞誘導(dǎo)裂解(Collision-induced dissociation，CID) 模式碎裂一級離子。一級質(zhì)譜掃描質(zhì)核比范圍為300– 1 600 (/)，分辨率設(shè)置為30 000；自動增益控制(Automatic gain control，AGC) 為106。依次選取一級信號強(qiáng)度最高的20個離子進(jìn)行二級碎裂分析，碰撞歸一化能量(Normalized collision energy，NCE)為35%；AGC為104；最大離子注入時間為30 ms；動態(tài)排除(Dynamic exclusion)為40 s(40s內(nèi)不重復(fù)掃描已檢測母離子)[24]。

“是的。Y的行為是S一直想不通的。小說家也沒跟我講清楚，也許故事中的那個男人也不清楚。S曾以為那只是跟曲三年契約造成的后遺癥，但看來已不限于這件事了?？傊虑楹軓?fù)雜，距離結(jié)束還遠(yuǎn)著呢。你還想聽嗎？”

1.2.6 數(shù)據(jù)庫搜索

pFind3 (https://github.com/pFindStudio/pFind3/ issues)對質(zhì)譜產(chǎn)生的數(shù)據(jù)文件(.raw) 進(jìn)行蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫搜索。數(shù)據(jù)庫由從UniProt (Version：201601)下載目標(biāo)完整蛋白質(zhì)組序列、結(jié)核分枝桿菌H37Rv遺漏注釋蛋白Rv2742序列、pMAL-c2X載體標(biāo)簽MBP蛋白序列和常見污染構(gòu)成。搜庫參數(shù)設(shè)置如下：1) 胰酶特異性酶切(Trypsin KR_C)；2) 固定修飾為半胱氨酸的烷基化修飾Carbamidomethyl[C] (+57.021 46 Da)；3) 可變修飾為甲硫氨酸氧化修飾Oxidation[M] (+15.994 92 Da)；4) 母離子質(zhì)量誤差20 ppm；5) 子離子質(zhì)量誤差0.5 Da；6)允許最大漏切位點(diǎn)數(shù)目為2個；7) 7 AA≤肽段長度≤100 AA；8)肽段最大修飾為2種。搜庫結(jié)果采用目標(biāo)-誘餌庫策略進(jìn)行過濾，并設(shè)定肽段和蛋白質(zhì)鑒定假陽性率(False discovery rate，F(xiàn)DR) 均小于1%[25]。

1.2.7 IPTG誘導(dǎo)表達(dá)Rv2742蛋白生長曲線的測定

將重組質(zhì)粒pMAL-c2X--2取0.5 μL轉(zhuǎn)化至BL21 (DE3)，挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)于5 mL LB (含100 μg/mL Amp) 液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)。采用比濁法，分光光度計(jì)波長為600 nm檢測。用LB液體培養(yǎng)基調(diào)零，以起始600為0.1接種于5 mL LB (含100 μg/mL Amp) 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)。待菌體生長至對數(shù)期，實(shí)驗(yàn)組加入終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)，設(shè)置3組生物學(xué)重復(fù)，每隔1.5 h檢測值。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建方法類似，以 pMAL-c2X--2為例。以密碼子優(yōu)化后的序列為模板擴(kuò)增，獲得基因片段約420 bp，與預(yù)期的目的片段大小一致(圖 2A)，表明成功獲得目的基因。純化的目的片段與pMD 18-T連接轉(zhuǎn)化后進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，在目的條帶處成功獲得特異性條帶(圖 2B)，且測序序列正確。RⅠ和d Ⅲ雙酶切pMD 18T-質(zhì)粒6 h，酶切片段約為420 bp，與預(yù)期大小相符(圖2C)。RⅠ和d Ⅲ雙酶切質(zhì)粒pMAL-c2X，酶切片段約為6 478 bp (圖2 D)，與預(yù)期相符。將雙酶切后回收的目的片段與載體片段連接轉(zhuǎn)化進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，在目的條帶處獲得特異性條帶(圖2E)，說明成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pMAL-c2X--2。

2.2 四種表達(dá)載體均未實(shí)現(xiàn)Rv2742目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

