劉長風 李欣燕 賈春云

摘要：多環(huán)芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，簡稱PAHs）是由2個以上苯環(huán)連在一起的化合物，具有強烈的致癌、致畸、致突變作用，屬于持久性有毒有害有機污染物。由于胞外聚合物（extracellular polymeric substances，簡稱EPS）的成分性質(zhì)，EPS對PAHs有較高的降解效果。因而EPS在去除PAHs過程中的應用越來越受到重視。為研究芘對毛霉EPS產(chǎn)生的影響，分析比較不同濃度芘誘導后毛霉EPS的特征、生化成分和生物降解效果。用濃度梯度為0、10、20、40、80、120 mg/L的芘誘導毛霉，提取EPS進行表征及降解試驗。結(jié)果表明，隨著芘濃度的增加，毛霉EPS粉末表面松散程度增強，孔隙數(shù)量變多而且直徑變大;EPS的蛋白質(zhì)含量、多糖含量、類腐殖質(zhì)含量均逐漸增長，并且當芘濃度達到80 mg/L時，這些值均達到峰值（EPS提取量為1 561 mg/L，糖類含量為1 042 mg/L，蛋白質(zhì)含量為 562 mg/L，類腐殖質(zhì)含量為312 mg/L）。當芘濃度為120 mg/L時，毛霉EPS粉末又重新變成板結(jié)狀;EPS提取量和各種生化成分均減少，對芘的降解率也降低。與其他毛霉相比，以80 mg/L芘誘導后的毛霉EPS對芘有更強的生物降解能力。

關(guān)鍵詞：毛霉胞外聚合物;目標污染物芘;生物降解;特性分析;污染土壤修復

多環(huán)芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，簡稱PAHs）污染是世界各國所面臨的重大環(huán)境與公共健康問題之一，其對土壤的污染問題尤為突出[1]。PAHs污染土壤的修復是當前國內(nèi)外環(huán)境科學界的共同話題和主攻熱點。與物理、化學修復法相比，生物修復技術(shù)具有非破壞性、經(jīng)濟性和安全性等優(yōu)點，可廣泛應用于中低濃度大面積PAHs污染土壤的修復，近年來在國內(nèi)外引起廣泛關(guān)注[2-3]。其中，微生物修復技術(shù)應用最廣泛，主要是通過馴化土著微生物或人為投加外源微生物對土壤中PAHs進行轉(zhuǎn)化、降解與去除[4]。微生物降解多環(huán)芳烴已成為最主要的多環(huán)芳烴污染土壤的修復技術(shù)。具有PAHs降解能力的細菌較多，如芽孢桿菌屬（Bacillus）、分枝桿菌屬（Mycobacterium）、假單胞菌屬（Pseudomohas）等[5]。真菌降解PAHs的效率通常高于細菌，在降解高環(huán)多環(huán)芳烴方面表現(xiàn)突出。研究表明，一些絲狀真菌、擔子菌、白腐菌和半知菌對四環(huán)或更高環(huán)數(shù)PAHs的降解具有一定的優(yōu)勢[6-7]。

PAHs污染土壤微生物修復過程中，胞外聚合物（extracellular polymeric substances，簡稱EPS）承接細胞壁及土壤表面PAHs，具有重要的橋聯(lián)作用。EPS通過范德華力或乳化作用解吸土壤中的PAHs，增強PAHs的生物可利用性[8-10]。楊智臨等研究發(fā)現(xiàn)，EPS與菌株聯(lián)用處理石油污染土壤時，萘去除率達96%，菲去除率達100%[11]。EPS中的蛋白質(zhì)和糖類，特別是蛋白質(zhì)中色氨酸殘基，對有機污染物的去除起重要作用。Pan等通過熱力學計算得出活性污泥EPS與菲的作用是自發(fā)的、放熱的，疏水相互作用是主要作用方式，且蛋白峰中的色氨酸參與其中[12]。Zhang等報道，一羥基芘（PAHs的代謝生物標記物）能與牛血清蛋白中的色氨酸殘基發(fā)生鍵合作用[13]。此外，EPS中多糖結(jié)合態(tài)PAHs的生物利用率較高[14]。

