曹 祥 韋 偉 黃曉燕 羊 玲

彌漫性大B細胞淋巴癌(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)是源于在淋巴造血系統(tǒng)的惡性腫瘤的總稱.淋巴癌是一種高度異質性疾病,患者初期表現(xiàn)為無痛性淋巴腫大,并累及多個器官[1-2].當前,我國青少年DLBCI發(fā)病率不斷上升,探索新的預后分層方法和個體化差異對于治療淋巴癌是一種新的嘗試,其目的在于增加淋巴癌臨床療效,對于淋巴癌患者的生存具有重要意義.Wnt信號是由多個Wnt配體、多個跨膜受體(Frizzled,FZD)組成,而β-連環(huán)蛋白(β-catenin)是其中主要效應因子,當Wnt蛋白與受體結合時可以加強β-catenin(Wnt/β-catenin)的穩(wěn)定性.在淋巴癌細胞組織中,Wnt/β-catenin因子的活性比在正常人群的淋巴細胞中含量明顯增多,其在淋巴細胞發(fā)育及多種惡性血液病中也具有重要作用[4-6].微小RNA-34a(microRNA-34a,miR-34a)是一大類miRNA腫瘤抑制基因,其作用在于能夠縮短腫瘤細胞的存活和周期,目前已在臨床試驗中作為抗癌治療藥物之一[7-8].miR-34廣泛存在多種生物體內,可以靶向調節(jié)淋巴癌細胞凋亡和周期阻滯,還可以抑制上皮間質轉化,導致淋巴癌細胞周期縮短、衰老及死亡.本研究通過觀察miR-34a靶向調控Wnt/β-catenin信號對小兒淋巴癌細胞凋亡的機制研究.

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

淋巴癌細胞株A554和正常淋巴細胞株11-ZAD[美國模式培養(yǎng)物集存庫(American type culture collection,ATCC)];Wnt/β-catenin培養(yǎng)基和胎牛血清(上海優(yōu)予生物科技有限公司);miR-34a、miR-34a抑制物(miR-34a inhibito)(北京孚博生物科技有限公司);RNA-iMAX(上海斯信生物科技有限公司);免疫組化試劑盒(赫澎上海生物科技有限公司);Wnt/β-catenin抑制基因試劑(美國BD公司);BD FACSCanto Ⅱ型流式細胞儀(北京安麥格貿易有限公司);Getein1100型免疫熒光檢測儀(南京基蛋生物科技股份有限公司);Western blot ZY5型電泳儀(北京君意東方電泳設備有限公司).

1.2 淋巴細胞培養(yǎng)與實驗分組

將淋巴癌細胞株A554和正常淋巴細胞株11-ZAD分別進行溶液配置,對淋巴癌株A554細胞和正常淋巴11-ZAD加入濃度為80 mol/L的紅霉素和青霉素(100 U/m),放入12%胎牛血清的完全培養(yǎng)基(25 mmol/L).在37.5 ℃條件下培養(yǎng)24 h,更換培養(yǎng)基24 h一次,當淋巴癌株A554和正常淋巴細胞株11-ZAD融合度達到90%時取生長期細胞進行實驗.

將淋巴癌細胞株A554實驗分為3組:①淋巴癌細胞轉染miR-34a模擬物(mimics)組(miR-34a mimics組);②淋巴癌細胞組;③淋巴癌細胞轉染miR-34a抑制物(inhibitor)組(miR-34a inhibitor組).

1.3 淋巴癌細胞株A554轉染

采用轉染試劑RNAiMAX試劑盒,按照說明書所述方法將miR-34a mimics和miR-34a inhibitor各30 pmol/ml,分別與RNAiMAX轉染試劑混合制備復合物,置于室溫放置5 min.將有機復合物加入細胞中轉染48 h,每組設置復孔2個以上,更換正常培養(yǎng)基進行后續(xù)分析,當淋巴癌細胞株A554濃度達到40%~50%時,利用miR-34a mimics、miR-34a inhibitor和陰性對照(negative control,NC)轉染到A549細胞株中,4 h后將培養(yǎng)液換為含有8%血清的高糖培養(yǎng)基(dulbecco's modified eagle medium,DMEM)培養(yǎng)48 h,隨后按照RNAiMA操作說明配制樣品,收集實驗后的淋巴癌細胞.

1.4 免疫組化檢測

將各組淋巴癌細胞株中的分泌型糖蛋白(Dickkopf-1,DKK1)和Wnt抑制因子1(wnt inhibitory factor-1,WIF-1)蛋白進行檢測,注入2%甲醛中固定過24 h,脫水且涂上石蠟連續(xù)切片,切成長寬高為(1.5X1.5X1.5)μm塊狀.誘導24 h、48 h作為實驗組,采用Masson法觀察miR-34a細胞株中的膠原進行沉積,采用蘇木精-伊紅(hematoxylin eosin,HE)染色法檢測3組DKK1、WIF-1和miR-34a活性.