經(jīng)Glycine-SDS-PAGE或Tricine-SDS-PAGE[26]電泳結(jié)果分析，如圖3A所示，發(fā)現(xiàn)在28 ℃ 1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)6 h后，pGEX-4T-2系統(tǒng)表達(dá)的Rv2742目的融合蛋白(分子量為40.85 kDa) 主要分布在沉淀中，但在誘導(dǎo)后上清中并沒有明顯的新增條帶，說明以pGEX-4T-2系統(tǒng)表達(dá)的Rv2742目的融合蛋白主要以包涵體形式存在。如圖3B、3C、3D所示，分別以pET-32a、pET-28a、pMAL-c2X系統(tǒng)表達(dá)的Rv2742目的融合蛋白(分子量分別為28.16、18.04、56 kDa) 在誘導(dǎo)后上清與沉淀中均未出現(xiàn)明顯的新增特異性條帶，說明以pET-32a、pET-28a以及pMAL-c2X表達(dá)的Rv2742目的融合蛋白均未能成功實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)表達(dá)。綜上所述，以H37Rv基因組DNA克隆的基因序列為模板所構(gòu)建的pGEX-4T-2--1、pET-32a--1、pET-28a--1、pMAL- c2X--1原核表達(dá)系統(tǒng)均未能實(shí)現(xiàn)Rv2742目的蛋白可溶性誘導(dǎo)表達(dá)。

2.3 Rv2742基因序列密碼子優(yōu)化前后比較

參考大腸桿菌的密碼子偏好性，對序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，經(jīng)DNAMAN序列比對密碼子優(yōu)化前后序列，結(jié)果如4A所示。參照GenScript (http://www.genscript.com/) 中同義密碼子的相對頻率將密碼子分為3類：高頻密碼子、常用密碼子及稀有密碼子[27]，并對優(yōu)化前后的密碼子進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分類，結(jié)果如4B所示，表明優(yōu)化前的含8.15%的稀有密碼子且高頻密碼子所占比例小(28.15%)。對序列的密碼子適應(yīng)指數(shù)(Codon adaptation index，CAI) 計(jì)算，發(fā)現(xiàn)新編碼基因的CAI從0.73升高到0.92，如圖4C所示，結(jié)果顯示經(jīng)密碼子優(yōu)化后更適于大腸桿菌的原核表達(dá)，這為的原核表達(dá)提供有利的理論依據(jù)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)優(yōu)化前的密碼子適應(yīng)度普遍偏低，且最適于表達(dá)的密碼子占51% (91–100)，而不適于表達(dá)的密碼子占9% (0–30)，結(jié)果如圖4D所示，優(yōu)化后減少了的稀有密碼子和適應(yīng)度低的密碼子，不適于表達(dá)的密碼子僅占2% (0–30)，同時增加了高頻密碼子的使用，使得最適密碼子增加到86% (91–100)，有效地提高了其轉(zhuǎn)錄和翻譯的效率。

圖2 重組表達(dá)質(zhì)粒pMAL-c2X-Rv2742-2構(gòu)建及鑒定

圖3 分別利用pGEX-4T-2、pET-32a、pET-28a、pMAL-c2X四種表達(dá)載體表達(dá)Rv2742重組蛋白的Glycine-SDS-PAGE/Tricine-SDS-PAGE圖譜(Rv2742密碼子優(yōu)化前)

2.4 Rv2742新基因密碼子優(yōu)化后實(shí)現(xiàn)了目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

以密碼子優(yōu)化后的序列為模板，將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pGEX-4T-2--2、pET- 32a--2、pET-28a--2分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3) 中，28 ℃、終濃度為1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)6 h后，經(jīng)Glycine-SDS-PAGE或Tricine- SDS-PAGE分析，如圖5A、5B、5C所示，IPTG誘導(dǎo)后的上清和沉淀中均未出現(xiàn)明顯新增條帶，表明密碼子優(yōu)化后，pGEX-4T-2、pET-32a、pET-28a原核表達(dá)系統(tǒng)均未能實(shí)現(xiàn)Rv2742重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)(分子量分別為40.85 kDa、28.16 kDa、 18.04 kDa)。而將含重組質(zhì)粒pMAL-c2X--2的大腸桿菌BL21 (DE3) 在28 ℃、終濃度為1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)6 h。10% Glycine-SDS-PAGE顯示，與未加IPTG誘導(dǎo)前相比，誘導(dǎo)后上清和沉淀均在56 kDa出現(xiàn)特異性新增條帶，其大小與目的蛋白預(yù)期相符。初步說明目的片段在大腸桿菌pMAL-c2X表達(dá)系統(tǒng)中得到了表達(dá)，且表達(dá)產(chǎn)物能以可溶性蛋白形式出現(xiàn)，但表達(dá)量不高(圖5D)。

