李曉樓　趙燕

摘要：從長(zhǎng)期使用噻吩磺隆的農(nóng)田土壤中篩選到1株能高效降解噻吩磺隆的細(xì)菌LXL-3，按照16S rRNA分析方法并參照其生理生化特點(diǎn)，鑒定LXL-3為丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）。菌株LXL-3在含100 mg/L噻吩磺隆的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后，噻吩磺隆降解率可達(dá)81%以上。菌株LXL-3的適宜pH值和適宜溫度分別為7.0～7.5、25～30℃，該菌還對(duì)噻吩磺隆和NaCl有很好的耐受性。研究表明，該菌在噻吩磺隆等農(nóng)藥污染物的生物治理方面具有較好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：噻吩磺??；丁香假單胞菌；生物降解

中圖分類號(hào)：X172 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002—1302（2016）01—0369—04

噻吩磺隆（thifensulfuron-methyl）屬磺酰脲類除草劑，其化學(xué)名稱為3-（4-甲氧基-6-甲基-1，3，5-三嗪-2-基）-1-（2-甲氧基甲?；绶?3-基）-磺酰脲，常用作莖葉處理劑，通過(guò)抑制植物的乙酰乳酸合成酶（ALS）活性，干擾支鏈氨基酸的合成，最終導(dǎo)致敏感植物停止生長(zhǎng)并死亡，目前在我國(guó)已廣泛用于防除小麥、玉米、大豆等作物田間的闊葉雜草。噻吩磺隆在農(nóng)業(yè)上的廣泛應(yīng)用在提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)效率方面發(fā)揮了重要作用，但噻吩磺隆的殘留也對(duì)生態(tài)環(huán)境、食用農(nóng)產(chǎn)品安全及人類健康帶來(lái)了諸多不利影響，并會(huì)對(duì)一些敏感農(nóng)作物產(chǎn)生藥害，有時(shí)甚至?xí)?yán)重影響到下茬作物的正常生長(zhǎng)。

已有研究表明，磺酰脲類除草劑的降解可包括光解、水解和生物降解等多種途徑，并認(rèn)為微生物的降解作用是磺酰脲類除草劑的主要降解途徑。例如，Jean等發(fā)現(xiàn)噻吩磺隆在未經(jīng)滅菌處理的土壤中能快速降解，而在滅過(guò)菌的土壤中降解速度卻非常緩慢，表明土壤中的微生物對(duì)噻吩磺隆的降解起到了關(guān)鍵作用。目前，有關(guān)微生物降解噻吩磺隆這一領(lǐng)域的研究工作報(bào)道較少，已有文獻(xiàn)僅報(bào)道了一些噻吩磺隆降解菌株的分離以及相關(guān)降解特性的測(cè)試。例如，Geraldine等從土壤中分離獲得了1株伯克霍爾德氏菌（Burkholderia cepa-cia），該菌株可較快地降解噻吩磺?。稽S星等人從土壤中分離到1株能高效降解噻吩磺隆的寡養(yǎng)單胞菌（Stenotroph-omonas sp.），并對(duì)該菌株的降解特性進(jìn)行了系統(tǒng)研究；Hugh等則報(bào)道了7種可降解噻吩磺隆的細(xì)菌或放線菌。本研究以篩選出噻吩磺隆高效降解菌為研究對(duì)象，研究該菌株的生理生化特征及應(yīng)用性能，以期為后續(xù)的應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試劑與培養(yǎng)基

噻吩磺?。ā?8.5%）購(gòu)自上海市農(nóng)藥研究所，噻吩磺隆標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Sigma-Aldrich公司（美國(guó)），本試驗(yàn)中所用其他化學(xué)試劑均為分析純或以上級(jí)別。

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：1.0 g NH4N03，0.5 g KH2P04，1.5 gK2HP04，0.5 g NaCl，0.2 g MgSO₄·7H₂O，1 L蒸餾水，pH值7.0。在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入噻吩磺隆即為噻吩磺隆分離培養(yǎng)基。

富集培養(yǎng)基：4 g牛肉浸出粉，10 g蛋白胨，5 g NaCl，3 g酵母浸出粉，1 L蒸餾水，pH值7.0。制作培養(yǎng)平板或者斜面時(shí)，在培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂。

