鄧玲艷 岳道遠(yuǎn) 李輝軍*

基質(zhì)金屬蛋白酶是一組鋅離子依賴性的蛋白水解酶家族,是細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)降解及重構(gòu)的重要介質(zhì),在人類至少25種已被識別和定性,其中以基質(zhì)金屬蛋白酶-3(matrix metalloproteinase-3,MMP-3)最為重要[1-3].MMP-3主要產(chǎn)生于滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞,其特異性基質(zhì)是構(gòu)成軟骨的蛋白多糖,已有許多文獻(xiàn)報道MMP-3與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)[4-9].

目前,基于全自動生化分析儀器的MMP-3定量檢測試劑盒可應(yīng)用于臨床檢測.2006年原國家衛(wèi)生部頒布的《醫(yī)療機構(gòu)臨床實驗室管理辦法》中明確要求,臨床實驗室在某一檢測項目正式用來檢測患者標(biāo)本、發(fā)出檢驗報告前,實驗室需對其相關(guān)方法學(xué)分析性能進(jìn)行評價.為此,本研究根據(jù)文獻(xiàn)和國內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)和指南的要求,評價積水公司的MMP-3定量檢測試劑盒在實驗室使用MODULAR P800型全自動生化分析系統(tǒng)的性能.

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源

采集2016年1-10月間華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院的130名表觀健康體檢者血清標(biāo)本,其中男性和女性各65名.

1.2 儀器與試劑

羅氏MODULAR P800型全自動生化分析儀(瑞士Roche公司);MMP-3定量檢測試劑盒及配套校準(zhǔn)品、質(zhì)控品(日本積水公司);干擾物A-PLUS(日本SYSMEX公司).

1.3 實驗方法

全自動生化分析儀在性能評價前均按制造商要求經(jīng)過功能校準(zhǔn),各項性能指標(biāo)符合儀器廠商申明的性能要求,每日按指定的標(biāo)準(zhǔn)化操作程序進(jìn)行維護(hù)保養(yǎng)和操作.實驗人員均經(jīng)過相應(yīng)的培訓(xùn),熟悉儀器的操作和整個性能評價實驗方案.在性能評價期間,室內(nèi)質(zhì)控品檢測結(jié)果合格后再進(jìn)行各項實驗.

1.4 驗證與評價方案

1.4.1 精密度評價

參照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化研究所協(xié)會(clinical and laboratory standards institute,CLSI)EP5-A2標(biāo)準(zhǔn)[10]選取低值和高值2個濃度的質(zhì)控品(批號MJ0251),標(biāo)示濃度分別為(30±5)ng/ml和(160±25)ng/ml,按標(biāo)本檢測程序先在1 d內(nèi)連續(xù)測定20次,然后每日測定1次,連續(xù)20 d,分別計算日內(nèi)和日間均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù).將結(jié)果與試劑說明書不精密度數(shù)據(jù)進(jìn)行比較,如果日內(nèi)和日間不精密度均小于廠商數(shù)據(jù)指標(biāo),則精密度驗證通過.

1.4.2 準(zhǔn)確度評價

由于目前國內(nèi)MMP-3尚無公認(rèn)的有證參考物質(zhì),也無室間控制品來評估準(zhǔn)確度.因此,參照CLSI EP15-A2標(biāo)準(zhǔn)[11]和畢波等[12]的報道,采用復(fù)測不同批號校準(zhǔn)品計算偏差的方式進(jìn)行準(zhǔn)確度驗證實驗.即采用批號為815RLM(EXP:2016年10月)的校準(zhǔn)品校準(zhǔn)檢測系統(tǒng)后,對另一批號為816RBN(EXP:2017年1月)的校準(zhǔn)品進(jìn)行檢測,計算檢測結(jié)果與標(biāo)示值的偏差,并與實驗室規(guī)定的允許偏差進(jìn)行比較,如果偏差小于實驗室的允許偏差,則該項目準(zhǔn)確度符合要求.檢測項目的允許偏差可來源于CLIA'88、基于生物學(xué)變異的技術(shù)規(guī)范、專業(yè)指南等文件,如果上述文件中都未規(guī)定該檢測項目的允許偏差,可基于該項目當(dāng)前所能達(dá)到的技術(shù)性能[13].