圖4 Rv2742基因序列密碼子優(yōu)化前后差異的比較

2.5 宿主菌Rosetta (DE3) 實(shí)現(xiàn)了目的蛋白的高表達(dá)及誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

將重組質(zhì)粒pMAL-c2X--2分別轉(zhuǎn)化至宿主菌JM109 (DE3)、BL21、BL21 (DE3)、BL21 (DE3) pLysS及Rosetta (DE3) 中，28 ℃、終濃度為1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)6–8 h。10% SDS-PAGE結(jié)果顯示，Rv2742目的蛋白雖在其他4個宿主菌JM109 (DE3)、BL21、BL21 (DE3)、BL21 (DE3) pLysS中均實(shí)現(xiàn)了可溶性誘導(dǎo)表達(dá)，但在Rosetta (DE3) 宿主菌中的表達(dá)量尤為顯著(圖6A)。在Rosetta(DE3)宿主菌、終濃度為1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)條件下，我們比較了28 ℃ (6–8 h) 和16 ℃ (12 h)溫度下目的蛋白的表達(dá)量，結(jié)果表明目的蛋白在16 ℃低溫誘導(dǎo)時表達(dá)量更高(圖6B)。在Rosetta (DE3) 宿主菌及16℃過夜誘導(dǎo)條件下，我們比較了終濃度為1 mmol/L和0.5 mmol/L IPTG對目的蛋白表達(dá)量的影響，結(jié)果表明目的蛋白在終濃度為0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)條件下表達(dá)量最高(圖6B)。綜上所述，在宿主菌Rosetta (DE3)、16 ℃及終濃度為0.5 mmol/L IPTG過夜誘導(dǎo)條件下能更有效地實(shí)現(xiàn)Rv2742蛋白的融合表達(dá)。

圖5 分別利用pGEX-4T-2、pET-32a、pET-28a、pMAL-c2X四種表達(dá)載體表達(dá)Rv2742重組蛋白的SDS-PAGE/Tricine-SDS-PAGE圖譜(Rv2742密碼子優(yōu)化后)

2.6 Rv2742目的融合蛋白的純化及LC-MS/ MS鑒定

在Rosetta (DE3) 宿主菌中，16 ℃、終濃度為0.5 mmol/L IPTG過夜誘導(dǎo)表達(dá)的上清超聲裂解后親和純化(圖7A)，在56 kDa處獲得純度較高的Rv2742目的融合蛋白。經(jīng)LC-MS/MS鑒定，pFind 3搜庫鑒定到4條Rv2742目的蛋白高可信肽段，分別為MSDNAIRP、PNPWQYIR、YGPRPDPND、VHNLDPELVDEHAR (圖7C)。計(jì)算得到Rv2742目的蛋白鑒定肽段序列覆蓋度達(dá)29.63% (圖7B), 而Rv2742融合蛋白鑒定肽段序列覆蓋度高達(dá)61.46%。說明經(jīng)過宿主菌、低溫、低濃度IPTG誘導(dǎo)條件優(yōu)化后，純化得到含量更高的Rv2742融合蛋白，為后續(xù)進(jìn)一步的功能研究提供必要的條件。