1.2儀器

安捷倫1260/6430高效液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)），安捷倫ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（3.0×100 mm，1.8-Micron），IKATM勻漿機(jī)（德國(guó)），振蕩培養(yǎng)箱（太倉(cāng)華美），氮吹濃縮器，島津UV-2550分光光度計(jì)（日本）。

1.3噻吩磺隆降解菌的分離與鑒定

用于分離噻吩磺隆降解菌的土壤樣品取自四川遂寧農(nóng)田，取土耕地使用磺酰脲類除草劑已有5年以上歷史。在100 mL噻吩磺隆無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基（噻吩磺隆濃度為50 mL/L）中加入2.0 g土樣，在30℃下振蕩培養(yǎng)5 d（150 r/min）。檢測(cè)降解效果，若5 d降解率大于30%，則吸取5 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到相同濃度的噻吩磺隆富集培養(yǎng)基中，并連續(xù)轉(zhuǎn)接5次（若降解率不足30%，則重新取土樣重復(fù)上述過(guò)程）。再次驗(yàn)證降解效果后，在噻吩磺隆無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基平板上涂布上述富集培養(yǎng)液，在30℃下倒置培養(yǎng)，挑取生長(zhǎng)旺盛的菌落在培養(yǎng)平板上反復(fù)劃線分離以得到純培養(yǎng)物。最后，分離得到的純培養(yǎng)物被接種到富集培養(yǎng)基上保存?zhèn)溆谩?/p>

菌種的生理生化鑒定參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《Bergeys Mannual 0f Determinative Bacteriology》（9th edi-tion）進(jìn)行，同時(shí)按照16S rRNA序列分析法進(jìn)行菌種鑒定。

1.4降解菌株16S序列的測(cè)定

總DNA的提取采用CTAB法，16S rDNA引物設(shè)計(jì)參見(jiàn)文獻(xiàn)[9]：

正向引物為5′-AGAGrITTGATCCTGGCTCAG-3′；

反向引物為5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′。

擴(kuò)增反應(yīng)體系如下：5.0μl 10×聚合酶反應(yīng)緩沖液，4.0 μL dNTPs（2.5 mmoL/L），1.0μL引物（25μmoL/L），6.0μL Mg²⁺（25 mmoL/L），1.0μL模板DNA（濃度約為50 ng/μL），0.3 μL Taq DNA聚合酶（5 U/μL），加ddH₂O至50μL。反應(yīng)條件：95℃5 min；94℃30 s，52℃30 s，72℃75 s，30個(gè)循環(huán)；72℃10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序由上海生工公司完成，后將所測(cè)序列輸入GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行相關(guān)分析。

1.5噻吩磺隆的定量分析

提?。悍Q取10.0 mL（或固體樣品10.0 g）待測(cè)樣品于100 mL具塞錐形瓶中，加入40 mL提取液（pH值7.8的磷酸鹽緩沖溶液與甲醇等體積混合），加蓋后振蕩45 min（120 r/min），超聲萃取5 min，布氏漏斗抽濾，濾液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用提取液清洗、轉(zhuǎn)移并定容至50 mL。移取20 mL上述溶液在40℃水浴中減壓濃縮至10 mL，加10 mLpH值2.0的磷酸鹽緩沖液并調(diào)節(jié)最終pH值至2.0～3.0。

凈化：依次用5 mL甲醇、5 mL水、5 mL提取液淋洗活化固相萃取柱（Oasis HLB：200 mg，6 mL），將上述待凈化液轉(zhuǎn)移上柱，抽干。再用6 mL乙腈洗脫，收集至刻度管中，40℃氮吹至近干，取2.0 mL體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇水溶液溶解樣品，過(guò)0.22μm濾膜，待測(cè)。

測(cè)定：用安捷倫1260/6430高效液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行分析，外標(biāo)法定量。流動(dòng)相[A相（0.1%甲酸+4 mmoL乙酸銨），B相（甲醇），等度洗脫]，質(zhì)譜采集參數(shù)（母離子388，子離子141/167，碎裂電壓125，碰撞能量10/10）。

1.5接種體的準(zhǔn)備

在肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)所篩選的降解菌株，并通過(guò)離心方式收集菌體（6 000 r/min離心5 min），收集到的菌體用無(wú)菌水洗滌3遍后再用無(wú)菌生理鹽水重懸，使D_600nm=1.0，該懸浮液用作后續(xù)降解試驗(yàn)的接種體（特別標(biāo)注的除外）。

