胡秀虹++張廷輝++黃劍

摘要：從長期施用阿維菌素農(nóng)藥的土壤中分離到1株能以阿維菌素為唯一碳源、氮源和能源的不動(dòng)桿菌（Acinetobacter tandoii） AW1-18。研究了該菌株對阿維菌素的降解曲線、生長條件以及影響因素。結(jié)果表明，AW1-18生長所需阿維菌素的最佳濃度為100 mg/L，最適pH值為7.0，溫度為30 ℃，通氣量為60 mL，細(xì)菌接種濃度為3%，培養(yǎng)至6 d時(shí)，該菌對阿維菌素的降解率可達(dá)76%。加入較低濃度的碳氮源，能促進(jìn)該菌對阿維菌素的降解。

關(guān)鍵詞：不動(dòng)桿菌；生物降解；生長條件；阿維菌素

中圖分類號： X172文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2016）05-0447-04

阿維菌素（avermectin）在土壤中主要通過非生物降解和微生物降解，非生物降解包括化學(xué)水解和光解作用[1-4]。微生物降解作為生物修復(fù)技術(shù)具有高效、無毒、無二次污染、經(jīng)濟(jì)實(shí)用、應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)，且操作簡便，目前，已成為去除殘留農(nóng)藥污染物的最主要方式[5]，在阿維菌素降解中同樣扮演著重要角色，也是目前研究阿維菌素的一個(gè)新領(lǐng)域。

張衛(wèi)等運(yùn)用恒溫培養(yǎng)法研究了阿維菌素在滅菌土壤和未滅菌土壤中的降解動(dòng)力學(xué)[6]，結(jié)果表明，阿維菌素在土壤中的降解主要由微生物引起，而非生物消解作用較小。相關(guān)研究進(jìn)一步證實(shí)嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌[7]、伯克霍爾德氏菌屬[8]、蠟樣芽孢桿菌[9]能以土壤中的阿維菌素農(nóng)藥作為唯一的碳源、氮源和能源并將其完全降解。本研究從長期施用阿維菌素農(nóng)藥的菜豆土壤中分離到1株對阿維菌素具有良好降解作用的微生物，經(jīng)鑒定為不動(dòng)桿菌，命名為Acinetobacter tandoii AW1-18。本試驗(yàn)對該菌株對阿維菌素的降解活性及生長條件等進(jìn)行了研究。

1材料與方法

1.1材料

不動(dòng)桿菌菌株AW1-18（Acinetobacter tandoii AW1-18，簡稱AW1-18），從貴州省貴陽市花溪區(qū)多年使用阿維菌素農(nóng)藥的菜豆地土壤中分離獲得，經(jīng)鑒定后保存。阿維菌素原藥（B1a≥96%） 由陜西標(biāo)正作物科學(xué)有限公司提供。 無機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)液（g/L）[10]；LB培養(yǎng)基（g/L）[8]。

1.2方法

1.2.1菌懸母液的配制將目標(biāo)菌株無菌操作條件下接種至LB培養(yǎng)基中，于30 ℃、150 r/min恒溫?fù)u床上培養(yǎng)24 h。按文獻(xiàn)[11]的具體方法配制菌懸母液。

1.2.2阿維菌素含量分析采用高效液相色譜法（HPLC法）測定。HPLC法測定條件：Agilent 1100高效液相色譜儀，紫外檢測器，檢測波長為246 nm，色譜柱為 ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-水（92 ∶8，V/V），流量為1 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL。

1.2.3菌體生長量的測定以波長為600 nm處的D值表示，即測定菌液在紫外波長為600 nm時(shí)的吸光度。

1.2.4阿維菌素降解率的測定取AW1-18菌懸液接于含阿維菌素的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，滴幾滴Tween 80乳化劑，適溫避光搖床培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)不接菌的空白對照，每個(gè)平行3次重復(fù)。定期取樣做前處理后測定阿維菌素的含量，計(jì)算阿維菌素的降解率[12]。通過降解率的比較，判斷菌株的降解能力強(qiáng)弱。