可見，EPS中蛋白和糖類參與PAHs的降解過程，有關(guān)EPS的提取和表征方法已比較成熟。EPS的提取方法包括物理、化學提取法。物理提取法主要是利用物理手段增加胞外聚合物在溶液中的溶解度，從而達到提取EPS的目的。如熱提取法、離心法、超聲波提取法等?；瘜W提取法是利用生物膜的內(nèi)傳質(zhì)作用使試劑中的離子或分子進入生物膜并與胞外聚合物發(fā)生接觸，胞外聚合物的大分子會轉(zhuǎn)化成為水溶性成分進而被提取出來。NaOH提取法是比較常用的方法，此外還有乙二胺四乙酸提取法、硫酸提取法、陽離子交換樹脂法、甲醛超聲波法等[15-18]。化學提取法雖然產(chǎn)率高，但樣品易被流出的胞內(nèi)物質(zhì)污染[19]。EPS的表征方法較多，EPS成分用色譜、質(zhì)譜及其組合進行定性和定量分析[20];胞外聚合物的功能基團和元素組成用X-射線光電子能譜、紅外光譜、三維熒光光譜、核磁共振等儀器解釋[21-25];EPS形貌一般用掃描電子顯微鏡、透射電子顯微鏡來表征。

為了深入研究EPS在PAHs污染土壤修復中的作用，本試驗以毛霉EPS為研究對象，以芘為目標污染物，通過室內(nèi)模擬試驗，聯(lián)合多種檢測技術(shù)，探索芘對毛霉EPS的特征影響。

1 材料與方法

1.1 試驗用菌種及培養(yǎng)

試驗用毛霉（Mucor mucedo）菌種由中國科學院沈陽應用生態(tài)研究所土壤污染生態(tài)組提供。斜面培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯去皮后洗凈，稱取200 g切成小塊，加1 L水煮沸20 min，濾去馬鈴薯塊，冷卻后加入20 g葡萄糖，定容至1 L，pH值自然，在1×105 Pa滅菌30 min。種子培養(yǎng)基：4.000%蔗糖，0.400%（NH4）2HPO4，0.100% KH2PO4，0.050% MgSO4·7H2O，0.005%維生素B1，pH值為6.5。在250 mL三角瓶中裝入150 mL液體種子培養(yǎng)基，在1×105 Pa滅菌20 min，冷卻后接入菌種，在搖床（溫度為25 ℃，轉(zhuǎn)速為120 r/min）中振蕩培養(yǎng)。

1.2 毛霉EPS的提取方法

取40 mL生長到穩(wěn)定期的菌體培養(yǎng)液，于2 000 r/min離心10 min，棄去上清液補充無菌水至原體積，于2 000 r/min離心3 min，棄去上清液補充無菌水至原體積，重復2次，去除液體培養(yǎng)基中的雜質(zhì)，然后用加熱法提取EPS。將上述菌懸液放入60 ℃的水浴鍋中加熱30 min，然后把樣品在 8 000 r/min 離心10 min，上清液經(jīng)過0.22 μm濾膜過濾后，得到的無色透明溶液即為EPS溶液，濃度用總有機碳（total organic carbon，簡稱TOC）來表示，TOC由mulit N/C3000 TOC測定儀測定。

1.3 毛霉對芘的降解試驗

將真菌轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基中，在30 ℃培養(yǎng)3 d。將單株菌株按10%的接種量接種到芘濃度分別為10、20、40、80、120 mg/L 的20 mL液體無機鹽培養(yǎng)基（0.05% 酵母膏，0.50% NaCl，1.00% NH4NO3，0.50% K2HPO4，0.50% KH2PO4，0.02% MgSO4·7H2O，0.05%蔗糖）中，在30 ℃、130 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，取樣分析培養(yǎng)基中芘的殘留濃度。

