白 海，董潤宇，趙 軻， 陳利東

（1.山西大同大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西大同 037009；2.山西大同大學(xué)設(shè)施農(nóng)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心，山西大同 037009）

枯草芽孢桿菌是一種容易保存的好氧型革蘭氏陽性桿狀菌，無毒無害，在極端的條件下，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生抗逆性很強(qiáng)的內(nèi)生孢子；因其含有芽孢，故抗熱能力非常強(qiáng)，在60℃高溫下可以長期保持活性，耐高溫、耐酸堿、耐擠壓；對(duì)提高動(dòng)物的免疫力也有一定的作用（秦瑤，2014）。邵麗瑋等（2015）發(fā)現(xiàn)，在LB液體培養(yǎng)基中分別添加4 mg/mL菊糖、2.4 mg/mL果寡糖、0.4 mg/mL黃芪多糖和0.8 mg/mL白術(shù)多糖后，枯草芽孢桿菌達(dá)到很好的增殖效果，其中添加量為0.8 mg/mL白術(shù)多糖對(duì)枯草芽孢桿菌的增殖效果最好。黃建燁等（2012）研究發(fā)現(xiàn)，果寡糖（FOS）與枯草芽孢桿菌和非淀粉多糖酶制劑聯(lián)用對(duì)廣西黃羽肉雞種雞的產(chǎn)蛋質(zhì)量和增進(jìn)健康的效果要優(yōu)于單獨(dú)使用。朱沛霽等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌 048（BS048）和果寡糖的聯(lián)用，不僅能夠降低雪山草雞小腸食糜黏度，還可以增強(qiáng)其腸道的消化功能，促進(jìn)盲腸中揮發(fā)性脂肪酸（VFA）的產(chǎn)生，維持和改善雪山草雞的健康狀況，從而提高其生長性能；廉俊紅（2016）研究也有類似的結(jié)果。本試驗(yàn)比較了香蕉多糖、山楂多糖和菊糖對(duì)枯草芽孢桿菌增殖效果的影響，從而準(zhǔn)確的篩選出植物多糖對(duì)枯草芽孢桿菌的最適宜添加量，以期為以后設(shè)計(jì)良好的合生元產(chǎn)品提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料 枯草芽孢桿菌由微生物實(shí)驗(yàn)室保存提供；香蕉多糖和山楂多糖購自蘭州沃特萊斯生物科技有限公司（純度都為50%）；菊糖購自九芹健康養(yǎng)生館（純度92%）。

1.2 試驗(yàn)儀器 恒溫?fù)u床GW-D（國旺儀器）；紫外分光光度計(jì)UV-1200（上海譜達(dá)儀器）；超低溫冰箱（青島海爾公司）；立式壓力蒸汽滅菌器（江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司）；超凈工作臺(tái)等。

1.3 枯草芽孢桿菌生長曲線的繪制及最佳培養(yǎng)時(shí)間的確定 250 mL的錐形瓶中移入99 mL LB培養(yǎng)液和1 mL菌液，培養(yǎng)30 h（37℃，150 r/min的搖床培養(yǎng)箱）， 之后分別在第 0、2、4、6、8 、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30 h 取出部分菌液測量其OD值（600 nm），用紫外/可見分光光度計(jì)測量，繪制枯草芽孢桿菌的生長曲線并確定其最適宜培養(yǎng)時(shí)間。

1.4 確定3種植物多糖的最適宜添加量 將LB液體培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將提前制備好的菌液 加 入 添 加 量 為 5、10、15、20、25、30、40 mg/mL和50 mg/mL的山楂多糖溶液和香蕉多糖溶液，添加量為 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 mg/mL 和5.0 mg/mL的菊粉糖溶液中，接種量為5%（文宇婷，2012）。同時(shí)用不添加多糖溶液的LB液體培養(yǎng)基作對(duì)照。置于37℃、150 r/min搖床培養(yǎng)箱中開始培養(yǎng)，分別在第 3、4、5、6、7、8、9、10 h 時(shí)取出相應(yīng)的樣品，每個(gè)樣品三個(gè)重復(fù)，在600 nm紫外/可見分光光度計(jì)下測定其OD值。

1.5 比較3種植物多糖的增殖效果 將從1.4中篩選出來的三種植物多糖對(duì)促進(jìn)枯草芽孢桿菌增殖的最適宜添加量進(jìn)行比較，同時(shí)以LB液體培養(yǎng)基來作為對(duì)照。

1.6 數(shù)據(jù)處理 所有的結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，用Microsoft Excel軟件作圖和SPSS 20.0軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌生長曲線以及最適培養(yǎng)時(shí)間枯草芽孢桿菌在LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)（37℃、150 r/min 的搖床培養(yǎng)箱中）， 在第 0、2、4、6、8 、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30 h 時(shí) 測 量其OD值（紫外/可見分光光度計(jì)），測量的OD值見表1，根據(jù)表1得到的OD值繪制枯草芽孢桿菌的生長曲線（圖1）。

表1 枯草芽孢桿菌培養(yǎng)30 h所測的OD值

從表1和圖1中可見，枯草芽孢桿菌剛開始生長速度比較緩慢，從第2 h之后，生長速度持續(xù)加快，開始呈現(xiàn)對(duì)數(shù)增長，并在第6～8 h時(shí)到達(dá)生長速度的峰值。之后枯草芽孢桿菌的生長速度逐漸減慢，從穩(wěn)定期開始慢慢進(jìn)入衰亡期。結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌最適宜的培養(yǎng)時(shí)間是8 h。