1.6溫度對(duì)菌株LXL-3降解噻吩磺隆的影響

在以噻吩磺隆為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基（噻吩磺隆濃度100 mg/L，pH值7.0）中接種3%的上述接種體，然后分別置于20、25、30、35、40℃條件下振蕩培養(yǎng)，每隔24 h以無(wú)菌操作的方式取樣1次，測(cè)定噻吩磺隆殘留濃度及D_600nm值。

1.7 pH值對(duì)菌株LXL-3降解噻吩磺隆的影響

將含有100 mg/L噻吩磺隆的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的pH值分別調(diào)至6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，然后分別接種3%的接種體，置于30℃下振蕩培養(yǎng)，定時(shí)取樣監(jiān)測(cè)噻吩磺隆降解情況及D_600nm值。

1.8菌株LXL-3對(duì)噻吩磺隆的耐受性

在含有不同濃度噻吩磺?。?0～800 mg/L）的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中分別接人菌株LXL-3，然后在30℃下振蕩培養(yǎng)，定時(shí)取樣測(cè)試D_600nm，用以評(píng)價(jià)噻吩磺隆濃度對(duì)菌株LXL-3生長(zhǎng)的影響。

1.9菌株LXL-3對(duì)NaCl的耐受性

調(diào)節(jié)無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基（含有100 mg/L噻吩磺?。┲械腘aCl含量，使其NaCl含量分別為0.5%（作參照）、1.0%、2.0%、4.0%、6.0%、8.0%（共6組），然后分別接人等量的菌株LXL-3，在30℃下振蕩培養(yǎng)，定時(shí)取樣測(cè)試D_600nm，用以評(píng)價(jià)菌株LXL-3對(duì)鹽的耐受性。

1.10應(yīng)用菌株LXL-3降解土壤中的噻吩磺隆

土壤樣品取自四川省遂寧市射洪縣農(nóng)田，分4組，A組：滅菌土壤（新鮮土壤于121℃下滅菌30 min）；B組：新鮮土壤；C組：滅菌土壤中添加菌株LXL-3；D組：新鮮土壤中添加菌株LXL-3。另外，每組中噻吩磺隆濃度均為100 mg/kg。最后將其置于30℃下培養(yǎng)，每隔24 h取樣測(cè)定噻吩磺隆的殘留濃度。

2結(jié)果與分析

2.1噻吩磺隆降解菌株的鑒定及特性

從土壤中分離到1株能以噻吩磺隆為唯一碳源的菌株，將其命名為L(zhǎng)XL-3。該菌株為稍有彎曲的桿狀菌，大小為（0.5～0.8）μm×（2.0～2.5）μm，革蘭氏陰性，有1～7根鞭毛，可運(yùn)動(dòng)，不產(chǎn)芽孢，好氧生活，在營(yíng)養(yǎng)肉湯平板上可形成表面濕潤(rùn)的圓形菌落。氧化酶、接觸酶、明膠液化試驗(yàn)及V.P試驗(yàn)均為陽(yáng)性，而淀粉水解試驗(yàn)和反硝化試驗(yàn)呈陰性。菌株TJXL-3經(jīng)鑒定為丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae），其生化鑒定結(jié)果與按照16S rRNA分析方法所得到的結(jié)果一致（菌株LXL-3的16S rRNA分析委托上海生工公司完成，GenBank登錄號(hào)為KP125318）。

2.2溫度和pH值對(duì)于菌株LXL-3生長(zhǎng)及降解噻吩磺隆的影響

菌株LXL-3在25～30℃條件下的生長(zhǎng)狀況要優(yōu)于其他溫度條件，并且在這一溫度下降解噻吩磺隆的效率也最高（圖1、圖2），在5 d后噻吩磺隆（起始濃度為100 mg/L）的降解率能達(dá)到99.0%以上，表明菌株LXL-3生長(zhǎng)及降解噻吩磺隆的適宜溫度為25～30℃。當(dāng)溫度為35℃時(shí)，菌株LXL-3的生長(zhǎng)狀況以及降解噻吩磺隆的效率會(huì)相對(duì)差一些，但是仍然處于較高的水平。若溫度達(dá)到40℃，菌株的生長(zhǎng)和噻吩磺隆降解率都會(huì)大幅度下降，在40℃下培養(yǎng)48 h，其D_600nm和噻吩磺隆降解率分別僅為30℃時(shí)的68%、50%。以上結(jié)果表明，菌株LXL-3對(duì)高溫是敏感的，若溫度達(dá)到或高于40℃，其生長(zhǎng)及降解噻吩磺隆的能力都將受到不利影響，因此菌株LXL-3僅適合應(yīng)用于低于40℃的溫度條件。

