王遠(yuǎn)山，郝文輝，吳哲明，牛坤，龔美華

原位顯微鏡在細(xì)胞生物量在線監(jiān)測(cè)中的發(fā)展與應(yīng)用

王遠(yuǎn)山，郝文輝，吳哲明，牛坤，龔美華

浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310014

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的快速發(fā)展，生物發(fā)酵過程在工業(yè)生產(chǎn)中的重要性日益增加。為獲得質(zhì)量穩(wěn)定的發(fā)酵產(chǎn)品，通常需要對(duì)發(fā)酵過程進(jìn)行監(jiān)測(cè)與調(diào)控。生物量可以直接反映生物反應(yīng)器中細(xì)胞代謝的主體——細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，因此實(shí)現(xiàn)生物量的在線監(jiān)測(cè)對(duì)發(fā)酵過程的調(diào)控具有重要意義。原位顯微鏡是一項(xiàng)非侵入式的、基于圖像分析的技術(shù)，可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)生物過程中的細(xì)胞量。文中就原位顯微鏡的發(fā)展及其在細(xì)胞生物量實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)行了綜述。

原位顯微鏡，發(fā)酵過程，生物量，在線監(jiān)測(cè)

隨著近幾十年生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，生物發(fā)酵已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品、制藥、環(huán)境保護(hù)、能源等行業(yè)中[1]，酸奶、啤酒、生物乙醇、抗生素、氨基酸、單克隆抗體等發(fā)酵產(chǎn)品層出不窮，生物發(fā)酵已與人們的生活息息相關(guān)。發(fā)酵過程的高效調(diào)控是確保生物發(fā)酵產(chǎn)品產(chǎn)量與質(zhì)量的關(guān)鍵。截至目前，多種傳感器已被開發(fā)用于監(jiān)測(cè)發(fā)酵過程中的一些重要參數(shù)，比如pH、溶氧、溫度、底物濃度、產(chǎn)物濃度、呼吸商、生物量等[2]，為發(fā)酵過程的實(shí)時(shí)調(diào)控提供切實(shí)可靠的數(shù)據(jù)，保障產(chǎn)品的最終產(chǎn)量與質(zhì)量。

在發(fā)酵過程中，通過活體細(xì)胞代謝將底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物是生物反應(yīng)過程中的關(guān)鍵，因此對(duì)生物量的監(jiān)測(cè)，尤其是對(duì)活細(xì)胞生物量的監(jiān)測(cè)就顯得尤為重要[3-5]。生物量是指單位體積培養(yǎng)基中所含細(xì)胞的質(zhì)量或細(xì)胞的數(shù)目[6]。通過對(duì)生物量的監(jiān)測(cè)，可以對(duì)發(fā)酵過程中細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)行評(píng)估，從而采取合適的調(diào)控策略，以保證發(fā)酵過程的正常運(yùn)行。目前關(guān)于生物量監(jiān)測(cè)的主流方法多是采用離線的方式來(lái)進(jìn)行，如干重法、光密度法 (600)、計(jì)數(shù)法、離心體積法等，雖然這些方法操作簡(jiǎn)單、成本低廉，但是過程繁瑣、耗時(shí)費(fèi)力，對(duì)培養(yǎng)液中的活細(xì)胞、死細(xì)胞以及不溶性物料無(wú)法區(qū)分，更重要的是不能實(shí)時(shí)反映生物量，使得對(duì)發(fā)酵過程的調(diào)控具有嚴(yán)重的滯后性[7-10]，并且頻繁的取樣過程會(huì)使得發(fā)酵罐中的培養(yǎng)體系發(fā)生改變，增加染菌的風(fēng)險(xiǎn)[11]。除了生物量的監(jiān)測(cè)之外，對(duì)細(xì)胞的活力鑒定也極為重要。通常，根據(jù)原理，細(xì)胞活力鑒定可以分為如下幾類[12-19]：第1類是基于細(xì)胞在固體平板上生長(zhǎng)的能力；第2類是基于細(xì)胞膜的完整性；第3類是基于細(xì)胞膜的功能性；第4類是基于細(xì)胞中的某些酶的活性；第5類是基于流式細(xì)胞儀的篩選鑒定。這些方法對(duì)發(fā)酵過程的調(diào)控同樣具有滯后性。為了克服檢測(cè)滯后性，學(xué)者們做了大量工作，開發(fā)了熒光法、電容法和原位顯微鏡、近紅外光譜、激光反射光譜、拉曼光譜等多種在線監(jiān)測(cè)技術(shù)[1,20-27]。

熒光法是通過熒光傳感器對(duì)細(xì)胞中自發(fā)熒光基團(tuán)，如NADPH，或者與熒光試劑相絡(luò)合的基團(tuán)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，收集熒光信號(hào)，構(gòu)建多元線性回歸模型和偏最小二乘 (Partial least squares, PLS) 回歸模型，對(duì)發(fā)酵過程中的生物量濃度、底物濃度等發(fā)酵參數(shù)進(jìn)行在線監(jiān)測(cè)[28]。熒光傳感器種類繁多，有二維熒光傳感器、多維熒光傳感器等。Haack等[28]利用多維熒光傳感器對(duì)釀酒酵母細(xì)胞生物量濃度進(jìn)行了在線監(jiān)測(cè)，Hantelmann等[24]將二維熒光傳感器應(yīng)用于釀酒酵母的分批發(fā)酵。然而熒光法是基于細(xì)胞中自發(fā)熒光基團(tuán)或者需要向培養(yǎng)基中添加熒光試劑，并且在監(jiān)測(cè)過程中存在熒光信號(hào)重疊問題，使得熒光法在活細(xì)胞生物量在線監(jiān)測(cè)過程中難以實(shí)施[24]。