1.4.3 測量范圍評價

參照CLSI EP6-A2標(biāo)準(zhǔn)[14]在試劑說明書的線性范圍兩端選取低濃度和高濃度兩個標(biāo)本各1份,命名為低濃度標(biāo)本(L)和高濃度標(biāo)本(H),然后將L和H按照5 L、4 L+H、3 L+ 2 H、2 L+3 H、1 L+4 H和5 H配成6個濃度的系列標(biāo)本.每個標(biāo)本重復(fù)檢測2次,記錄結(jié)果并計算線性回歸方程和相關(guān)性系數(shù)r2,若r2>0.995,則表明線性關(guān)系良好,可接受廠商的分析測量范圍.通過用低濃度標(biāo)本稀釋檢測結(jié)果高于分析測量范圍標(biāo)本的方式,配制成合適濃度的標(biāo)本用于評價實驗.通常,配制好的高值標(biāo)本應(yīng)高于分析測量范圍上限的90%.

1.4.4 檢出能力評價

對于非配套檢測系統(tǒng),應(yīng)根據(jù)CLSI EP17-A2指南[15]的要求來確立其檢出能力,包括空白檢出限(LoB)、檢出限(LoD)和定量檢出限(LoQ)等相關(guān)參數(shù).選擇制造商給出的測量范圍下限10 ng/ml作為其LoQ進(jìn)行驗證.根據(jù)CLSI EP17-A2指南,選擇僅基于不精密度目標(biāo)的LoQ驗證方式,采用CLSIEP15-A2不精密度驗證指南,選取接近LoQ濃度的2個低值標(biāo)本,用標(biāo)記濃度為0的校準(zhǔn)品對標(biāo)本進(jìn)行稀釋至LoQ附近;對這2個標(biāo)本進(jìn)行連續(xù)4 d檢測,每日重復(fù)測定5次,總計獲得20個有效數(shù)據(jù)計算不精密度,所有檢測在一個試劑批號內(nèi)完成,如果有離群數(shù)據(jù)需刪除后補足.若20個標(biāo)本檢測數(shù)據(jù)的不精密度小于制造商指標(biāo),LoQ驗證通過.

1.4.5 臨床可報告范圍評價

臨床可報告范圍是指患者標(biāo)本經(jīng)稀釋、濃縮或其他處理后,向臨床所能報告的結(jié)果范圍.選取高值標(biāo)本3份,應(yīng)有1份標(biāo)本濃度接近分析測量范圍上限1600 ng/ml(至少應(yīng)高于分析測量范圍上限的90%).將樣本通過建議的5倍稀釋倍數(shù)通過儀器自動以生理鹽水稀釋后檢測2次取均值,將均值乘以稀釋倍數(shù)來計算回收率,回收率為90%~110%,則驗證稀釋可靠,可以將線性范圍上限乘以稀釋倍數(shù)直接作為該項目的臨床可報告范圍的上限.

1.4.6 生物參考區(qū)間驗證評價

參照國家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《臨床實驗室檢驗項目參考區(qū)間的制定》(WS/T402-2012)[16]分別選擇成年表觀健康體檢者男性、女性各65名,除了風(fēng)濕、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松、肝腎功能、血糖、血脂、血常規(guī)、血沉及C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)等檢測指標(biāo)以外均正常;相對較大樣本數(shù)量來對試劑盒說明書中的生物參考區(qū)間進(jìn)行驗證,驗證結(jié)果應(yīng)該具有較大的參考價值.若≤5%的結(jié)果超出聲明的參考區(qū)間,則驗證通過,可以采用說明書中的生物參考區(qū)間.

1.4.7 分析干擾能力評價

(1)分析干擾能力.分析干擾是影響檢測方法準(zhǔn)確性的關(guān)鍵因素,要準(zhǔn)確識別和評價臨床檢測中各種干擾因素對測定結(jié)果的影響相當(dāng)困難,一般對于配套檢測系統(tǒng),可以直接引用制造商的抗干擾能力聲明,但對于非配套檢測系統(tǒng),應(yīng)對常見的干擾因素如膽紅素、血紅蛋白及乳糜顆粒對測定結(jié)果的干擾進(jìn)行初步評價.本實驗室依據(jù)CLSI EP7-A2指南[17]的建議,采用添加外源性干擾物的方式來進(jìn)行MMP-3抗干擾性能的評估,購買日本Sysmex公司A PLUS系列干擾物,標(biāo)示濃度分別是膽紅素F 20 mg/dl(游離型),膽紅素C 20 mg/dl(結(jié)合型),溶血血紅蛋白50 mg/dl,乳糜2000 FTU(福爾馬肼濁度)的干擾物和對應(yīng)的空白液.將溶解好的干擾物和空白液分別與相同的標(biāo)本按比例混合,制成不同稀釋比例的標(biāo)本進(jìn)行檢測,判斷其受干擾的程度.