微生物的生長(zhǎng)狀況及降解能力等通常會(huì)受到pH值的影響。本研究結(jié)果表明，培養(yǎng)基的pH值為7.0時(shí)，菌株LXL-3的生長(zhǎng)要優(yōu)于在其他pH值條件（圖3）；而適宜于菌株LXL-3降解噻吩磺隆的pH值為7.0或7.5，pH值為6.0時(shí)則降解率顯著降低（圖4），說(shuō)明菌株LXL-3的生長(zhǎng)與噻吩磺隆的降解速度呈正相關(guān)。此外，pH值會(huì)在一定程度上影響到菌株LXL-3的生長(zhǎng)和噻吩磺隆的生物降解，但其4 d后的降解率也顯示，pH值對(duì)于菌株LXL-3降解噻吩磺隆的影響在降解后期并不十分顯著，因?yàn)樵?個(gè)不同的pH值條件下，培養(yǎng)4 d后菌株LXL-3降解噻吩磺?。ㄆ鹗紳舛葹?00 mg/L）的降解率都可以達(dá)到90%以上，表明菌株LXL-3擁有極強(qiáng)的噻吩磺隆降解能力（圖3、圖4）。已有研究表明，在不考慮生物降解的情況下，在pH值中性時(shí)噻吩磺隆最為穩(wěn)定，在培養(yǎng)基為酸性或堿性時(shí)則有利于噻吩磺隆的水解；然而，在本試驗(yàn)中并沒(méi)有表現(xiàn)出這一現(xiàn)象（圖4），可推測(cè)這里的降解行為主要是菌株LXL-3的生物降解作用。本試驗(yàn)中的最大降解率發(fā)生在pH值中性條件下，這主要是由于菌株LXL-3在中性條件下生長(zhǎng)更好，可能會(huì)產(chǎn)生更多的降解酶，并且多數(shù)降解酶在pH值中性條件下有更大的酶活性。

2.3噻吩磺隆濃度對(duì)菌株LXL-3生長(zhǎng)的影響

當(dāng)噻吩磺隆濃度從50 mg/L升高至250 mg/L時(shí)，D_600nm值有增加的趨勢(shì)，表明噻吩磺隆濃度為50 mg/L時(shí)不能充分滿足試驗(yàn)條件下菌株LXL-3的碳源或能源需求，但在濃度達(dá)到250 mg/L時(shí)菌株生長(zhǎng)達(dá)到基本飽和，繼續(xù)增加噻吩磺隆可能會(huì)抑制該菌株的生長(zhǎng)。當(dāng)濃度由250mg/L增加到500 mg/L時(shí)，D_600nm值有所下降，但統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異不顯著；若增加至1000 mg/L，則菌株的生長(zhǎng)受到明顯抑制，但仍然可以生長(zhǎng)（圖5）。因此，初步判定菌株LXL-3在試驗(yàn)條件下能耐受濃度為500 mg/L的噻吩磺隆，在這一濃度下，菌株LXL-3的生長(zhǎng)不會(huì)受到顯著影響。依據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果，可作以下推測(cè)：（1）由于500 mg/L的噻吩磺隆不會(huì)對(duì)菌株LXL-3的生長(zhǎng)產(chǎn)生顯著影響，故認(rèn)為菌株LXL-3對(duì)噻吩磺隆有很好的耐受性。（2）菌株LXL-3擁有很強(qiáng)的降解噻吩磺隆的能力，能夠用于較寬的噻吩磺隆濃度范圍；菌株LXL-3顯示了更快的噻吩磺隆降解速率（相比較文獻(xiàn)報(bào)道的噻吩磺隆降解菌株而言）。（3）菌株LXL-3可能能用于噻吩磺隆污染的生物修復(fù)，特別是高濃度的噻吩磺隆污染。菌株LXL-3所擁有的噻吩磺隆降解能力可能與分離該菌株的農(nóng)田土壤長(zhǎng)期使用噻吩磺隆農(nóng)藥密切相關(guān)，按照記錄，相關(guān)農(nóng)田已經(jīng)有使用噻吩磺隆5年以上的歷史。通常，土壤微生物長(zhǎng)期持續(xù)接觸某種人工合成有機(jī)化合物可能會(huì)誘導(dǎo)出降解該化合物的能力，這些具備了新的降解特性的微生物可能與問(wèn)題土壤中農(nóng)藥的快速失活密切相關(guān)。