電容法是基于在交變電場(chǎng)中具有完整生物膜的細(xì)胞會(huì)發(fā)生極化，通過測(cè)定發(fā)酵液在一定頻率范圍內(nèi)的電容和電導(dǎo)率來(lái)衡量發(fā)酵液中的生物量濃度[7]。生物反應(yīng)器中的發(fā)酵液可以視為由3個(gè)獨(dú)立的部分組成，分別為細(xì)胞質(zhì)、外部質(zhì)膜、懸浮介質(zhì)。細(xì)胞質(zhì)是由內(nèi)部細(xì)胞器和蛋白質(zhì)、核酸以及小分子物質(zhì)組成的高度復(fù)雜的混合物；質(zhì)膜是細(xì)胞導(dǎo)電的核心，其本身不能導(dǎo)電；懸浮介質(zhì)由水和帶電離子基團(tuán)組成。因此，可以將發(fā)酵液視為包含眾多球形電容器的懸浮液[29]。向發(fā)酵液施加一個(gè)交變電場(chǎng)，使細(xì)胞內(nèi)部和外部帶正電荷的離子和帶負(fù)電荷的離子向相反的方向移動(dòng)，直至遇到質(zhì)膜，帶正電荷的離子與帶負(fù)電荷的離子分別聚集在細(xì)胞膜的兩側(cè)，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生極化。這種由電場(chǎng)所引起的細(xì)胞極化的量級(jí)可以通過電容來(lái)進(jìn)行測(cè)量，進(jìn)而對(duì)發(fā)酵液中生物量濃度進(jìn)行監(jiān)測(cè)。Lan等[30]將電容法應(yīng)用于真氧產(chǎn)堿桿菌發(fā)酵聚羥基鏈烷酸酯過程中的活細(xì)胞量檢測(cè)；Xiong等[31]在釀酒酵母高密度分批補(bǔ)料發(fā)酵谷胱甘肽中利用電容法測(cè)定發(fā)酵液中的活細(xì)胞生物量濃度。盡管存在一些不足，如價(jià)格昂貴、細(xì)胞質(zhì)中的膜結(jié)構(gòu)對(duì)整個(gè)細(xì)胞的介電性質(zhì)產(chǎn)生影響，同時(shí)電極的極化使得整體的電容測(cè)量偏大等[21]，電容法仍然是應(yīng)用最為廣泛的活細(xì)胞生物量在線監(jiān)測(cè)方法。華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室等研究機(jī)構(gòu)在這方面做了大量工作，在發(fā)酵過程控制與優(yōu)化方面也取得了良好的效果[27,30-31]。

原位顯微鏡技術(shù)是基于在線采集生物反應(yīng)器中發(fā)酵液的顯微圖片，通過對(duì)顯微圖片的處理分析，在線獲取發(fā)酵液中的生物量濃度，并對(duì)細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行分析[32]，目前已成為一種具有較好應(yīng)用前景的在線生物量分析技術(shù)。

筆者所在團(tuán)隊(duì)長(zhǎng)期從事工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域的研究，其中涉及到大量的微生物發(fā)酵和細(xì)胞培養(yǎng)過程，對(duì)過程控制與優(yōu)化有著較好的積累，深知細(xì)胞生物量和形態(tài)在線檢測(cè)的重要性。同時(shí)，筆者及所在團(tuán)隊(duì)也承擔(dān)了生物工程專業(yè)主干課程生物工程設(shè)備 (國(guó)家精品資源共享課程http://www. icourses.cn/sCourse/course_2616.html) 的教學(xué)工作，生物培養(yǎng)過程的檢測(cè)與控制是教學(xué)重要內(nèi)容，因而對(duì)生物量在線檢測(cè)技術(shù)也有較好的了解。鑒于目前在國(guó)內(nèi)還沒有系統(tǒng)介紹原位顯微鏡發(fā)展及其應(yīng)用的文獻(xiàn)，本文結(jié)合筆者科研和教學(xué)工作的積累就此進(jìn)行綜述。

1 原位顯微鏡的結(jié)構(gòu)

1990年，Suhr等首次描述了原位顯微鏡的概念。它由顯微成像系統(tǒng)、控制系統(tǒng)、圖像處理系統(tǒng)3部分組成[33]，其結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示[43]，具體描述將在下文展開。根據(jù)原位顯微鏡在發(fā)酵過程中對(duì)樣本量的定義方式，可以將其劃分為兩類：一類是光學(xué)采樣原位顯微鏡，通過估計(jì)顯微照片的景深來(lái)定義虛擬的樣本量。第二類是機(jī)械采樣原位顯微鏡，通過機(jī)械裝置重復(fù)封裝體積相等的樣品來(lái)定義樣本量[6]。對(duì)于光學(xué)采樣原位顯微鏡因其需要從顯微照片中計(jì)算景深，所以其算法結(jié)構(gòu)相對(duì)于機(jī)械采樣原位顯微鏡要更復(fù)雜。而對(duì)于機(jī)械采樣原位顯微鏡，其機(jī)械裝置和命令系統(tǒng)更復(fù)雜。

1.1 光學(xué)采樣原位顯微鏡

1995年，Suhr等第一次詳細(xì)描述了光學(xué)采樣原位顯微鏡，其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖如圖2所示[6]。一個(gè)直徑為25 mm的不銹鋼外管安裝在生物反應(yīng)器上，其末端是一個(gè)密封的透明石英玻璃窗，作為隔絕發(fā)酵罐內(nèi)部環(huán)境與外部環(huán)境的屏障，從而保障發(fā)酵罐內(nèi)部的無(wú)菌環(huán)境。一個(gè)直射光顯微鏡集成在不銹鋼內(nèi)管中，在發(fā)酵時(shí)將內(nèi)管插入到外管中，與SIT照相機(jī)一起組成顯微成像系統(tǒng)。發(fā)酵結(jié)束后可以將內(nèi)管從外管中取出單獨(dú)保存。