(2)操作方法.①將試劑盒中的干擾物和對照空白液分別按要求用純化水溶解好備用;②將溶解好的干擾物1.0 ml與9.0 ml基礎(chǔ)標(biāo)本混合制成標(biāo)本A,將溶解后的空白液1.0 ml與同樣的9.0 ml基礎(chǔ)標(biāo)本混合制成標(biāo)本B,標(biāo)本A為干擾標(biāo)本,標(biāo)本B為對照標(biāo)本;③將標(biāo)本A和標(biāo)本B配制成不同稀釋比例的標(biāo)本,其中標(biāo)本A:標(biāo)本B=0:1的標(biāo)本為對照標(biāo)本,其他為干擾標(biāo)本,重復(fù)檢測2次取均值,并計算干擾標(biāo)本和對照標(biāo)本間的偏差,以此偏差作為干擾值;④以干擾值≤±10%作為是否存在明顯干擾的判定標(biāo)準(zhǔn);⑤干擾值(%)=(干擾標(biāo)本測定值-對照標(biāo)本測定值)÷對照標(biāo)本測定值X100%.配制不同稀釋比例的干擾標(biāo)本見表1.

表1 不同稀釋比例干擾標(biāo)本配置

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)處理均采用Microsoft office EXCEL 2007完成.

2 結(jié)果

2.1 不精密度評價實驗

低值和高值2個濃度水平的MMP-3質(zhì)控品日內(nèi)不精密度分別是4.6%和1.2%,日間不精密度分別是5.8%和2.3%,均低于廠商的不精密度指標(biāo),見表2.

表2 不精密度評價實驗結(jié)果

2.2 準(zhǔn)確度評價實驗

廠商說明書的準(zhǔn)確度性能指標(biāo)為±20%,采用廠商聲明的1/2作為實驗室允許偏差.采用批號為815RLM的校準(zhǔn)品校準(zhǔn)檢測系統(tǒng)后,對另一批號為816RBN的校準(zhǔn)品進(jìn)行檢測,重復(fù)檢測3次計算均值.對應(yīng)的5個不同濃度校準(zhǔn)品檢測結(jié)果均值與標(biāo)示值的偏差為0.2%~2.3%,均低于實驗室規(guī)定的允許偏差,見表3.

2.3 測量范圍分析評價

以配制好的標(biāo)本的實測均值為Y,預(yù)期值為X,計算線性回歸方程Y=bX+a.根據(jù)實驗數(shù)據(jù)可以得出線性回歸方程為Y=1.03X+5.7,r2=0.9921.相關(guān)性系數(shù)r2>0.975,直線回歸方程b為0.97~1.03,數(shù)據(jù)組呈線性關(guān)系.驗證的MMP-3分析測量范圍為10.65~1498.05 ng/ml,與試劑說明書指標(biāo)的10~1600 ng/ml接近,可以接受制造商聲明的分析測量范圍,見表4.

表3 準(zhǔn)確度評價實驗結(jié)果

表4 測量范圍數(shù)據(jù)分析(ng/ml)

2.4 檢出能力評價

試劑說明書聲明不精密度目標(biāo)為10%,聲明的測量范圍下限為10 ng/ml.對2個濃度在10 ng/ml附近的標(biāo)本進(jìn)行連續(xù)4 d檢測,每日重復(fù)5次,計算其不精密度均小于說明書指標(biāo)的10%,LoQ驗證通過,檢出能力驗證數(shù)據(jù)見表5.

表5 檢出能力驗證數(shù)據(jù)(ng/ml)

2.5 臨床可報告范圍評價

將3份高值標(biāo)本以儀器5倍自動稀釋檢測2次后取均值,結(jié)果與原始濃度對比,計算回收率,以回收率為90%~110%之間判定為合格.檢測3份標(biāo)本的稀釋回收率均合格,臨床可報告范圍為10~8000 ng/ml,見表6.

表6 臨床可報告范圍評價結(jié)果

2.6 生物參考區(qū)間評價

MMP-3試劑說明書聲明的生物參考區(qū)間為男性36.9~121.1 ng/ml,女性17.3~59.7 ng/ml,在表觀健康體檢者檢測結(jié)果中,僅女性組有2名超出說明書指標(biāo)的范圍,占所有女性組65名體檢者的3.1%,而男性組65名結(jié)果全部在說明書的范圍內(nèi),驗證合格,可接受廠商指標(biāo)的生物參考區(qū)間.