1.2.5菌株生長最佳條件的確定改變菌株的培養(yǎng)條件：pH值、溫度、底物濃度、裝樣量、菌株接種濃度和外加碳氮源，通過阿維菌素降解率和D600 nm值的比較，可以確定菌株生長的最佳條件。

1.2.6阿維菌素降解曲線和AW1-18生長曲線的繪制在菌株生長最佳條件下，將菌株AW1-18菌懸液接種于含 100 mg/L 阿維菌素的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min振動(dòng)培養(yǎng)，從第1天開始取樣，測定培養(yǎng)液中阿維菌素的濃度及菌液D600 nm值，每隔3 d測定1次。計(jì)算阿維菌素的降解率，以取樣時(shí)間為橫坐標(biāo)，阿維菌素降解率和D600 nm值為雙縱坐標(biāo)，繪制阿維菌素降解曲線和AW1-18生長曲線，確定 AW1-18 培養(yǎng)最佳時(shí)間。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0軟件，采用Duncans單因素方差分析，多重極差檢驗(yàn)法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2結(jié)果與分析

2.1溫度對菌株生長及阿維菌素降解率的影響

考察溫度對菌株AW1-18生長和對阿維菌素降解率的影響。將AW1-18菌懸液按2.5%接種于50 mL含50 mg/L阿維菌素的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，控制溫度分別在20、25、30、35、40 ℃，150 r/min培養(yǎng)6 d后，取樣測定細(xì)菌D600 nm值和阿維菌素降解率，結(jié)果見表1。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異分析，5個(gè)不同溫度下AW1-18菌株對阿維菌素的5組降解率存在著極顯著差異。

從圖1可以看出，不同溫度條件下菌株AW1-18的D600 nm值不同，表現(xiàn)出對阿維菌素的降解率也不同。溫度主要通過改變酶反應(yīng)速率來影響菌體的生長，一般溫度升高，酶反應(yīng)速率增大，生長代謝加快，但酶本身又很容易因過熱而失去活性。結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果，AW1-18的生長及對阿維菌素的降解受溫度影響顯著，在溫度為20～40 ℃范圍內(nèi)，降解率隨培養(yǎng)液溫度的升高先增大后減小，當(dāng)溫度為30 ℃時(shí)，阿維菌素降解率達(dá)到最大值，為49.50%，此時(shí)菌體D600 nm值為032，細(xì)菌生長最旺盛。結(jié)果表明，菌體對阿維菌素的最適降解溫度與菌體的最適生長溫度是一致的，認(rèn)為30 ℃為阿維菌素的最佳降解溫度。

2.2pH值對菌株生長及阿維菌素降解率的影響

考察培養(yǎng)基初始pH值對菌株AW1-18生長和對阿維菌素降解的影響，將AW1-18菌懸液按2.5%接種于50 mL含50 mg/L阿維菌素的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)pH值為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，在溫度為30 ℃條件下，150 r/min培養(yǎng)6 d后，取樣測定細(xì)菌D600 nm值和阿維菌素降解率，結(jié)果見表2。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異分析，5個(gè)不同pH值下AW1-18菌株對阿維菌素的5組降解率存在著極顯著差異，其他依次為6.0、8.0、5.0、9.0。

表2不同pH值下阿維菌素的降解率

pH值降解率（%）ⅠⅡⅢ均值±標(biāo)準(zhǔn)差521.522.221.421.7±0.44D636.939.137.137.7±1.22B750.849.550.650.3±0.70A834.534.434.734.5±0.15C918.71919.619.1±0.45E