1.5 流式細胞儀檢測

將各組淋巴癌細胞以2X106個/ml濃度置于6孔板,培養(yǎng)24 h,用0.25%胰蛋白酶消化細胞,用冷的70%的乙醇固定,于4 ℃放置1 d后離心5 min倒掉上清液,用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)洗滌5 min,重復3次,在37 ℃無光照下染色30 min,采用流式細胞儀分析淋巴癌細胞凋亡程度.

1.6 Western blot檢測

在6孔板中加入100 μg的胰蛋白酶提取液,注入3 ml的培養(yǎng)基停止消化,將細胞提取液放入微量離心(eppendorf,EP)管中,并與胰蛋白酶提取液按照1∶100進行混合,再放入冰箱中冷凍10 min,使細胞完全裂變成為E溶液,在EP管中放入一株淋巴癌細胞組織,并按照1∶100比例加入胰蛋白酶提取液3 ml,使細胞完全裂變成為F溶液,再將E溶液和F溶液以80∶1的體積進行搖勻,配制成工作液放入37.5 ℃的保溫箱中20 min,冷卻后計算Wnt/β-catenin蛋白的濃度水平.

1.7 免疫熒光檢測

將淋巴癌細胞以5X104/ml濃度水平置于12孔板中(有蓋玻片),用4%多聚甲醛固定10 min,PBS洗滌;用0.5%非離子表面活性劑(Triton)處理10 min,用PBS洗滌,用濃度為3%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)封閉1 h后用PBS洗滌,培育24 h,用PBS洗滌3次,加入羊抗小鼠IgG Alexa Flour488(1∶200)在室溫、無光的條件下培育1 h,用PBS洗滌3次后加入4,6-二乙?；?2-苯基癸酸酯(4,6-diacetyl-2-phenyl decanoate)在室溫、無光的條件下染色10 min,用PBS洗滌2次后將蓋玻片移到載玻片上,用抗熒光衰減封片劑封片,放置于熒光顯微鏡下觀察.

1.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS21.0分析所有數(shù)據(jù),3組淋巴癌細胞的DKK1、WIF-1、Wnt/β-catenin蛋白表達及凋亡情況的差異性采用卡方檢驗,組間數(shù)據(jù)比較采用單因素分析,計量資料用均數(shù)±標準差(±s))表示,以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義.

2 結果

2.1 miR-34a在淋巴癌細胞株A554和正常淋巴細胞株11-ZAD中的表達

在淋巴癌細胞組中,miR-34a表達明顯低于正常淋巴細胞,差異有統(tǒng)計學意義(t=9.517,P<0.01),見圖1.

圖1 miR-34a的活性表達

2.2 免疫組化檢測DKK1和WIF-1的活性

miR-34a mimics組淋巴癌細胞中DKK1和WIF-1的活性表達均高于淋巴癌細胞組,差異有統(tǒng)計學意義(t=7.455,t=8.233,P<0.01);淋巴癌細胞組淋巴癌細胞中DKK1和WIF-1的活性表達均高于miR-34a inhibitor組,差異有統(tǒng)計學意義(t=8.449,t=9.233,P<0.01),見圖2和圖3.

圖2 三組淋巴癌細胞DKK1和WIF-1蛋白活性(X400)

圖3 三組淋巴癌細胞DKK1和WIF-1蛋白表達

2.3 流式細胞儀檢測miR-34a對淋巴癌細胞的凋亡影響

miR-34a mimics組、淋巴癌細胞組和miR-34a inhibitor組的淋巴癌細胞凋亡率分別為49.82%、35.77%和22.49%.miR-34amimics組的淋巴癌細胞凋亡最強,淋巴癌細胞組的淋巴癌細胞與miR-34amimics組相比,細胞凋亡速度減弱,差異有統(tǒng)計學意義(x2=5.383,P<0.01);miR-34a inhibitor組淋巴癌細胞凋亡最慢,與miR-34amimics組和淋巴癌細胞組比較,差異有統(tǒng)計學意義(x2=13.248,x2=10.076;P<0.01),提示其增值明顯受到miR-34a的影響,miR-34a表達越高淋巴癌細胞凋亡越快,見圖4和圖5.

圖4 三組淋巴癌細胞凋亡情況

圖5 三組淋巴癌細胞凋亡率比較

2.4 Western blot檢測淋巴癌細胞中 Wnt/β-catenin蛋白濃度

在Western blot檢測中,miR-34a mimics組淋巴癌細胞中Wnt蛋白和β-catenin蛋白濃度水平明顯少于淋巴癌細胞組,差異有統(tǒng)計學意義(t=13.483,t=16.489;P<0.01);淋巴癌細胞組的Wnt蛋白和β-catenin蛋白濃度水平明顯少于miR-34a inhibitor組,差異有統(tǒng)計學意義(t=5.628,t=7.853,P<0.01),見圖6和圖7.

