張磊，姜棋予，曹哲麗，李靜，楊曉妹，林曉萌

1. 河北大學(xué)附屬醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，河北 保定 071000；2. 解放軍總醫(yī)院 第五醫(yī)學(xué)中心，北京100039；3. 保定市第一中心醫(yī)院 消化內(nèi)科，河北 保定071000；4. 保定市第一中心醫(yī)院 超聲科，河北 保定071000；5. 河北大學(xué)附屬醫(yī)院 乳腺外科，河北 保定071000

隨著臨床診療技術(shù)和抗腫瘤藥物的發(fā)展，內(nèi)分泌依賴的乳腺癌（雌激素受體陽性）及人表皮生長因子受體2（HER2）表達(dá)陽性的乳腺癌相繼出現(xiàn)了對癥治療藥物，患者預(yù)后也有好轉(zhuǎn)[1]。但是在三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）中，相關(guān)治療策略的臨床療效有限，目前仍以化療為主，對TNBC 發(fā)生與進(jìn)展的分子機(jī)制尚不清楚，患者預(yù)后較差[2]。闡明TNBC 發(fā)生與進(jìn)展的相關(guān)分子機(jī)制，對于研究和開發(fā)更為安全和有效的治療策略具有重要意義。

與正常乳腺細(xì)胞相比，TNBC 細(xì)胞具有更為旺盛的物質(zhì)攝取與能量代謝，其中脂肪酸代謝異常在其生長和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。已證實(shí)，腫瘤細(xì)胞攝取的葡萄糖中約60%的碳原子用于脂質(zhì)合成、能量儲存及促腫瘤信號分子生成等[3]。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1（sterol regulatory element binding protein-1，SREBP-1）是脂代謝的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，能夠直接激活多種基因的表達(dá)，這些基因參與脂肪酸、甘油三酯及膽固醇合成與攝取[4]。SREBP-1 不僅與糖尿病等多種代謝性疾病密切相關(guān)，也能在多種腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展中發(fā)揮作用[5]?，F(xiàn)已證實(shí)，SREBP-1 在乳腺癌中表達(dá)陽性，但是對SREBP-1 的研究報道較少，在TNBC 中發(fā)揮的功能和調(diào)控機(jī)制尚不完全清楚。在本研究中，我們通過數(shù)據(jù)庫預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-5688 可能作用于SREBP-1 mRNA 的3'非翻譯區(qū)（UTR），進(jìn)一步在患者來源TNBC（patients-derived TNBC，PDTNBC）細(xì)胞中驗(yàn)證了miR-5688 可抑制SREBP-1的表達(dá)；通過過表達(dá)miR-5688，可抑制PD-TNBC細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲與裸鼠皮下成瘤作用。

1 材料與方法

1.1 材料

裸鼠為北京斯貝福公司產(chǎn)品；TNBC 細(xì)胞系MDA-MB-231 購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所；5 例PD-TNBC 細(xì)胞系由本實(shí)驗(yàn)室保存，該細(xì)胞系為PD-TNBC 組織經(jīng)細(xì)胞分離后培養(yǎng)得到的傳代細(xì)胞；PD-TNBC 組織標(biāo)本由本實(shí)驗(yàn)室收集保存，該組織標(biāo)本為TNBC 患者手術(shù)切除得到的成對標(biāo)本，共30 對，包含腫瘤組織以及癌旁組織，保存于RNAlater 溶液中。

miR-5688 檢測試劑盒和抑制劑購自Thermo公司；細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)使用的各類常規(guī)試劑購自Hyclone 公司；細(xì)胞培養(yǎng)板等購自Corning 公司；含miR-5688 全序列（pre-miR-5688）的慢病毒載體購自Vigene 公司（山東濟(jì)南）；轉(zhuǎn)染試劑及含非特異性序列的空白對照miRNA 慢病毒載體購自Thermo 公司；嘌呤霉素、MTT 實(shí)驗(yàn)試劑盒為Amerresco公司產(chǎn)品；RNA 提 取、反轉(zhuǎn)錄及 定 量PCR 實(shí)驗(yàn)（qPCR）試劑盒購自ABI 公司；蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)使用的抗體購自Santa Cruz 公司。