2.4 NaCl濃度對(duì)菌株LXL-3生長(zhǎng)的影響

當(dāng)NaCl濃度從0.5%升高至4.0%時(shí)，所測(cè)得的D_600nm值未出現(xiàn)顯著變化（圖6），這表明菌株LXL-3至少能耐受4.0%的NaCl；同時(shí)，由于供試培養(yǎng)基中只有噻吩磺隆1種碳源，菌株LXL-3是以降解噻吩磺隆來(lái)獲取碳源進(jìn)行生長(zhǎng)，表明該菌株在高鹽壓力下仍可保持對(duì)噻吩磺隆的降解能力。此外，當(dāng)NaCl濃度從4.0%升高至6.0%時(shí)，菌株LXL-3的生長(zhǎng)受到了較明顯影響，D_600nm值顯著降低，但該菌株仍然能較好地生長(zhǎng)；即使NaCl濃度提高至8.0%，菌株LXL-3仍可維持低水平的生長(zhǎng)（（圖6），因此認(rèn)為該菌株屬中等或以上程度的耐鹽菌。菌株LXL-3的耐鹽性可能與采樣地點(diǎn)的鹽堿化有一定關(guān)系，微生物持續(xù)處于滲透壓脅迫環(huán)境下，可誘導(dǎo)產(chǎn)生耐鹽性能，這一般通過(guò)滲透調(diào)節(jié)或蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)這2種方式實(shí)現(xiàn)。

2.5土壤中噻吩磺隆的降解

通過(guò)添加菌株LXL-3到土壤中用以降解土壤中的噻吩磺隆是可行的，添加了菌株LXL-3的土壤中噻吩磺隆的降解率要明顯高于未添加菌株LXL-3的土壤，噻吩磺?。ㄆ鹗紳舛仁?00 mg/kg）的10 d降解率約為90%，14 d降解率則可達(dá)到99%以上，趨于完全降解（圖7）。然而，在不含菌株LXL-3的土壤中其10、14 d的降解率僅分別為29%、14%，說(shuō)明菌株LXL-3具有較強(qiáng)的生存能力，并能在土壤中有效降解噻吩磺隆。此外，在新鮮土壤中噻吩磺隆的降解率要稍高于其在滅菌土壤中的降解率，存在于新鮮土壤中的某些擁有噻吩磺隆降解能力的天然微生物可能是導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因。在不含活微生物的滅菌土壤中，經(jīng)歷14 d后其噻吩磺隆的含量下降了14%（圖7），噻吩磺隆數(shù)量隨時(shí)間逐漸減少的現(xiàn)象則可能是由水解和光解作用所造成。Andersen等的研究已經(jīng)證實(shí)磺酰脲類除草劑在土壤環(huán)境中的降解行為受很多因素的影響，如溫度、pH值、光、微生物、土壤類型以及施用的肥料等。

3小結(jié)

在本研究中分離到1株能有效降解噻吩磺隆的細(xì)菌，該菌被命名為L(zhǎng)XL-3，并被鑒定為丁香假單胞菌。在不同的條件下測(cè)試了該菌株的生理生化特征和噻吩磺隆降解性能，其中在含100 mg/L噻吩磺隆的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，菌株LXL-3培養(yǎng)48 h后，噻吩磺隆的降解率可達(dá)81%以上。菌株LXL-3降解噻吩磺隆的適宜pH值為7.0～7.5，適宜溫度為25～30℃。此外，該菌還對(duì)噻吩磺隆和NaCl有很好的耐受性，至少能耐受500 mg/L以上的噻吩磺隆和4.0%以上的NaCl。將菌株LXL-3添加到被噻吩磺隆污染的土壤，結(jié)果表明該菌株能在土壤中生長(zhǎng)并發(fā)揮降解噻吩磺隆的作用。因此，菌株LXL-3可用于污染物的生物處理，在后續(xù)研究中嘗試將菌株LXL-3制作成微生物活菌制劑用于噻吩磺隆及其他相關(guān)污染物的生物治理。