2.7 IPTG誘導(dǎo)表達(dá)Rv2742蛋白生長曲線的測定

將重組質(zhì)粒pMAL-c2X--2取0.5 μL轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta (DE3) 中。如圖8所示，未加IPTG誘導(dǎo)組(?IPTG) 在整個時間段內(nèi)保持正常生長，經(jīng)過對數(shù)期后達(dá)到平臺期。而與對照組(?IPTG) 相比，加入IPTG誘導(dǎo)(+IPTG) 組的生長情況明顯受到抑制，誘導(dǎo)后0–1.5 h范圍內(nèi)值只有少量增加且誘導(dǎo)3 h后菌體值基本維持穩(wěn)定。由于IPTG是一種極強(qiáng)的誘導(dǎo)劑，不被細(xì)菌代謝因而十分穩(wěn)定，在胞內(nèi)誘導(dǎo)外源蛋白的表達(dá)，會對細(xì)胞產(chǎn)生一定的毒性。其次，加入IPTG后，大量外源蛋白的表達(dá)造成菌體原有代謝活動的失衡和重新分配。對于菌體內(nèi)源蛋白來說，是一種對游離氨基酸以及核糖體的競爭和掠奪，這必然會影響內(nèi)源蛋白的合成速度，導(dǎo)致菌體的生長受到明顯抑制，生長速度降低。

圖6 Rv2742融合蛋白在五種不同宿主菌中誘導(dǎo)表達(dá)及在Rosetta (DE3) 宿主菌中誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

圖7 Rv2742目的融合蛋白純化及質(zhì)譜檢測

圖8 IPTG誘導(dǎo)表達(dá)Rv2742蛋白生長曲線的測定

3 討論

大腸桿菌是一種基因組G+C含量低(<50%)的革蘭氏陰性菌，而結(jié)核分枝桿菌() 是一種基因組G+C含量高(>65%) 的革蘭氏陽性放線菌[28]，放線菌基因組的典型特征就是基因組G+C含量高。結(jié)核分枝桿菌G_和C_結(jié)尾末端的密碼子具有很強(qiáng)的偏倚性，第3個位點(diǎn)的密碼子(G+C) 含量高達(dá)83%[29]。密碼子偏倚性影響翻譯過程中氨基酸插入的準(zhǔn)確性、多肽折疊和mRNA序列的穩(wěn)定性等幾方面[30]。結(jié)核分枝桿菌目的基因在大腸桿菌中不易表達(dá)可能主要是由于G+C含量高和獨(dú)特密碼子的使用[31]。生物體中基因所使用的密碼子和tRNA的豐度有著強(qiáng)的正相關(guān)性。依照物種的偏好性對mRNA的序列進(jìn)行優(yōu)化，將目的基因的密碼子替換成宿主細(xì)胞常用的密碼子，能夠增加tRNA的結(jié)合效率從而提高蛋白質(zhì)表達(dá)水平。

本次實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)核新基因編碼蛋白分子量本身不大，pET-32a和pET-28a雖然同屬pET載體，標(biāo)簽大小對小蛋白的表達(dá)有一定程度的影響，所以在實(shí)驗(yàn)過程中考慮到使用不同種類和大小標(biāo)簽的pET載體。但僅在密碼子優(yōu)化后，利用pMAL-c2X原核表達(dá)系統(tǒng)才在上清和沉淀中都實(shí)現(xiàn)了表達(dá)，沉淀中表達(dá)含量要比可溶性部分高。后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)一步考慮對以包涵體形式表達(dá)的蛋白進(jìn)行變性和復(fù)性。誘導(dǎo)后上清雖然實(shí)現(xiàn)了可溶性誘導(dǎo)表達(dá)，但表達(dá)含量較低，可從溫度、IPTG濃度、抗生素濃度、誘導(dǎo)時間、宿主菌等多方面進(jìn)行優(yōu)化，從而提高其表達(dá)量。本次實(shí)驗(yàn)從宿主菌、溫度、IPTG濃度等方面進(jìn)行優(yōu)化，在Rosetta (DE3) 宿主菌中的表達(dá)量尤為顯著。低溫及低濃度誘導(dǎo)劑的條件有利于蛋白的可溶性表達(dá)。Rosetta (DE3) 是攜帶氯霉素抗性質(zhì)粒BL21的衍生菌，補(bǔ)充大腸桿菌缺乏的6種稀有密碼子(AUA、AGG、AGA、CUA、CCC、GGA) 對應(yīng)的tRNA，提高外源基因在該系統(tǒng)中的表達(dá)水平，為其他結(jié)核遺漏注釋基因的表達(dá)、純化提供了較好的宿主選擇性。