1.2 定量PCR檢測

對本實(shí)驗(yàn)室收集的成對TNBC 組織標(biāo)本，用RNA 提取試劑盒提取細(xì)胞中的總RNA 樣品，按Ji等[6]及Liang 等[7]的方法，利用qPCR 檢測SREBP-1與miR-5688 的表達(dá)。SREBP-1 正向引物為5'-A CTTCTGGAGGCATCGCAAGCA-3'，反向引物為5'-AGGTTCCAGAGGAGGCTACAAG-3'；miR-5688 正向引物為5'-CGCAGTAACAAACACCTGT-3'，反向引物為5'-GGTCCAGTTTTTTTTTTTTTTTGCT-3'；β-actin 正向引物為5'-CACCATTGGCAATGAGCG GTTC-3'，反向引物為5'-AGGTCTTTGCGGATGT CCACGT-3'。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

MDA-MB-231 與PD-TNBC 細(xì) 胞系在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，用添加10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。依據(jù)試劑說明書進(jìn)行病毒感染實(shí)驗(yàn)，設(shè)置過表達(dá)miR-5688 組（細(xì)胞轉(zhuǎn)染包含miR-5688 全序列的慢病毒載體）、過表達(dá)miR-5688 并轉(zhuǎn)染抑制劑組（穩(wěn)定過表達(dá)miR-5688 后在細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miRNA-5688 的抑制劑）。待用慢病毒感染細(xì)胞后，再以嘌呤霉素進(jìn)行篩選，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株，實(shí)現(xiàn)在MDA-MB-231 細(xì)胞系與PD-TNBC 細(xì)胞中對miR-5688 的過表達(dá)。對照組設(shè)置為轉(zhuǎn)染含有非特異性序列的miRNA 的慢病毒載體。

1.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

培養(yǎng)穩(wěn)定過表達(dá)miR-5688、過表達(dá)miR-5688并轉(zhuǎn)染抑制劑的MDA-MB-231 細(xì)胞與PD-TNBC細(xì)胞，用胰蛋白酶消化細(xì)胞后離心，用注射用生理鹽水重懸細(xì)胞，再將細(xì)胞懸液接種在96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種細(xì)胞約2000 個，在起始時間點(diǎn)（0 h）和培養(yǎng)48 h 后分別進(jìn)行MTT 實(shí)驗(yàn)，測定細(xì)胞樣品的D490nm值。細(xì)胞增殖抑制率（%）=［（48h對照組D490nm-0 h 對照 組D490nm）-（48 h 實(shí)驗(yàn) 組D490nm-0h實(shí)驗(yàn)組D490nm）］/（48h對照組D490nm-0 h 對照組D490nm）×100%。

1.5 Western印跡

培養(yǎng)穩(wěn)定過表達(dá)miR-5688、過表達(dá)miR-5688并轉(zhuǎn)染抑制劑、對照組的MDA-MB-231 細(xì)胞與PD-TNBC 細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白樣品，按照文獻(xiàn)[8]描述的方法進(jìn)行Western 印跡實(shí)驗(yàn)。研究使用的兔抗人SREBP-1 抗體為1∶500 稀釋，兔抗人β-actin單克隆抗體為1∶5000 稀釋，HRP-羊抗兔抗體為1∶5000 稀釋。印跡條帶照片用Image J 軟件進(jìn)行灰度掃描后計算抑制率。抑制率（%）=［（對照組指定條帶圖像密度/對照組內(nèi)參的圖像密度）-（實(shí)驗(yàn)組指定條帶圖像密度/實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參的圖像密度）］/（對照組指定條帶圖像密度/對照組內(nèi)參的圖像密度）×100%。

1.6 Transwell實(shí)驗(yàn)

培養(yǎng)穩(wěn)定過表達(dá)miR-5688、過表達(dá)miR-5688并轉(zhuǎn)染抑制劑的MDA-MB-231 細(xì)胞與PD-TNBC細(xì)胞，接種于Transwell 板的小室中，按照文獻(xiàn)[9]描述的方法進(jìn)行Transwell 實(shí)驗(yàn)。在進(jìn)行細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)（In vitroinvasion）前，小室中預(yù)鋪細(xì)胞外基質(zhì)膠（ECM 膠）；進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)（In vitromigration）時，則直接將細(xì)胞接種在小室中。細(xì)胞在小室中培養(yǎng)24 h 后會由于自身的侵襲作用或轉(zhuǎn)移作用透過小室中的微孔而進(jìn)入下層，用結(jié)晶紫染料標(biāo)記、拍照，再用無水乙醇或冰醋酸萃取細(xì)胞中的染料，讀取D547nm值。抑制率（%）=（對照組D546nm-實(shí)驗(yàn)組D546nm）/（對照組D546nm）×100%。