2.7 分析干擾能力評價

通過添加系列濃度的外源性干擾物對臨床常見的膽紅素F、膽紅素C、血紅蛋白和乳糜4種干擾物對MMP-3檢測試劑盒的干擾性能評價,以干擾值<10%作為評價標(biāo)準(zhǔn),實驗結(jié)果在游離膽紅素濃度<20 mg/dl、結(jié)合膽紅素濃度<20 mg/dl、血紅蛋白<500 mg/dl以及乳糜<2000 FTU時對檢測結(jié)果的影響較小,干擾值均低于10%,見表7~10.

表7 干擾物膽紅素F干擾試驗結(jié)果

表8 干擾物膽紅素C干擾試驗結(jié)果

表9 干擾物溶血血紅蛋白干擾試驗結(jié)果

表10 干擾物乳糜干擾試驗結(jié)果

3 討論

隨著我國衛(wèi)生事業(yè)的發(fā)展,國內(nèi)檢驗醫(yī)學(xué)在近20年來取得了長足的進(jìn)步.當(dāng)前國際主流的檢測設(shè)備、體外診斷試劑盒等基本是同步應(yīng)用于許多國內(nèi)大中型醫(yī)院實驗室,與此形成鮮明對比的是在實驗室質(zhì)量管理上與國外先進(jìn)實驗室仍存在不小的差距.在美國,《臨床實驗室改進(jìn)法規(guī)修正案》(CLIA'88)[18]的頒布和不斷修訂,對實驗室的檢測質(zhì)量起到了很好的管理和指導(dǎo)作用,其明確規(guī)定了在應(yīng)用于患者常規(guī)報告結(jié)果之前,實驗室要對檢測系統(tǒng)的主要分析性能如不精密度、準(zhǔn)確度、分析測量范圍/臨床可報告范圍等進(jìn)行評價.2006年原國家衛(wèi)生部頒布《醫(yī)療機構(gòu)臨床實驗室管理辦法》,作出同樣規(guī)定以保證國內(nèi)實驗室的檢測質(zhì)量.近10年來,隨著ISO15189實驗室認(rèn)可在國內(nèi)日益受重視,廣大實驗室工作人員也對方法學(xué)性能評價有了更多的關(guān)注和認(rèn)識.檢測系統(tǒng)的分析性能滿足當(dāng)前臨床要求是開展實驗室質(zhì)量管理工作的根本保障,因此在選擇和應(yīng)用新的檢測方法之前,應(yīng)按要求對其進(jìn)行方法學(xué)性能評價,以確認(rèn)是否能滿足臨床檢測的要求.

本研究依據(jù)當(dāng)前系列行業(yè)指南[10-11,14-17]和文獻(xiàn)報道,對MMP-3檢測系統(tǒng)的不精密度、準(zhǔn)確度、分析測量范圍、檢出能力、臨床可報告范圍、生物參考區(qū)間以及對膽紅素、溶血血紅蛋白、乳糜顆粒等常見干擾物抗干擾能力進(jìn)行了初步的評價.實驗結(jié)果表明,本檢測系統(tǒng)日內(nèi)和日間不精密度均小于試劑說明書聲明的10%.準(zhǔn)確度評價實驗因為當(dāng)前MMP-3檢測無公認(rèn)的參考物質(zhì)和參考測量程序,也無合適的室間質(zhì)量評價材料,所以采用類似校準(zhǔn)驗證的方式來進(jìn)行,依據(jù)當(dāng)前技術(shù)水平采用說明書聲明的準(zhǔn)確度性能的1/2來作為評價標(biāo)準(zhǔn),偏差在允許范圍內(nèi).分析測量范圍、檢出能力的評價結(jié)果表明,可以接受廠商指標(biāo)的10~1600 ng/ml作為本方法的分析測量范圍.同時通過稀釋倍數(shù)驗證實驗結(jié)果證明可以將高值標(biāo)本進(jìn)行5倍稀釋檢測,從而將臨床可報告范圍拓展至10~8000 ng/ml.在表觀健康體檢者中,65名男性結(jié)果全部在說明書指標(biāo)的范圍內(nèi),而65名女性中只有2名超出,驗證合格.干擾試驗結(jié)果表明,游離膽紅素濃度<20 mg/dl、結(jié)合膽紅素濃度20 mg/dl、血紅蛋白<500 mg/dl以及乳糜<2000 FTU時對檢測結(jié)果影響輕微.

本研究實驗驗證了MMP-3檢測試劑盒在MODULAR P800型全自動生化分析儀上性能滿足或高于試劑說明書指標(biāo),可以應(yīng)用于臨床.本研究中采用的評價方法,對基層實驗室工作具有一定的參考意義.