圖2 光學(xué)采樣原位顯微鏡[6]

顯微鏡由物鏡 (Olympus D APO l00×UV，油浸，NA=0.95)、二向色鏡以及外耦合鏡組成，并且可以通過調(diào)節(jié)千分尺螺旋來(lái)實(shí)現(xiàn)顯微鏡的正確聚焦。氮激光光源發(fā)射波長(zhǎng)為337 nm的光，經(jīng)過二向色鏡反射后，照亮細(xì)胞。隨后被照射的細(xì)胞激發(fā)出450 nm波長(zhǎng)的熒光，透過二向色鏡，經(jīng)過外耦合鏡，將細(xì)胞的圖像呈遞給照相機(jī)記錄。之后顯微照片傳輸至搭載了圖像分析算法的電腦中被儲(chǔ)存和分析。在發(fā)酵開始的階段，圖像獲取的頻率為每2秒一張圖像，到了后期頻率變?yōu)槊?0秒一張圖像。圖像的處理速度為每分鐘一張。顯然圖像的分析速度慢，無(wú)法為發(fā)酵過程調(diào)控提供大量實(shí)時(shí)的具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的數(shù)據(jù)。

Camisard等[34]、Wiedemann等[35]對(duì)Suhr等開發(fā)的光學(xué)采樣原位顯微鏡進(jìn)行了改進(jìn)。他們以發(fā)光二極管 (LED) 作為光源，通過光纖傳導(dǎo)，照亮物鏡前的區(qū)域。在纖維末端和石英玻璃窗之間，存在0.7 mm的間隙，允許發(fā)酵液自由流動(dòng)。此外，圖像獲取頻率和圖像處理的速度也得到了極大的發(fā)展。在Camisard等開發(fā)的算法中，圖像處理速度達(dá)到了0.6 s/張[34]。目前市場(chǎng)上光學(xué)采樣顯微鏡結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖和實(shí)物圖如圖3所示[36,41]。

1.2 機(jī)械采樣原位顯微鏡

1998年，Bittner等[33]基于光學(xué)采樣原位顯微鏡開發(fā)了機(jī)械采樣原位顯微鏡，其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖如圖4所示[38,45]。安裝在發(fā)酵罐的前端具有透明石英窗的不銹鋼外管，可以自由移動(dòng)帶有直射光顯微鏡的內(nèi)管，一個(gè)CCD照相機(jī)組成顯微成像系統(tǒng)。在不銹鋼外管的前端有可以自由滑動(dòng)的密封的照明系統(tǒng)，由一個(gè)滑塊、聚光器、發(fā)光二極管組成。采樣時(shí)，電機(jī)驅(qū)動(dòng)照明系統(tǒng)向外管的前端滑動(dòng)，從而與外管共同組成體積固定的樣品小室。在這個(gè)封閉的小室中完成樣品的顯微成像后，照明系統(tǒng)回到原位，樣品小室重新打開，封裝的樣品被釋放，發(fā)酵液可以自由地通過采樣區(qū)。

2007年，Wei等[38]在機(jī)械采樣原位顯微鏡的基礎(chǔ)上對(duì)照明系統(tǒng)進(jìn)行改進(jìn)，開發(fā)出了暗場(chǎng)原位顯微鏡。在暗場(chǎng)顯微鏡中，正常的聚光器被暗場(chǎng)聚光器所取代，這樣可以使顯微照片的背景變得更暗，目標(biāo)細(xì)胞變得更亮，從而增加照片的清晰度，有利于后續(xù)的細(xì)胞識(shí)別，其照明原理如圖5所示[39]。準(zhǔn)直透鏡將LED光源發(fā)射的光整合成平行光，位于準(zhǔn)直透鏡與石英玻璃窗中間的暗場(chǎng)聚光器對(duì)中間部分的平行光進(jìn)行限制，同時(shí)改變邊緣部分平行光的路徑，使其投射于采樣區(qū)的細(xì)胞。從而光源發(fā)射出的光無(wú)法進(jìn)入物鏡，而被照亮的細(xì)胞發(fā)出的散射光被物鏡收集，從而將細(xì)胞的圖像呈遞給照相機(jī)記錄。同時(shí)，在物鏡與相機(jī)之間添加一個(gè)中繼透鏡，通過中繼透鏡的二次成像，可以使照相機(jī)記錄的顯微照片更清晰，有中繼透鏡和無(wú)中繼透鏡拍攝的圖像如圖6所示[39]。

圖5 暗場(chǎng)照明原理[39]

2 圖像處理和分析

對(duì)圖像的處理和分析是原位顯微鏡技術(shù)應(yīng)用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。近幾十年來(lái)，隨著人工智能的發(fā)展，應(yīng)用于圖像處理和分析的軟件及算法越來(lái)越完善。盡管針對(duì)不同的發(fā)酵條件，其圖像處理的過程不盡相同，但是可以將其劃分為3個(gè)部分[33]。首先是圖像預(yù)處理，其目的是消除圖像捕獲期間的所有背景噪聲并增加細(xì)胞和背景之間的對(duì)比度。其次是細(xì)胞識(shí)別，這也是圖像處理過程中最核心的步驟，它的目的是將細(xì)胞像素從背景中的非細(xì)胞像素中識(shí)別和分離出來(lái)，因此如何正確識(shí)別細(xì)胞像素對(duì)于算法是至關(guān)重要的，在下文將詳細(xì)介紹。最后是細(xì)胞表征，通過從顯微照片中分離出的細(xì)胞像素來(lái)估計(jì)細(xì)胞的直徑、形態(tài)和大小，從而對(duì)細(xì)胞的活力進(jìn)行表征。