圖1 枯草芽孢桿菌生長曲線圖

2.2 3種植物多糖對(duì)枯草芽孢桿菌生長性能的影響

2.2.1 香蕉多糖對(duì)枯草芽孢桿菌增殖情況的影響從圖2可知，不同添加量的香蕉多糖對(duì)枯草芽孢桿菌的增殖效果不同。添加量為50 mg/mL的香蕉多糖對(duì)枯草芽孢桿菌的增殖效果最好，其次是添加量為25 mg/mL的香蕉多糖；其他添加量從10 mg/mL到40 mg/mL的香蕉多糖對(duì)枯草芽孢桿菌的增殖效果依次升高。

圖2 香蕉多糖對(duì)枯草芽孢桿菌增殖情況的影響

2.2.2 山楂多糖對(duì)枯草芽孢桿菌增殖情況的影響 從圖3可知，添加量為5、10 mg/mL對(duì)枯草芽孢桿菌的增殖沒有效果，添加量為15 mg/mL可明顯促進(jìn)枯草芽孢桿菌增殖，然而當(dāng)添加量為20 mg/mL時(shí)又抑制了枯草芽孢桿菌的增殖。當(dāng)添加量為25 mg/mL及以上時(shí)，又可促進(jìn)枯草芽孢桿菌的增殖?？傮w上來說，添加量為15 mg/mL效果最好。

2.2.3 菊粉對(duì)枯草芽孢桿菌增殖情況的影響 從圖 4 可知， 添加量為 0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL 和2.5 mg/mL的菊粉對(duì)枯草芽孢桿菌的增殖都有一定的促進(jìn)作用，其中添加量為2.5 mg/mL的菊粉促進(jìn)效果最好。當(dāng)菊粉的質(zhì)量濃度超過2.5 mg/mL時(shí)，枯草芽孢桿菌的生長開始變得遲緩。

圖3 山楂多糖對(duì)枯草芽孢桿菌增殖情況的影響

圖4 菊粉對(duì)枯草芽孢桿菌增殖情況的影響

2.3 三種不同多糖對(duì)枯草芽孢桿菌增殖效果和成本的比較 如表2所示，經(jīng)折算，購買香蕉多糖的價(jià)格是每克0.282元、購買山楂多糖的價(jià)格是每克0.300元、購買菊粉的價(jià)格是每克0.082元；根據(jù)結(jié)果可知添加量為50 mg/mL的香蕉多糖、添加量為15 mg/mL的山楂多糖和添加量為2.5 mg/mL的菊粉對(duì)枯草芽孢桿菌的增殖效果很好，其中質(zhì)量濃度為15 mg/mL的山楂多糖對(duì)枯草芽孢桿菌增殖性能的影響效果是最好的，然而從成本上考慮，添加菊糖是最經(jīng)濟(jì)的。

表2 三種植物多糖的成本比較

3 討論

本試驗(yàn)通過繪制枯草芽孢桿菌的生長曲線圖，發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌的指數(shù)生長期是第2～10 h，在第8 h時(shí)枯草芽孢桿菌的生長達(dá)到峰值，從而確定枯草芽孢桿菌的最適宜培養(yǎng)時(shí)間。

文宇婷等（2012）報(bào)道，黃芪多糖-枯草芽孢桿菌合生元菌液的研制方法，最大限度地減少兩者的使用量；邵麗瑋等（2015）研究了白術(shù)多糖、黃芪多糖、菊糖和果寡糖對(duì)枯草芽孢桿菌的增殖效果，從而篩選出上述植物多糖的最適添加量。本試驗(yàn)選用香蕉多糖、山楂多糖和菊糖，其中香蕉多糖和山楂多糖是水果多糖，有多種生物活性（呂玲霞等，2016；沈建林等，2015），而菊糖還是優(yōu)良的水溶性膳食纖維，將枯草芽孢桿菌種子液中加入不同添加量的多糖溶液， 分別在第 3、4、5、6、7、8、9 h和第10 h測量其OD值并記錄其生長情況。發(fā)現(xiàn)香蕉多糖的添加量為50 mg/mL時(shí)，其OD值為0.822；山楂多糖的添加量為15 mg/mL時(shí)，其OD值為0.941；菊糖的添加量為2.5 mg/mL時(shí)，其OD值為0.861，而其枯草芽孢桿菌每OD的成本分別為 0.017153、0.004782、0.000238元， 而且這 3種多糖對(duì)枯草芽孢桿菌生長的影響幾乎都表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)和高濃度抑制，這種趨勢與李樹鵬（2005）的報(bào)道相一致。從成本考慮方面來說，添加菊糖對(duì)枯草芽孢桿菌的增殖效益最好。不同種類和混合比例的植物多糖聯(lián)合作用對(duì)于枯草芽孢桿菌的增殖效果的研究還鮮見報(bào)道，而這也是下一步試驗(yàn)所要研究的方向。

4 結(jié)論

在LB液體培養(yǎng)基中添加適宜香蕉多糖、山楂多糖和菊糖均可促進(jìn)枯草芽孢桿菌的增殖，而50 mg/mL的山楂多糖對(duì)枯草芽孢桿菌增殖性能的影響效果最好。