1.4 芘濃度測定

芘的提取方法采用二氯甲烷萃取，首先將三角瓶中溶液過0.45 μm水相濾器，然后向濾后溶液中加入等體積的二氯甲烷，放入振蕩器（溫度為25 ℃，轉(zhuǎn)速為180 r/min）中振蕩 5 min，全部移入50 mL分液漏斗中，靜置5 min，分層后將下層有機相存入燒杯，每個樣品按此步驟重復萃取3次。將上述3次萃取液混勻，轉(zhuǎn)移至燒杯中使用普通氮氣吹至近干，最后用甲醇定容，過0.22 μm有機濾膜后移入液相色譜專用進樣瓶中[26-27]。芘的濃度采用高效液相色譜法測定，儀器為Agilent-1200高效液相色譜儀。色譜儀主要設定參數(shù)：流動相為100%甲醇，流速為0.8 mL/min，可變波長檢測器（variable wavelength detector，簡稱VWD）檢測波長為254 nm，柱箱溫度為35 ℃，進樣量為10 μL。

1.5 EPS化學成分分析

糖類含量的測定采用硫酸-苯酚法[28]，蛋白質(zhì)和腐殖酸的測定采用修正的Folin-Lowry法[29]，DNA的測定采用二苯胺法[30]。

1.6 EPS形態(tài)特征分析

EPS的形態(tài)特征采用環(huán)境掃描電子顯微鏡進行檢測，將準備好的EPS樣品冷凍干燥成粉末狀，將制備好的EPS粉末粘在樣品臺上，鍍金后照相檢測。

1.7 EPS三維熒光光譜分析

提取的EPS樣品可直接進行三維熒光測定。熒光光度計參數(shù)設定：發(fā)射掃描波長為0.25～0.65 μm，激發(fā)掃描波長為0.20～0.55 μm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度為5×10-3 μm，掃描速度為12 μm/min，響應時間為自動方式，掃描光譜進行儀器自動校正。

1.8 EPS紅外光譜分析

將提取到的EPS樣品經(jīng)真空干燥（-60 ℃，24 h），取適量的粉末用傅里葉紅外光譜儀（型號：NICOLET380）進行測定，分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)為32次/min，測定范圍為 4 000～500 cm-1。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛霉EPS釋放和芘降解的關(guān)系

由圖1可知，隨著污染物芘的濃度由0增加到 120 mg/L，毛霉EPS的含量呈先增大后減少的趨勢。不加污染物芘時，提取的毛霉EPS含量為741 mg/L，10 mg/L芘誘導毛霉EPS的提取量增加到813 mg/L，隨著芘濃度的增加，提取到的EPS含量也在持續(xù)增加，直到芘的濃度增加到 80 mg/L 時，EPS的提取量達到峰值，為1 561 mg/L，比原毛霉EPS的提取量增加了820 mg/L，而120 mg/L芘則明顯抑制了EPS的提取量，使其降低到403 mg/L，這說明芘的濃度小于80 mg/L可以促進毛霉EPS的分泌，而過高濃度的芘則起到抑制作用。隨著芘濃度由10 mg/L增加到80 mg/L時，TOC值逐漸上升;芘濃度為120 mg/L時，毛霉對多環(huán)芳烴的降解率明顯下降，其對芘的降解率由80%下降到43.8%。這與Machín-Ramírez等的研究結(jié)論[31-33]一致。Machín-Ramírez等以黑曲霉、木霉霉菌、釀酒酵母菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、芽孢桿菌、假單胞菌屬等降解苯并芘，最大降解率為65%（初始濃度為50 mg/L）[31];Zafra等使用綠色木霉H15、曲霉H7、黃曲霉等多種真菌和細菌聯(lián)用降解芘，14 d后，芘的降解率為 48.18%[32];Jia等的研究表明，毛霉對芘（初始濃度為 37.9 mg/L）的最大降解率為86.5%[33]。這些數(shù)據(jù)證實了真菌和細菌對芘的生物降解能力。