對(duì)于一個(gè)算法的優(yōu)良性，可以用靈敏度(Sensitivity,) 和正向預(yù)測(cè)值 (Positive predictive value,) 來(lái)進(jìn)行評(píng)估[38,40]，其中靈敏度 () 表示算法能夠正確識(shí)別細(xì)胞的比例；正向預(yù)測(cè)值 () 表示算法檢測(cè)到的細(xì)胞是真實(shí)細(xì)胞的比例。高的靈敏度和正向預(yù)測(cè)值可以保證通過算法得到的數(shù)據(jù)的真實(shí)性和可靠性。用于細(xì)胞生物量和細(xì)胞活力表征的圖像處理技術(shù)將在后文中分別進(jìn)行敘述。此外，圖像的處理速度也是至關(guān)重要的，因?yàn)樵诒O(jiān)測(cè)過程中會(huì)產(chǎn)生大量的顯微照片，處理速度慢就無(wú)法提供具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的數(shù)據(jù)來(lái)實(shí)現(xiàn)在線監(jiān)測(cè)。在初期，Suhr等[6]使用的圖像處理器的處理速度為每分鐘一張圖像。2017年，Belini等[41]使用WiT和MATLAB對(duì)顯微照片進(jìn)行處理，其速度為每秒6張圖像，提高了360倍。

2.1 細(xì)胞生物量檢測(cè)的圖像分析

1995年，在Scholz等[42]開發(fā)的算法中，包含有5個(gè)步驟，分別為：1) 背景消除；2) 平滑；3) 生成模糊敏感特征向量；4) 確定景深；5) 計(jì)算濃度。雖然它可以對(duì)發(fā)酵液中的細(xì)胞生物量進(jìn)行檢測(cè)和計(jì)算，但是不能提供關(guān)于細(xì)胞的特定信息，而且圖像處理速度很慢。隨后，1998年Bittner等[33]基于機(jī)械采樣原位顯微鏡開發(fā)出比較復(fù)雜的算法，同時(shí)利用釀酒酵母的光學(xué)特性即酵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)具有比發(fā)酵液更高的折射率來(lái)提高算法的準(zhǔn)確性。作者使用兩臺(tái)CCD相機(jī)分別記錄聚焦細(xì)胞和離焦細(xì)胞，其中離焦細(xì)胞用于細(xì)胞定位，而聚焦細(xì)胞用于細(xì)胞像素與背景中的非細(xì)胞像素分離。細(xì)胞識(shí)別后，使用中值濾波對(duì)圖像進(jìn)行進(jìn)一步降噪處理從而表征細(xì)胞形態(tài)，并且構(gòu)建三維模型用于計(jì)算細(xì)胞體積。其圖像分析過程如圖7所示[33]。

2016年，Dias等[43]利用Matlab8.1運(yùn)行圖像處理算法對(duì)廢水中的絲狀細(xì)菌進(jìn)行在線監(jiān)測(cè)，圖像經(jīng)過預(yù)處理、二值化、菌絲鑒定后實(shí)現(xiàn)菌絲長(zhǎng)度的量化，其中菌絲鑒定的過程如圖8[43]所示。同年，為了實(shí)現(xiàn)對(duì)畢赤酵母高濃度發(fā)酵過程的在線監(jiān)測(cè)，Marquard等[44]采用兩種算法對(duì)圖像進(jìn)行分析。在發(fā)酵過程的初始階段，發(fā)酵液中的細(xì)胞濃度低，作者使用畢赤酵母計(jì)數(shù)算法 (counter algorithm, PCA) 對(duì)發(fā)酵液中的細(xì)胞進(jìn)行監(jiān)測(cè)。之后經(jīng)過指數(shù)期，細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入到穩(wěn)定期，發(fā)酵液當(dāng)中的細(xì)胞濃度很高并且聚集形成塊狀，此時(shí)通過PCA無(wú)法獲得發(fā)酵液中的細(xì)胞濃度，而聚類識(shí)別算法 (Cluster recognition algorithm, CRA) 可以解決這個(gè)問題，即通過計(jì)算塊狀的體積來(lái)建立與細(xì)胞濃度之間的關(guān)系。2017年，Belini等[41]利用WiT和MATLAB分析酵母細(xì)胞的原位顯微圖像，利用圓形霍夫轉(zhuǎn)化 (Circular hough transform, CHT) 對(duì)近似圓形的酵母細(xì)胞進(jìn)行在線監(jiān)測(cè)。此外還報(bào)道，利用原位顯微鏡與光纖pO2傳感器、中紅外光譜以及三維全息技術(shù)協(xié)同工作，監(jiān)測(cè)乙醇發(fā)酵過程中細(xì)胞密度、葡萄糖、乙醇等的變化[45-47]。

圖7 原位顯微鏡圖像分析過程[33]

圖8 菌絲鑒定過程[43]