1.7 裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)

培養(yǎng)穩(wěn)定過表達(dá)miR-5688、對照組的MDAMB-231 細(xì)胞與PD-TNBC 細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液并接種裸鼠皮下，待生長3～4 周形成裸鼠皮下腫瘤組織。用游標(biāo)卡尺測量腫瘤組織的長度（長軸）與寬度（短軸），計算腫瘤體積。腫瘤體積=腫瘤長度×腫瘤寬度×腫瘤寬度/2。剝離腫瘤組織，稱重，計算抑制率。抑制率（%）=（對照組腫瘤體積-實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積）/（對照組腫瘤體積）×100% ，或（對照組腫瘤重量-實(shí)驗(yàn)組腫瘤重量）/（對照組腫瘤重量）×100%。

1.8 統(tǒng)計分析

用SPSS24.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，2 組數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05 視為2 組間有統(tǒng)計學(xué)顯著差異；用Graphpad 6.0 軟件進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 過表達(dá)miR-5688能夠下調(diào)SREBP-1的表達(dá)

SREBP-1 的Gene Symbol 為SREBF1，在miRDB數(shù)據(jù)庫中檢索SREBF1，我們發(fā)現(xiàn)hsa-miR-5688 是最有可能作用于靶基因SREBP-1 的miRNA，其Target Score 為88 分。根據(jù)miRDB 數(shù)據(jù)庫分析，如圖1A 所 示，miR-5688 存在 于SREBP-1 mRNA 的3'UTR 的識別序列。通過數(shù)據(jù)庫檢索，miR-5688 與SREBP-1 可能存在抑制作用關(guān)系。

我們對30 對TNBC 組織樣本的SREBP-1 和miR-5688 的表達(dá)進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)SREBP-1 在腫瘤組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織（圖1B），而miR-5688 在腫瘤組織中的表達(dá)顯著低于癌旁組織（圖1C），二者的表達(dá)在TNBC 組織中呈負(fù)相關(guān)趨勢（y=-0.6607x+0.06929；P＜0.0001）。

進(jìn)一步探討miR-5688 與SREBP-1 的作用關(guān)系，我們在MDA-MB-231 細(xì)胞中設(shè)置過表達(dá)miR-5688 組、過表達(dá)miR-5688 并轉(zhuǎn)染抑制劑組，結(jié)果如圖2 所示，過表達(dá)miR-5688 組能夠顯著降低SREBP-1 的表達(dá)，抑制率約為60%；同時轉(zhuǎn)染miR-5688 抑制劑組基本無抑制作用。上述結(jié)果表明，SREBP-1 在PD-TNBC 癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織，且該成對組織樣本中miR-5688 與SREBP-1 的表達(dá)負(fù)相關(guān)；過表達(dá)miR-5688 能夠下調(diào)SREBP-1 的表達(dá)。

2.2 miR-5688能夠抑制PD-TNBC細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移與侵襲作用

對MDA-MB-231 細(xì) 胞和5 例PD-TNBC 細(xì)胞進(jìn)行MTT 實(shí)驗(yàn)，檢測過表達(dá)miR-5688 組和過表達(dá)miR-5688 并轉(zhuǎn)染抑制劑組對細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果見表1，過表達(dá)miR-5688 組能夠顯著抑制MDA-MB-231 細(xì)胞和PD-TNBC 細(xì)胞的增殖作用，轉(zhuǎn)染抑制劑組則抑制作用不明顯。

表1 miR-5688 對MDA-MB-231 細(xì) 胞和PD-TNBC 細(xì)胞增殖的抑制率

圖1 miR-5688 與SREBP-1 mRNA 在TNBC 組織樣本中表達(dá)呈負(fù)相關(guān)趨勢

圖2 過表達(dá)miR-5688 能夠抑制MDA-MB-231 細(xì)胞中SREBP-1 的表達(dá)

Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖3、4），miR-5688能夠抑制MDA-MB-231 細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與侵襲作用；進(jìn)一步對5 例PD-TNBC 細(xì)胞的細(xì)胞轉(zhuǎn)移與侵襲作用進(jìn)行檢測，結(jié)果見表2，發(fā)現(xiàn)miR-5688 對這5例PD-TNBC 細(xì)胞也有類似的抑制作用。

圖3 miR-5688 能夠抑制MDA-MB-231 細(xì)胞的侵襲作用

圖4 miR-5688 能夠抑制MDA-MB-231 細(xì)胞的轉(zhuǎn)移作用

表2 miR-5688 對MDA-MB-231 細(xì)胞和PD-TNBC 細(xì)胞轉(zhuǎn)移與侵襲的抑制率

2.3 miR-5688能夠抑制PD-TNBC細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤作用

設(shè)置過表達(dá)miR-5688 組為MDA-MB-231 細(xì)胞和PD-TNBC 細(xì)胞轉(zhuǎn)染含miR-5688 全序列慢病毒載體，對照組為轉(zhuǎn)染含非特異序列miRNA 的慢病毒載體。將2 組細(xì)胞制成細(xì)胞懸液后經(jīng)皮下注射裸鼠皮下，經(jīng)過4 周生長后收集皮下腫瘤，結(jié)果如圖5 顯示，在MDA-MB-231 細(xì)胞中過表達(dá)miR-5688 能夠顯著抑制皮下腫瘤的生長，其體積和質(zhì)量的抑制率約為60%。

圖5 miR-5688 抑制MDA-MB-231 細(xì)胞在裸鼠皮下的成瘤作用

進(jìn)一步將5 例PD-TNBC 細(xì)胞種植于小鼠皮下，收集皮下腫瘤并計算質(zhì)量抑制率，結(jié)果如表3，miR-5688 在5 例PD-TNBC 細(xì)胞 中同 樣 具有 在裸鼠體內(nèi)的成瘤作用。

3 討論

SREBP-1 是惡性腫瘤細(xì)胞脂類合成代謝的主要調(diào)控樞紐，一方面介導(dǎo)脂肪酸合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄以促進(jìn)細(xì)胞中的脂類積累[3-5]，另一方面能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對葡萄糖的攝取作用（葡萄糖作為脂肪酸合成的原料），最終影響腫瘤組織局部的微環(huán)境。SREBP-1 在肝臟腫瘤中的報道較多，在乳腺癌中的報道較少。本研究表明，SREBP-1 在TNBC 組織中的表達(dá)高于癌旁組織中，利用miR-5688 下調(diào)SREBP-1 的表達(dá)能夠抑制PD-TNBC 細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移與侵襲作用。除SREBP-1 外，SREBP 蛋白家族還有另一成員，即類固醇、類固醇類激素代謝的調(diào)控樞紐SREBP-2[10]。乳腺癌的發(fā)生進(jìn)展與內(nèi)分泌系統(tǒng)、類固醇類激素密切相關(guān)，因此今后進(jìn)行SREBP-2 的研究亦具有重要意義。miRNA 是一類RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的非編碼RNA，能夠通過序列特異性識別目標(biāo)基因mRNA的3'UTR，最終造成目標(biāo)基因的表達(dá)沉默[12]。在腫瘤中miRNA 的表達(dá)會出現(xiàn)變化，發(fā)現(xiàn)和鑒別癌基因、原癌基因的miRNA，利用miRNA 的病毒載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞能夠發(fā)揮抗腫瘤的作用。本研究不僅使用了MDA-MB-231 這一TNBC 的常用腫瘤模型，也使用了患者來源的腫瘤細(xì)胞系，這不僅有助于TNBC 相關(guān)研究，也能夠?yàn)榻窈髮?shí)現(xiàn)更為有效的TNBC 治療策略提供參考。

表3 miR-5688 對MDA-MB-231 細(xì)胞和PD-TNBC 細(xì)胞在裸鼠皮下成瘤的質(zhì)量抑制率