2.2 芘對毛霉EPS生化成分的影響

2.2.1 不同芘濃度下毛霉EPS主要成分含量的變化 由圖2可知，毛霉EPS的4種主要成分中糖類的含量最高，其次為蛋白質(zhì)，再次為類腐殖質(zhì)，最后為DNA（由于提取EPS過程中沒有破壞細胞核，EPS中DNA含量極低），隨著污染物芘的濃度由0增加到120 mg/L，提取毛霉EPS中的糖類、蛋白質(zhì)、類腐殖質(zhì)含量呈先增大后減小的規(guī)律，而DNA的含量基本不變，這可能是因為毛霉為真核微生物，真核微生物的DNA一般多數(shù)在細胞核內(nèi)，加熱法提取EPS為物理方法，對細胞破損較小，不會破壞細胞核結(jié)構(gòu)，因此DNA含量基本保持不變。綜合不同濃度芘誘導毛霉EPS提取量的試驗結(jié)果進行分析，4種主要成分中除DNA外，隨著芘濃度增加的變化規(guī)律與毛霉EPS提取量的變化規(guī)律相同。80 mg/L芘誘導下，EPS的提取量與糖類、蛋白質(zhì)、類腐殖質(zhì)的含量均出現(xiàn)峰值。說明微生物在芘的誘導下，細胞會分泌降解所需的酶和糖類，而高濃度的芘則會對細胞產(chǎn)生毒性，從而抑制了微生物的生長，進而抑制其EPS的分泌。

毛霉EPS主要成分為糖類和蛋白質(zhì)，其次為類腐殖質(zhì)等，這與李紹峰等的研究結(jié)論[34-35]一致。與污泥EPS的主要成分為多糖和蛋白質(zhì)的研究結(jié)果[36]也相似。加入芘誘導后蛋白質(zhì)和多糖含量發(fā)生變化，因此，污染物芘對EPS的成分產(chǎn)生影響。Yue等從污水處理廠中分離出脫硫弧菌（Desulfovibrio desulfuricans）菌株，培養(yǎng)過程中加入Cu2+、Zn2+、Cd2+，分析結(jié)果表明重金屬的存在增加了EPS表面官能團的濃度[37]。

2.2.2 芘對毛霉EPS紅外光譜的影響 由圖3可知，光譜圖上均出現(xiàn)多個吸收峰，說明EPS中存在較多官能團。3 400～3 200 cm-1 處的譜峰可歸屬為細胞表面蛋白質(zhì)N—H鍵的伸縮振動和碳水化合物中結(jié)合水的O—H鍵的伸縮振動。1 650～1 620 cm-1處的譜峰來自典型的細胞蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ帶（C—O的伸展振動）和酰胺Ⅱ帶（N—H的彎曲振動與C—N伸展振動的疊加）。1 380～1 330 cm-1處的譜峰是烷基C—H伸縮振動的吸收帶。1 200～1 000 cm-1處的譜峰是C—O鍵伸展振動的吸收帶，譜帶強，主要是多糖C—O鍵的伸展振動吸收，稱為多糖區(qū)。另外，指紋區(qū)（1 330～400 cm-1）出現(xiàn)多個吸收峰，是由于整個分子振動轉(zhuǎn)動引起的，表明毛霉EPS中存在著含硫、磷基團。由光譜a與光譜b、c、d、e、f比較可知，由光譜a中 3 346 cm-1 處寬而大的蛋白峰在光譜b、c、d、e、f中分別為 3 345、3 278、3 255、3 282、3 355 cm-1，C—O鍵向低波數(shù)移動，C—O鍵鍵長縮短，發(fā)生了紅移，且隨著芘濃度由10 mg/L增加到80 mg/L，移動長度由1 cm-1增加到 364 cm-1，當芘濃度增加到120 mg/L時，C—O鍵向高波數(shù)移動，C—O鍵鍵長增長，發(fā)生了藍移，說明在芘誘導毛霉時EPS中的蛋白質(zhì)參加了反應，且隨著芘濃度的增大毛霉EPS中蛋白質(zhì)對毛霉降解芘的促進作用呈先增大后減小的趨勢。光譜a中1 555 cm-1處譜峰為酰胺（OCN—H）Ⅰ帶，是C=O鍵的伸縮振動，誘導前后從11 648 cm-1分別移動到1 626、1 635、1 632、1 632、1 621 cm-1，這說明毛霉降解芘時，毛霉EPS中主要是羥基和酰胺基起主要作用。光譜a中 1 038 cm-1 處峰在不同濃度芘誘導后的光譜b、c、d、e、f中分別移至1 042、1 069、1 042、1 031、1 072 cm-1，發(fā)生紅移，說明在毛霉降解芘時，EPS中多糖上的—COO被消耗，減少了 —COO 的含量。說明，在毛霉降解芘的過程中，EPS的主要成分糖類促進了降解反應的進行，隨著芘濃度的增大蛋白質(zhì)的促進作用呈現(xiàn)先增大后減小的規(guī)律。