2.2 細(xì)胞活力表征的圖像分析

2007年，在支持向量機(jī) (Support vector machine, SVM) 的幫助下，Wei等[38]在沒有使用任何染料的條件下實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞的生物量檢測(cè)和細(xì)胞的活力鑒定。用兩個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)組對(duì)支持向量機(jī) (SVM) 進(jìn)行訓(xùn)練，第一個(gè)實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞處于對(duì)數(shù)期，第二個(gè)實(shí)驗(yàn)組為死細(xì)胞。遺憾的是，細(xì)胞活力分類是在離線裝置中進(jìn)行的，無(wú)法在發(fā)酵過程中進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控。2010年，Burgemeister等[40]采用相同的方法，在腺病毒EI基因改造的人神經(jīng)細(xì)胞系A(chǔ)GEI.HN培養(yǎng)過程中，利用CellViCAM算法對(duì)細(xì)胞的生物量和細(xì)胞的活力進(jìn)行鑒定。該算法分兩步進(jìn)行：首先，在圖像經(jīng)過預(yù)處理后，利用CHT對(duì)圖像中的細(xì)胞像素進(jìn)行定位；其次，利用已經(jīng)建立好的4套訓(xùn)練集，分別為活細(xì)胞訓(xùn)練集、壞死細(xì)胞訓(xùn)練集、早期凋亡細(xì)胞訓(xùn)練集、晚期凋亡細(xì)胞訓(xùn)練集對(duì)SVM分類器進(jìn)行訓(xùn)練。同時(shí)，應(yīng)用3級(jí)樹狀分類架構(gòu)，用于區(qū)分顯微照片中相應(yīng)的4個(gè)細(xì)胞狀態(tài)。然而，使用細(xì)胞匹配和圓形相似性對(duì)細(xì)胞活力進(jìn)行的鑒定僅限于具有規(guī)則細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞。

除了機(jī)器學(xué)習(xí)方法之外，還可以基于不同的細(xì)胞形態(tài)對(duì)細(xì)胞活力進(jìn)行鑒定，在細(xì)胞生長(zhǎng)最后階段，細(xì)胞形態(tài)的異質(zhì)性就會(huì)表現(xiàn)出來(lái)。圖9展示了處于生長(zhǎng)期和死亡期的哺乳動(dòng)物細(xì)胞形態(tài)[35]。通過對(duì)細(xì)胞形態(tài)的異質(zhì)性進(jìn)行表征，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的活力鑒定。2011年，Wiedemann等[35]基于顯微圖像細(xì)胞像素灰度值的信息熵方差和對(duì)比度差異，對(duì)雜交瘤細(xì)胞的活力進(jìn)行鑒定。旨在獲得單細(xì)胞的熵信息并計(jì)算低熵細(xì)胞的百分比，其中低熵意味著均勻的細(xì)胞形態(tài)，高熵意味著不均勻的細(xì)胞形態(tài)。2018年，Marbà-Ardébol等[48]基于非芽殖和芽殖細(xì)胞的不同形態(tài)，對(duì)酵母細(xì)胞活力進(jìn)行鑒定，圖10展示了酵母細(xì)胞在芽殖過程中的形態(tài)異質(zhì)性變化[48]。利用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò) (Artificial neural networks, ANN) 將顯微圖像中的細(xì)胞像素分為出芽細(xì)胞和非出芽細(xì)胞，同時(shí)采用訓(xùn)練的貝葉斯分類器對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。最后，根據(jù)鑒定結(jié)果計(jì)算出芽指數(shù)，從而判定酵母細(xì)胞的活力。

圖10 原位顯微鏡下酵母細(xì)胞的芽殖過程[48]

3 原位顯微鏡的應(yīng)用

原位顯微鏡多應(yīng)用于酵母細(xì)胞以及動(dòng)物細(xì)胞的生化反應(yīng)過程中，僅有少量文獻(xiàn)報(bào)道其在絲狀細(xì)菌、大腸桿菌以及藻類中的應(yīng)用。

3.1 在酵母菌培養(yǎng)過程中的應(yīng)用

1995年Suhr等[6]應(yīng)用光學(xué)采樣原位顯微鏡對(duì)釀酒酵母的發(fā)酵過程進(jìn)行監(jiān)控。1998年Bittner等[33]同樣將機(jī)械采樣原位顯微鏡應(yīng)用于釀酒酵母的發(fā)酵過程，此后Wei等[38]開發(fā)出暗場(chǎng)顯微鏡并且嘗試對(duì)釀酒酵母的活力進(jìn)行鑒定；Marquard等[44]應(yīng)用不同的算法嘗試將原位顯微鏡應(yīng)用于巴氏畢赤酵母的高密度發(fā)酵過程；Belini等[41]將原位顯微鏡應(yīng)用于生物乙醇的工業(yè)生產(chǎn)中；Marbà-Ardébol等[48]利用原位顯微鏡來(lái)計(jì)算釀酒酵母細(xì)胞的出芽指數(shù)從而判定細(xì)胞的活力。表1匯總了原位顯微鏡技術(shù)在酵母菌培養(yǎng)過程中的應(yīng)用情況。由表1可知，原位顯微鏡在酵母細(xì)胞的生物發(fā)酵過程中應(yīng)用前景廣泛。無(wú)論是高密度發(fā)酵還是工業(yè)生產(chǎn)，都實(shí)現(xiàn)了原位顯微鏡的在線監(jiān)測(cè)，并且在線監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)穩(wěn)定，與離線方法的相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.9以上。