在進(jìn)行原核表達(dá)時，目前多以融合蛋白形式表達(dá)，具有融合標(biāo)簽的表達(dá)載體可促進(jìn)蛋白質(zhì)可溶性表達(dá)和正確折疊恢復(fù)成天然結(jié)構(gòu)。融合蛋白標(biāo)簽的選擇很重要，源于其可能影響天然蛋白質(zhì)的相互作用、翻譯后修飾、重組蛋白的溶解度和細(xì)胞定位等[32]，其應(yīng)用取決于對特異性、溶解度、結(jié)合和洗脫條件等的要求[33]。添加非肽融合配體具有作為溶解度增強(qiáng)劑作用的優(yōu)點(diǎn)[34]。最常用的融合標(biāo)簽有：麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)、轉(zhuǎn)錄終止/抗終止蛋白NusA)、硫氧還蛋白(Trx)、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)、ubiquitin、SUMO等[35]，但這些融合伴體作為溶解度增強(qiáng)劑起作用的原因尚不清楚。在MBP標(biāo)簽存在情況下，其具有內(nèi)在 的分子伴侶活性促進(jìn)溶解影響其融合伴侶的折 疊[36]。谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST) 可以結(jié)合到谷胱甘肽樹脂上進(jìn)行純化，可以保護(hù)目的蛋白免受蛋白酶降解，增加蛋白的穩(wěn)定性。但GST是一個很弱的溶解度增強(qiáng)劑[37]，易產(chǎn)生包涵體。而NusA、MBP和Trx顯示出較好的溶解度增強(qiáng)特性，但它們的大分子量可能對蛋白質(zhì)溶解度造成一定的影響[38]。pET-32a含有基因并攜帶有用于蛋白生產(chǎn)和純化的雙融合伴侶。TrxA是一種存在于大腸桿菌胞質(zhì)中高度可溶性表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)熱穩(wěn)定性蛋白，能顯著增加重組蛋白的可溶性，減少包涵體形成。但TrxA沒有內(nèi)在的親和特性，因此在蛋白質(zhì)純化時需要附加額外的融合標(biāo)簽，如His6標(biāo)簽[39]。His標(biāo)簽在天然和變性的純化條件下被用來幫助溶解和折疊[40]。

啟動子在控制相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄起始中起重要作用。本實(shí)驗(yàn)研究中運(yùn)用了4種原核表達(dá)系統(tǒng)均能被IPTG誘導(dǎo)，表達(dá)載體pGEX-4T-2和pMAL-c2X均帶有強(qiáng)大的tac啟動子。tac啟動子由trp啟動子?35區(qū)和lac UV5啟動子?10區(qū)融合而成的雜合啟動子，受lac阻抑物調(diào)控[41]。在pET系列表達(dá)載體中，外源基因在表達(dá)時受T7噬菌體RNA聚合酶調(diào)控，編碼序列在多克隆位點(diǎn)插入，置于天然T7 RNA聚合酶啟動子(φ10啟動子) 或所謂的“T7 lac啟動子”的控制之下，后者是帶有l(wèi)ac操縱子(lacO) 序列的天然T7 RNA聚合酶啟動子的衍生體，lac阻抑物的結(jié)合能阻斷轉(zhuǎn)錄起始[42]。

對于特異性抗原的篩選，一直是結(jié)核分枝桿菌研究中的重點(diǎn)。基于串聯(lián)質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)被應(yīng)用于注釋基因的鑒定、新基因的發(fā)現(xiàn)、個人基因組學(xué)和疾病相關(guān)研究[43]。本實(shí)驗(yàn)通過對結(jié)核分枝桿菌H37Rv新基因進(jìn)行克隆、誘導(dǎo)表達(dá)和純化，純化后的目的蛋白有可能直接作為抗原或制備抗體建立免疫學(xué)檢測方法，為特異性診斷試劑盒和新型疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。H37Rv新基因在結(jié)核三大數(shù)據(jù)庫(UniProt、NCBI、TubercuList) 中均沒有記錄，其功能目前尚未可知，但其表達(dá)豐度較高，只是基于成熟的預(yù)測模型沒有預(yù)測出來。這種高表達(dá)漏注釋基因產(chǎn)物可能在結(jié)核分枝桿菌中發(fā)揮了某些特殊的生物學(xué)功能，值得進(jìn)一步探索。