紅外光譜分析結(jié)果中羥基、酯基是疏水基團，羥基、羧基、

醛基、氨基和磺酸基是親水基團。眾所周知，蛋白質(zhì)和多糖影響微生物菌株EPS的物理化學性質(zhì)、疏水性和絮凝性[38]。EPS和污染物之間的驅(qū)動力主要來自疏水相互作用、氫鍵或靜電相互作用[39]。由于EPS中存在一些疏水區(qū)域，許多有機污染物如菲、苯、染料（如甲苯胺藍）等都可以被EPS吸收[40-41]。因此，在芘生物降解過程中，芘誘導后微生物EPS對芘降解效果的影響比原微生物的EPS更有效。

2.2.3 芘對毛霉EPS三維熒光光譜的影響 在0.230/0.350 μm 的激發(fā)/發(fā)射波長（Ex/Em）處識別出第一主要熒光峰（峰1），而另一個主峰（峰2）位于Ex/Em=0.275/0.350 μm 處。根據(jù)Hudson的分類[42]，這2個峰位于Ⅰ（芳香族蛋白質(zhì)）和Ⅱ（芳香族蛋白質(zhì)）的區(qū)域。它們與衍生自其中的芳香族氨基酸如酪氨酸和色氨酸蛋白質(zhì)的化合物相關(guān)。

由表1可知，污染物芘的濃度由10 mg/L增加到 80 mg/L，熒光強度逐漸增強，色氨酸和酪氨酸含量隨之上升，說明芘對毛霉向胞外分泌蛋白都有一定的促進作用，其中芘的濃度為80 mg/L時，蛋白峰的熒光強度達到最大值，色氨酸和酪氨酸含量最高。當芘的濃度為120 mg/L時，蛋白峰的熒光強度達到最小值，色氨酸和酪氨酸含量最低。也就是說，120 mg/L芘抑制了毛霉向胞外分泌蛋白。因此，適量芘誘導后，毛霉EPS中色氨酸含量增加。芘的加入使得EPS的峰1和峰2的熒光強度發(fā)生變化，這直接影響了EPS在芘去除過程中的作用。值得注意的是，經(jīng)0～80 mg/L芘誘導，毛霉EPS在 0.230/0.350 μm的激發(fā)/發(fā)射波長處的類蛋白1，熒光強度由86.45 a.u.上升至221.30 a.u.;在 0.275/0.350 μm 的激發(fā)/發(fā)射波長處的類蛋白2，熒光強度由202.10 a.u.上升至243.10 a.u.;芘的濃度超過80 mg/L后峰1熒光強度減至 31.65 a.u.，峰2熒光強度減至180.10 a.u.。

芳香族蛋白質(zhì)物質(zhì)和類腐殖質(zhì)是提取的EPS樣品中的2種主要物質(zhì)，特別是蛋白質(zhì)中色氨酸殘基，對有機污染物的去除起重要作用。通過熱力學計算得出，EPS對菲的降解是自發(fā)的、放熱的，疏水相互作用是主要作用方式，且蛋白峰中的色氨酸參與其中[12]。Zhang等報道，一羥基芘（PAHs的代謝生物標記物）能與牛血清蛋白中的色氨酸殘基發(fā)生鍵合作用[13]。