3.2 在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程中的應(yīng)用

原位顯微鏡在動(dòng)物細(xì)胞中的應(yīng)用相對(duì)較晚，直到2002年，Joeris等[49]利用機(jī)械采樣原位顯微鏡對(duì)CHO細(xì)胞進(jìn)行在線監(jiān)測(cè)，2004年，Guez等[50]利用原位顯微鏡對(duì)雜交瘤細(xì)胞的高密度發(fā)酵進(jìn)行在線監(jiān)控。此后，Rudolph等[37]首次將原位顯微鏡應(yīng)用于貼壁生長(zhǎng)的小鼠成纖維細(xì)胞中，首先基于顯微圖像開發(fā)出一種算法，分割微載體與細(xì)胞；其次基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法估測(cè)微載體的分段圖像區(qū)域的電鍍效率和細(xì)胞定植水平；2010年，Burgemeister等[40]基于CellViCAM算法以及半自動(dòng)支持向量機(jī) (SVM)訓(xùn)練，利用暗場(chǎng)顯微鏡對(duì)腺病毒EI基因改造的人神經(jīng)細(xì)胞系A(chǔ)GEI.HN進(jìn)行在線監(jiān)測(cè)，其算法識(shí)別細(xì)胞的準(zhǔn)確率達(dá)到86%，對(duì)細(xì)胞活力鑒定的準(zhǔn)確性達(dá)到了87%。因支持向量機(jī)不是完全自動(dòng)，2011年Wiedemann等[35]通過計(jì)算顯微照片中高熵細(xì)胞的比例判定細(xì)胞的活力。此后Lüder等[46]將原位顯微鏡與中紅外光譜連用，監(jiān)測(cè)CHO細(xì)胞系的發(fā)酵過程。表2匯總了原位顯微鏡技術(shù)在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程中的應(yīng)用情況。由表2可知，在動(dòng)物細(xì)胞的發(fā)酵過程中原位顯微鏡是一種有力的在線監(jiān)測(cè)工具，其準(zhǔn)確性高，并且與離線方法能夠良好擬合。

3.3 在其他細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用

截至目前，原位顯微鏡多用于近圓形細(xì)胞的發(fā)酵過程中，在其他形態(tài)細(xì)胞中僅有少量文獻(xiàn)報(bào)道。2016年Dias等[43]利用原位顯微鏡技術(shù)量化絲狀細(xì)菌的菌絲長(zhǎng)度；2017年Marquard等[51]利用原位顯微鏡對(duì)大腸桿菌的發(fā)酵過程進(jìn)行監(jiān)控；同年Marbà-Ardébol等[47]利用原位顯微鏡與三維全息圖像技術(shù)對(duì)寇氏隱甲藻細(xì)胞中的脂質(zhì)積累進(jìn)行監(jiān)測(cè)。表3匯總了原位顯微鏡技術(shù)在其他細(xì)胞培養(yǎng)過程中的應(yīng)用情況。

表1 原位顯微鏡在酵母培養(yǎng)中的應(yīng)用

表2 原位顯微鏡在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用

表3 原位顯微鏡在其他細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用

4 總結(jié)與展望

綜上所述，原位顯微鏡是生物量濃度和細(xì)胞活力鑒定的有效工具，其非侵入性和非破壞性操作對(duì)于現(xiàn)代生物發(fā)酵至關(guān)重要。原位顯微鏡的研發(fā)主要集中于機(jī)械設(shè)備研制和算法優(yōu)化及軟件的研發(fā)。鑒于原位顯微鏡主要用于動(dòng)物細(xì)胞和酵母等近圓形細(xì)胞的培養(yǎng)過程，為拓展其應(yīng)用范圍，可以從以下幾個(gè)方面著手：1) 對(duì)原位顯微鏡的硬件設(shè)施進(jìn)行改進(jìn)，如添加透鏡、改進(jìn)照明方式等，以獲得更加清晰的顯微照片。2) 對(duì)原位顯微鏡的軟件進(jìn)行研發(fā)，開發(fā)新的圖像處理技術(shù)和算法，提高識(shí)別效果和圖像處理速度，使得原位顯微鏡能夠應(yīng)用于更多發(fā)酵過程和更加復(fù)雜的發(fā)酵環(huán)境。3) 增加原位顯微鏡的放大倍數(shù)，以便更多應(yīng)用于細(xì)菌發(fā)酵過程。隨著這些新技術(shù)的開發(fā)，可以有效促進(jìn)原位顯微鏡技術(shù)的應(yīng)用，為生物量和細(xì)胞形態(tài)等的在線監(jiān)測(cè)提供有效的工具，對(duì)發(fā)酵過程的高效調(diào)控具有一定意義。

[1] Assawajaruwan S, Reinalter J, Hitzmann B. Comparison of methods for wavelength combination selection from multi-wavelength fluorescence spectra for on-line monitoring of yeast cultivations. Anal Bioanal Chem, 2017, 409(3): 707–717.

[2] Vann L, Sheppard J. Use of near-infrared spectroscopy (NIRs) in the biopharmaceutical industry for real-time determination of critical process parameters and integration of advanced feedback control strategies using MIDUS control. J Ind Microbiol Biotechnol, 2017, 44(12): 1589–1603.

[3] Petiot E, El-Wajgali A, Esteban G, et al. Real-time monitoring of adherent Vero cell density and apoptosis in bioreactor processes. Cytotechnology, 2012, 64(4): 429–441.

[4] Olsson L, Nielsen J. On-line andmonitoring of biomass in submerged cultivations. Trends Biotechnol, 1997, 15(12): 517–522.

[5] Workman J, Koch M, Veltkamp DJ. Process analytical chemistry. Anal Chem, 2003, 75(12): 2859–2876.

[6] Suhr H, Wehnert G, Schneider K, et al.microscopy for on-line characterization of cell-populations in bioreactors, including cell-concentration measurements by depth from focus. Biotechnol Bioeng, 1995, 47(1): 106–116.

[7] Fernandez RE, Lebiga E, Koklu A, et al. Flexible bioimpedance sensor for label-free detection of cell viability and biomass. IEEE Trans Nanobiosci, 2015, 14(7): 700–706.