從圖2可以看出，pH值不同導(dǎo)致菌株AW1-18的D600 nm值不同，表現(xiàn)出對阿維菌素的降解率也不同，說明pH值影響了AW1-18的生長，繼而影響了AW1-18對阿維菌素的降解。因?yàn)閜H值影響菌體細(xì)胞膜電荷狀況，引起膜滲透性的變化，以及影響營養(yǎng)物離子化程度，從而影響菌體對養(yǎng)分的吸收。在pH值為5～9的范圍內(nèi)，降解率隨著培養(yǎng)液的pH值的增大先增大后減小，當(dāng)pH值為7時(shí)，降解率最大，為 50.3%，此時(shí)，菌體D600 nm值為0.35。過酸及過堿都會(huì)抑制菌株的生長，同時(shí)影響其降解酶的活性，從而影響其對阿維菌素的降解。綜上分析，得出AW1-18的最佳培養(yǎng)pH值為7.0。

2.3底物濃度對菌株生長及阿維菌素降解率的影響

設(shè)置阿維菌素濃度為10、50、100、150、200 mg/L，其他培養(yǎng)條件相同。培養(yǎng)液中不同的阿維菌素起始濃度對菌株AW1-18的生長及其降解性能的影響結(jié)果見表3、圖3。

不同底物濃度對阿維菌素降解率影響分析結(jié)果，10 mg/L與200 mg/L的差異不顯著，與50、100、150 mg/L差異極顯著，100 mg/L與50 mg/L、150 mg/L、200 mg/L差異極顯著。

表3不同底物濃度下阿維菌素的降解率

底物濃度

（mg/L）降解率（%）ⅠⅡⅢ 均值±標(biāo)準(zhǔn)差1031.931.533.532.3±1.05D5052.451.150.151.2±1.15B10077.575.975.876.4±0.95A15044.146.643.744.8±1.57B20031.533.433.232.7±1.04D

試驗(yàn)結(jié)果表明，阿維菌素的起始濃度對菌株的生長具有較大影響。培養(yǎng)液中阿維菌素濃度低于100 mg/L時(shí)，阿維菌素的增加對降解菌的生長具有促進(jìn)作用；高于100 mg/L時(shí)，阿維菌素對其生長具有一定的抑制作用（圖3）。原因是阿維菌素作為降解菌AW1-18生長所需的唯一碳、氮源而被其利用降解，阿維菌素的添加濃度低時(shí)，AW1-18因受碳、氮源的限制而生長緩慢；另一方面，AW1-18對阿維菌素的降解代謝是在它分泌的酶作用下進(jìn)行的，作為此酶的底物，阿維菌素濃度過高可能會(huì)對其產(chǎn)生抑制，從而也在一定程度上限制了降解菌對營養(yǎng)物質(zhì)的攝取量，因而其生長受到影響。從圖3可以看出，阿維菌素起始濃度為100 mg/L時(shí)，菌株降解率達(dá)最大，為76.4%，當(dāng)?shù)竭_(dá)200 mg/L時(shí)，其降解率仍有 32.7%，表明該菌株對阿維菌素具有一定的耐受性。綜上分析，100 mg/L 為菌株AW1-18培養(yǎng)所需的阿維菌素最佳初始濃度。

2.4裝樣量對菌株生長及阿維菌素降解率的影響

裝樣量反映的是菌株生長需氧量的多少。裝樣體積（培養(yǎng)液體積） 越大通氣量越小，菌株所獲得的氧氣量越低。不同裝樣量條件下的阿維菌素降解率見表4。當(dāng)裝樣量為60 mL 時(shí)，阿維菌素降解率最大。試驗(yàn)結(jié)果還表明，不同的裝樣量在對阿維菌素降解率的影響存在差異，處理間差異極顯著。

2.5細(xì)菌接種量對菌株生長及阿維菌素降解率的影響

不同細(xì)菌接種量條件下的5組菌株AW1-18對阿維菌素的降解率見表5，以接種量為4%時(shí)的阿維菌素降解率最大。為驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果和分析的可行性，對表5中的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果表明，不同接種濃度條件下，菌株AW1-18對阿維菌素的降解率差異極顯著。接種濃度3%與4%差異不顯著，與2.5%、2.0%、1.0%差異極顯著。由此得出3%是阿維菌素降解時(shí)接種的最佳濃度。