2.3 芘對EPS表征的影響

圖4為不同濃度芘誘導下液體培養(yǎng)毛霉EPS粉末放大 5 000倍的掃描電鏡照片，由圖4-a可知，未經(jīng)馴化的毛霉EPS呈板結(jié)塊狀，四周凸起部分呈鋒利薄片狀。隨著芘的濃度由10 mg/L增加到80 mg/L，EPS粉末逐漸變得松散多孔，尤其是80 mg/L芘誘導下的毛霉EPS的照片呈毛絨狀，空隙量多

而且大，而120 mg/L芘誘導下的毛霉EPS沒粉末又重新變成板結(jié)狀。說明芘誘導明顯影響毛霉EPS的結(jié)構(gòu)，芘誘導后EPS具有更大的接觸面和吸附力，能更好地促進芘的生物降解。

3 討論與結(jié)論

EPS是同時含有親水和疏水部分的兩親性化合物。因此，EPS可顯示可溶疏水底物的表面活性[43]。在相互作用的初始階段會產(chǎn)生使EPS和芘共聚的吸引力，如疏水相互作用[44-46]。在我國的報告中，EPS和PAHs之間的相互作用是自發(fā)的和放熱的，PAHs與EPS的結(jié)合主要由疏水相互作用[47]。一些研究報道引入化學物質(zhì)，如合成表面活性劑、生物吸收劑、細菌聚合物等，可以增強PAHs從土壤表面的解吸[48-50]。Liu等認為，細菌產(chǎn)生的細胞外聚合物可以增強吸收菲的釋放程度[8]。因此，可以推斷EPS可以增強芘在土壤表面的釋放，進而增強PAHs的生物降解效果。

此外，馴化后EPS形態(tài)和成分的變化對PAHs的生物降解也有影響。電鏡下未經(jīng)馴化的黑曲霉EPS呈不規(guī)則塊狀，顆粒大且結(jié)塊，使用未經(jīng)馴化的黑曲霉降解芘，降解率達 56.61%[51]，與馴化過的毛霉相比降解率略低（80 mg/L芘馴化降解率為80%），除去菌種自身降解能力外，未經(jīng)馴化的菌種EPS較為平滑，與馴化過的毛霉EPS相比，EPS與PAHs的接觸面積較小，因而降解能力略低。就成分而言，微生物分泌的胞外蛋白作為介質(zhì)為微生物攝入外來物質(zhì)，胞外多糖起到對物質(zhì)的吸附和絮凝作用，腐殖酸與有機物產(chǎn)生吸附和配合作用，形成大分子絡合物[52-53]。幾種化合物相互配合使得EPS與生物體間發(fā)生離子架橋、靜電中和等反應所表現(xiàn)出的黏結(jié)性，有利于對多環(huán)芳烴的溶解吸附，提高微生物對多環(huán)芳烴的去除能力[54]，本試驗結(jié)果與其基本一致。鑒于EPS的生物降解作用以及馴化后EPS形態(tài)和成分的變化，可以推測馴化后毛霉EPS對芘有更強的生物降解效果。

毛霉是高效的芘降解菌株，芘濃度為80 mg/L時，芘誘導后毛霉產(chǎn)生的EPS量最大，為1 561 mg/L，其中糖類含量為 1 042 mg/L，蛋白質(zhì)含量為562 mg/L，類腐殖質(zhì)的含量為 312 mg/L。0～80 mg/L芘誘導后毛霉EPS熒光強度漸強，這說明色氨酸和類腐殖質(zhì)的蛋白質(zhì)樣物質(zhì)的量有所增加。因此，80 mg/L芘誘導后毛霉產(chǎn)生的EPS更能促進芘的生物降解效果。80 mg/L芘誘導后的毛霉EPS呈毛絨狀，質(zhì)地疏松，接觸面更大，吸附力更強，可以更好地促進芘的生物降解。

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