[8] Holland T, Blessing D, Hellwig S, et al. The in-line measurement of plant cell biomass using radio frequency impedance spectroscopy as a component of process analytical technology. Biotechnol J, 2013, 8(10): 1231–1240.

[9] Belini V L, Wiedemann P, Suhr H.microscopy: a perspective for industrial bioethanol production monitoring. J Microbiol Methods, 2013, 93(3): 224–232.

[10] Thomson K, Bhat A, Carvell J. Comparison of a new digital imaging technique for yeast cell counting and viability assessments with traditional methods. J Inst Brewing, 2015, 121(2): 231–237.

[11] Rathore AS, Bhambure R, Ghare V. Process analytical technology (PAT) for biopharmaceutical products. Anal Bioanal Chem, 2010, 398(1): 137–154.

[12] Bouchez JC, Cornu M, Danzart M, et al. Physiological significance of the cytometric distribution of fluorescent yeasts after viability staining. Biotechnol Bioeng, 2004, 86(5): 520–530.

[13] Attfield PV, Kletsas S, Veal DA, et al. Use of flow cytometry to monitor cell damage and predict fermentation activity of dried yeasts. J Appl Microbiol, 2000, 89(2): 207–214.

[14] Beck AE, Hunt KA, Carlson RP. Measuring cellular biomass composition for computational biology applications. Processes, 2018, 6(5): 38.

[15] Hernlem B, Hua SS. Dual fluorochrome flow cytometric assessment of yeast viability. Curr Microbiol, 2010, 61(1): 57–63.

[16] Chandler WL, Yeung W, Tait JF. A new microparticle size calibration standard for use in measuring smaller microparticles using a new flow cytometer. J Thromb Haemost, 2011, 9(6): 1216–1224.

[17] Mirek MK, Zadrag-Tecza R. Comparison of methods used for assessing the viability and vitality of yeast cells. FEMS Yeast Res, 2014, 14(7): 1068–1079.

[18] Longo VD, Shadel GS, Kaeberlein M, et al. Replicative and chronological aging in. Cell Metab, 2012, 16(1): 18–31.

[19] Essary BD, Marshall PA. Assessment of FUN-1 vital dye staining: yeast with a block in the vacuolar sorting pathway have impaired ability to form CIVS when stained with FUN-1 fluorescent dye. J Microbiol Methods, 2009, 78(2): 208–212.

[20] Bluma A, H?pfner T, Lindner P, et al.imaging sensors for bioprocess monitoring: state of the art. Anal Bioanal Chem, 2010, 398(6):2429–2438.

[21] Justice C, Brix A, Freimark D, et al. Process control in cell culture technology using dielectric spectroscopy. Biotechnol Adv, 2011, 29(4): 391–401.

[22] Hall JW, McNeil B, Rollins MJ, et al. Near-infrared spectroscopic determination of acetate, ammonium, biomass, and glycerol in an industrialfermentation. Appl Spectrosc, 1996, 50(1): 102–108.

[23] Expósito PL, Suárez AB, álvarez CN. Laser reflectance measurement for the online monitoring ofbiomass concentration. J Biotechnol, 2017, 243: 10–15.

[24] Hantelmann K, Kollecker M, Hüll D, et al. Two-dimensional fluorescence spectroscopy: a novel approach for controlling fed-batch cultivations. J Biotechnol, 2006, 121(3): 410–417.

[25] Agarwal UP. 1064 nm FT-Raman spectroscopy for investigations of plant cell walls and other biomass materials. Front Plant Sci, 2014, 5: 490.

[26] Kiviharju K, Salonen K. Moilanen U, et al. Biomass measurement online: the performance of in situ measurements and software sensors. J Ind Microbiol Biotechnol, 2008, 35(7): 657–665.

[27] Wang ZJ, Wang P, Zhang Q, et al. Principle and application of physiological parameters detection biosensor technology in microbial fermentation process optimization. Biotechnol Busin, 2018, 63(1): 19–32 (in Chinese).王澤建, 王萍, 張琴, 等. 微生物發(fā)酵過程生理參數(shù)檢測(cè)傳感器技術(shù)與過程優(yōu)化. 生物產(chǎn)業(yè)技術(shù), 2018, 63(1): 19–32.

[28] Haack MB, Eliasson A, Olsson L. On-line cell mass monitoring ofcultivations by multi-wavelength fluorescence. J Biotechnol, 2004, 114(1/2): 199–208.

[29] Carvell JP, Dowd JE. On-line measurements and control of viable cell density in cell culture manufacturing processes using radio-frequency impedance. Cytotechnology, 2006, 50: 35–48.

[30] Lan L, Wang ZJ, Chen XJ, et al. Optimization of polyhydroxyalkanoates fermentations with on-line capacitance measurement. Bioresourc Technol, 2014, 156: 216–221.

[31] Xiong ZQ, Guo MJ, Guo YX, et al. Real-time viable-cell mass monitoring in high-cell-density fed-batch glutathione fermentation byT65 in industrial complex medium. J Biosci Bioeng, 2008, 105(4): 409–413.

[32] Suhr H, Speil P, Wehnert G, et al.Mikroskopsonde und Me?verfahren, DE 4032002A1, 1991.

[33] Bittner C, Wehnert G, Scheper T.microscopy for on-line determination of biomass. Biotechnol Bioeng, 1998, 60(1): 24–35.

[34] Camisard V, Brienne JP, Baussart H, et al. Inline characterization of cell concentration and cell volume in agitated bioreactors usingmicroscopy: application to volume variation induced by osmotic stress. Biotechnol Bioeng, 2002, 78(3): 353.