從圖5可以看出，隨著菌株AW1-18的接種量增加，菌株的D600 nm值增大，阿維菌素的降解率也增大，但是隨著接種量增加而增大的趨勢在低菌量時(shí)表現(xiàn)更為明顯，當(dāng)接種量增加到3%時(shí)，降解率雖然仍呈上升趨勢，但已趨于平緩。原因可能是隨著接種量的增加，微生物生長所需的碳、氮源相對不足，導(dǎo)致有效菌源不多，從而對阿維菌素降解率的影響不大。

2.6不同碳、氮源對菌株生長及阿維菌素降解率的影響

添加0.2%的不同碳、氮源在不同程度上均有利于阿維菌素的降解，其中加入少量蛋白胨和酵母浸膏時(shí)，阿維菌素降解率最大。這是由于外加碳、氮源能夠促進(jìn)菌株的生長，使其生物種群增大，從而促進(jìn)了其對阿維菌素的降解。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得出，外加少量不同的碳、氮源和空白不加時(shí)，阿維菌素降解率差異極顯著，但添加蛋白胨與酵母浸膏之間差異不顯著，處在同一最高水平上，而與葡萄糖、可溶性淀粉和空白對照之間差異極顯著，葡萄糖和可溶性淀粉均與對照存在極顯著差異（表6、圖6）。

2.7阿維菌素降解曲線和AW1-18生長曲線

在菌株AW1-18生長的最佳條件下研究其生長曲線及阿維菌素的降解曲線，從圖7可以看出，阿維菌素降解率與菌株培養(yǎng)時(shí)間相關(guān)。伴隨培養(yǎng)時(shí)間的延長，AW1-18菌液的D600 nm值先增大而后逐漸降低，阿維菌素降解率先增大后增大趨勢減小直至趨于零。這是因?yàn)榫w的生長經(jīng)過延滯期、對數(shù)生長期、穩(wěn)定期和衰減期4個(gè)階段，在1～3 d，菌體生長還處于延滯期，生長量增長速度相對較慢，3～6 d時(shí)增長迅速，菌體可能處在對數(shù)生長期，阿維菌素的降解趨勢與其保持一致，當(dāng)培養(yǎng)至6 d時(shí)，菌體生長基本到達(dá)穩(wěn)定期，此時(shí)，D600 nm值為0.43，阿維菌素降解率為76%，而6 d后菌體生長又開始衰減，生長量逐漸下降，阿維菌素再降解漸少，阿維菌素 15 d 的降解率為86%。由此可得出AW1-18的最佳培養(yǎng)時(shí)間為6 d。

3討論與結(jié)論

通過考察溫度、pH值、阿維菌素初始濃度等培養(yǎng)條件對菌株AW1-18降解阿維菌素性能的影響，采用單因素方差分析法和Duncan多重比較法對獲得的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果表明，培養(yǎng)條件對AW1-18降解阿維菌素的性能有顯著的影響，只有在適宜的環(huán)境條件下，菌株才能充分發(fā)揮其降解能力。AW1-18高效降解阿維菌素的最佳條件與其最適生長條件是一致的。

阿維菌素的初始濃度、溫度、pH值、接種量等條件對阿維菌素的降解率均有影響。pH值為7.0，培養(yǎng)溫度為30 ℃，阿維菌素初始濃度為100 mg/L，細(xì)菌接種量為3%，通氣量為 60 mL 時(shí)，是菌株AW1-18生長的最適條件，也是阿維菌素降解的最佳條件。在最優(yōu)條件下，菌株AW1-18對 100 mg/L 阿維菌素6 d的降解率為76%，15 d的降解率為86%。外加少量的碳源、氮源，能夠明顯促進(jìn)該菌對阿維菌素的降解。

分析菌株AW1-18的生長曲線及阿維菌素的降解曲線，得出菌株AW1-18在3～6 d生長旺盛，阿維菌素降解迅速，6 d后菌株AW1-18生長衰減，阿維菌素降解緩慢，幾乎很少降解，因而得出6 d為菌株AW1-18培養(yǎng)的最佳時(shí)間。

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