目的基因密碼子優(yōu)化、可溶性融合標(biāo)簽篩選及宿主菌、溫度、IPTG濃度等表達(dá)條件的優(yōu)化是實(shí)現(xiàn)蛋白在大腸桿菌中可溶性誘導(dǎo)表達(dá)的有效策略[44]。

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Cloning, expression and purification of novel geneinH37Rv

Jialing Zhao1,3, Shujia Wu2,3, Hong Wang3,4, Qianlin Li4, Jinshuai Sun3,5, Lei Chang3, Erhei Dai4, Junzhu Wu2,Yao Zhang3,6, and Ping Xu1,3

1 School of Pharmaceutical Sciences, Wuhan University, Wuhan 430000, Hubei, China 2 School of Basic Medical Sciences, Wuhan University, Wuhan 430000, Hubei, China 3State Key Laboratory of Proteomics, Beijing Proteome Research Center, National Center for Protein Sciences (Beijing), Beijing Institute of Lifeomics, Beijing 102206, China 4 School of Public Health and Affiliated Shijiazhuang Fifth Hospital, North China University of Science and Technology, Tangshan063210, Hebei, China 5 School of Life Sciences, Hebei University, Baoding 071000, Hebei, China 6 School of Life Sciences, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275, Guangdong, China

is a novel gene identified fromH37Rv by the proteogenomics strategy. The aim of this study was to establish a system of soluble expression and purification of the missing protein Rv2742 inH37Rv, to provide reference for further research on the biological function of. The soluble protein was not successfully induced by prokaryotic expression vectors pGEX-4T-2-, pET-32a-, pET-28a-and pMAL-c2X-. After the codon of novel genewas optimized according to.codon usage frequency, only the recombinant strain containing plasmid pMAL-c2X-could produce soluble products ofencoding gene. In addition, the expression effects of the desired fusion protein were also analyzed under different conditions including hosts, culture temperatures and IPTG concentrations. The optimum expression conditions were as follows:(DE3) host, 16 °C culture temperature and 0.5 mmol/L IPTG. After being purified by affinity chromatography with amylose resin, the fusion protein sequence was confirmed by LC-MS/MS. These results indicated that the novel geneproduct could be successfully induced and expressed in a soluble form by the expression system pMAL-c2X with MBP tag. Our findings provide reference for studies on potential interaction and immunogenicity.

,novel gene, prokaryotic expression, affinity purification

March 12, 2019;

June 14, 2019

Chinese National Basic Research Programs (No. 2017YFC0906600), National Megaprojects for Key Infectious Diseases (No. 2018ZX10302302001003), National Natural Science Foundation of China (Nos. 31670834, 31870824, 91839302), Applied and basic research foundation of Guangdong Province (No. 2018A030310257).

s: Ping Xu. Tel: +86-10-61777113; Fax: +86-10-61777050; E-mail: xupingghy@gmail.com

Yao Zhang. Tel: +86-10-61777113; Fax: +86-10-61777050; E-mail: zhangyaowsw@163.com

趙加玲, 武舒佳, 王紅, 等. 結(jié)核分枝桿菌H37Rv新基因克隆表達(dá)及純化. 生物工程學(xué)報(bào), 2019, 35(9): 1771–1786.

Zhao JL, Wu SJ, Wang H, et al. Cloning, expression and purification of novel geneinH37Rv. Chin J Biotech, 2019, 35(9): 1771–1786.

國家精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)重大專項(xiàng) (No. 2017YFC0906600)，國家傳染病重大專項(xiàng) (No. 2018ZX10302302001003)，國家自然科學(xué)基金 (Nos. 31670834，31870824，91839302)，廣東省基礎(chǔ)及應(yīng)用基礎(chǔ)研究博士科研啟動項(xiàng)目(No. 2018A030310257) 資助。

(本文責(zé)編 郝麗芳)