圖6 三組淋巴癌細胞中Wnt/β-catenin蛋白表達

圖7 三組淋巴癌細胞中Wnt/β-catenin蛋白相對表達量

2.5 免疫熒光法檢測淋巴癌細胞中Wnt/β-catenin蛋白表達

在免疫熒光法檢測中,miR-34a mimics組淋巴癌細胞中的Wnt蛋白和β-catenin蛋白表達明顯低于淋巴癌細胞組,差異有統(tǒng)計學意義(t=6.479,t=7.459;P<0.05);淋巴癌細胞組淋巴癌細胞中Wnt蛋白和β-catenin蛋白表達顯著低于miR-34a inhibitor組,差異有統(tǒng)計學意義(t=8.239,t=7.689;P<0.05),見圖8和圖9.

圖8 三組淋巴癌細胞中Wnt/β-catenin蛋白活性

圖9 三組淋巴癌細胞中Wnt/β-catenin蛋白表達量

3 討論

2008年,世界衛(wèi)生組織將淋巴癌規(guī)劃為需要化療的由B細胞引發(fā)的腫瘤疾病,起源于生發(fā)中心濾泡輔助T細胞,具有特殊的生物學特征及臨床表現(xiàn),其特點在于具有較強的侵襲性生長特性,常常發(fā)生于青少年,預后較差,分為原發(fā)性和進展性[9-11]兩種形式.各種類型的亞基在臨床上都具有治療難度大、復發(fā)率高、預后差的特征,目前是醫(yī)學界的難題[12-13].針對于淋巴瘤的發(fā)病機制目前仍未明確,所以進一步了解淋巴癌的發(fā)病機制和突破點尤為重要.

本研究結果顯示,在淋巴癌細胞當中,miR-34a的活性明顯低于正常淋巴細胞.miR-34a mimics組、淋巴癌細胞組和miR-34a inhibitor組的淋巴癌細胞凋亡率分別為49.82%、35.77%和22.49%,表明淋巴癌細胞凋亡明顯受到miR-34a干預的影響,miR-34a表達越高淋巴癌細胞凋亡越快.miR-34a在腫瘤細胞組織的生長和發(fā)展過程中具有重要作用,其缺失或者凋亡可能是癌細胞生存和發(fā)育的最大優(yōu)勢.免疫組化法中觀察淋巴癌細胞中的DKK1和WIF-1的活性結果顯示,在miR-34a mimics組淋巴癌細胞中DKK1和WIF-1活性表達均高于淋巴癌細胞組,淋巴癌細胞組DKK1和WIF-1活性表達均高于miR-34a inhibitor組.DKK1和WIF-1因子其為抑癌基因,與腫瘤發(fā)生、發(fā)展有著密切聯(lián)系,在淋巴癌細胞形成和生長過程起負調控作用,DKK1和WIF-1能夠使癌癥內信號因子磷酸化,使其在細胞漿內被水解,被水解的主要原因在于炎性受體Lrp5結合形成多聚體復合物在其中發(fā)揮作用,該過程阻斷炎癥信號通路的正常傳導,阻礙癌癥內信號分子進入細胞核.Khalili等[14]和Kandimalla等[15]的研究表明,在淋巴癌疾病中,DKK1和WIF-1可以增加對淋巴癌中炎性因子抑制作用,修復被破壞的細胞活性,失去活性凋亡,對淋巴癌細胞起破壞作用.

Western blot方法檢測Wnt/β-catenin蛋白濃度,其結果顯示miR-34a mimics組淋巴癌細胞Wnt/β-catenin蛋白濃度明顯低于淋巴癌細胞組,淋巴癌細胞組淋巴癌細胞Wnt/β-catenin蛋白濃度顯著組低于miR-34a inhibitor組,在免疫熒光檢測Wnt/β-catenin蛋白表達結果顯示:miR-34a mimics組淋巴癌細胞中Wnt/β-catenin信號活性表達明顯低于淋巴癌細胞組和miR-34a inhibitor組,淋巴癌細胞組的活性低于miR-34a inhibitor組.Wnt信號是機體內重要的轉導通路,一是經(jīng)典的Wnt信號;二是非經(jīng)典的Wnt信號通路,能夠促進細胞的生長、分化和發(fā)育[4,16].經(jīng)典Wnt信號通路即Wnt/β-catenin,也是一種生物學行為的關鍵信號通路,在細胞中具有增殖、分化、遷移以及侵襲的特點[17-19].過度的激活與多種惡性腫瘤的發(fā)生密切相關,在許多淋巴癌癌細胞中可檢測到Wnt和β-catenin,而在無癌的淋巴組織中含量明顯減少或者無法檢測.Cao等[20]和Ping等[21]研究發(fā)現(xiàn),在急性淋巴癌患者組織細胞標本中有WNT信號的表達,并且在受到外界刺激時在細胞核中有觀察到β-catenin的增多,癌細胞的活性和周期都明顯增加.因此,Wnt/β-catenin信號的活性增強時,可以加速對淋巴癌細胞組織的擴散及加重患者病情,與本研究結果相似.

miR-34a通過靶向抑制Wnt/β-catenin信號,促進DKK1和WIF-1活性表達,從而加速淋巴癌細胞凋亡,緩解小兒淋巴癌病癥.