[35] Wiedemann P, Guez JS, Wiegemann HB, et al.microscopic cytometry enables noninvasive viability assessment of animal cells by measuring entropy states. Biotechnol Bioeng, 2011, 108(12): 2884–2893.

[36] Wiedemann P, Guez JS, Cassar JP, et al. Optical samplingmicroscopy for on-line monitoring of animal cell cultures[C]. 11th International Symposium on Computer Applications in Biotechnology. Leuven, Belgium, July 7–9, 2010

[37] Rudolph G, Lindner P, Gierse A, et al. Online monitoring of microcarrier based fibroblast cultivations withmicroscopy. Biotechnol Bioeng, 2008, 99(1): 136–145.

[38] Wei N, You J, Friehs K, et al. Anprobe for on-line monitoring of cell density and viability on the basis of dark field microscopy in conjunction with image processing and supervised machine learning. Biotechnol Bioeng, 2007, 97(6): 1489–1500.

[39] Wei N, You J, Friehs K, et al.dark field microscopy for on-line monitoring of yeast cultures. Biotechnol Lett, 2007, 29(3): 373–378.

[40] Burgemeister S, Nattkemper TW, Noll T, et al. CellViCAM-Cell viability classification for animal cell cultures using dark field micrographs. J Biotechnol, 2010, 149(4): 310–316.

[41] Belini VL, Caurin GAP, Wiedemann P, et al. Yeast fermentation of sugarcane for ethanol production: can it be monitored by usingmicroscopy? Braz J Chem Eng, 2017, 34(4): 949–959.

[42] Scholz T. Ein depth from focus-verfahren zur online-bestimmung der zellkonzentration bei fermentationsprozessen[D]. Heidelberg: Universit?t Heidelberg, 1995.

[43] Dias PA, Dunkel T, Fajado DAS, et al. Image processing for identification and quantification of filamentous bacteria inacquired images. BioMed Eng Online, 2016, 15: 64.

[44] Marquard D, Enders A, Roth G, et al.microscopy for online monitoring of cell concentration incultivations. J Biotechnol, 2016, 234: 90–98.

[45] Akin M, Prediger A, Yuksel M, et al. A new set up for multi-analyte sensing: At-line bio-process monitoring. Biosens Bioelectron, 2011, 26(11): 4532–4537.

[46] Lüder C, Lindner P, Bulnes-Abundis D, et al.microscopy and MIR-spectroscopy as non-invasive optical sensors for cell cultivation process monitoring. Pharm Bioprocess, 2014, 2(2): 157–166.

[47] Marbà-Ardébol AM, Emmerich J, Neubauer P, et al. Single-cell-based monitoring of fatty acid accumulation inwith three-dimensional holographic andmicroscopy. Process Biochem, 2017, 52: 223–232.

[48] Marbà-Ardébol AM, Emmerich J, Muthig M, et al. Real-time monitoring of the budding index inbatch cultivations withmicroscopy. Microb Cell Fact, 2018, 17: 73.

[49] Joeris K, Frerichs JG, Konstantinov K, et al.microscopy: online process monitoring of mammalian cell cultures. Cytotechnology,2002, 38(1/3): 129–134.

[50] Guez JS, Cassar JP, Wartelle F, et al. Real timemicroscopy for animal cell-concentration monitoring during high density culture in bioreactor. J Biotechnol, 2004, 111(3): 335–343.

[51] Marquard D, Schneider-Barthold C, S. Düsterloh, et al. Online monitoring of cell concentration in high cell densitycultivations usingmicroscopy. J Biotechnol, 2017, 259: 83–85.

Development and application ofmicroscopy in on-line monitoring of cell biomass

Yuanshan Wang, Wenhui Hao, Zheming Wu, Kun Niu, and Meihua Gong

College of Biotechnology and Bioengineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou310014, Zhejiang, China

With the rapid development of modern biotechnology, fermentation process is increasingly important in industrial production. To guarantee the stability of products, fermentation process should be elaborately monitored and controlled. Biomass is an important parameter for on-line monitoring in bioprocesses because biomass can reflect cell growth in a bioreactor directly.microscope, a non-invasive and image-analysis based technology, can real-time monitor cells in biological process. This review summarizes the development and application ofmicroscopy in biomass monitoring.

microscope (ISM), fermentation process, biomass, on-line monitor

January 31, 2019;

April 25, 2019

The High Education Teaching Reform Project of Zhejiang (No. jg0160030), Bioprocessing Equipment National Excellent Resources Sharing Curriculum (No. 2016-54), Bioprocessing Equipment Core Curriculum of Zhejiang University of Technology (No. 2016-69).

Yuanshan Wang. Tel: +86-571-88320391; E-mail: yuanshan@ziut.edu.cn

王遠(yuǎn)山, 郝文輝, 吳哲明, 等. 原位顯微鏡在細(xì)胞生物量在線監(jiān)測(cè)中的發(fā)展與應(yīng)用. 生物工程學(xué)報(bào), 2019, 35(9): 1607–1618.

Wang YS, Hao WH, Wu ZM, et al. Development and application ofmicroscopy in on-line monitoring of cell biomass. Chin J Biotech, 2019, 35(9): 1607–1618.

浙江省高等教育教學(xué)改革項(xiàng)目 (No. jg0160030)，生物工程設(shè)備國(guó)家精品資源共享課程建設(shè)計(jì)劃 (No. 2016-54)，浙江工業(yè)大學(xué)生物工程設(shè)備專業(yè)核心課程建設(shè)計(jì)劃 (No. 2016-69) 資助。

(本文責(zé)編 郝麗芳)