劉泳廷，高敏，劉佳，鄭沖，劉玲，葉建方，苑潔

(貴州省疾病預防控制中心，貴州 貴陽 550004)

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)為蘭科石斛屬多年生草本植物，別名黑節(jié)草、鐵吊蘭，是石斛屬植物中藥用價值最高的一種石斛。以新鮮或干燥的莖入藥，作為滋陰清熱、益胃生津潤肺的傳統(tǒng)中藥，具有悠久的食用和使用方面的歷史[1-3]。近年來，國內外學者對鐵皮石斛的化學成分、藥理活性和質量控制方法均開展了大量的研究。研究表明,鐵皮石斛的成分主要為多糖和生物堿，含有少量的糖苷、菲類、聯(lián)芐類和氨基酸等[4-5]，具有抗衰老、抗腫瘤、降低血糖、提高免疫功能等作用，對惡性腫瘤、胃腸道疾病、糖尿病、白內障、關節(jié)炎、血栓閉塞性脈管炎及慢性咽炎等有很好的療效，治療和保健意義非常重大[6-12]。但目前有關鐵皮石斛及其同類產(chǎn)品毒理學安全性評價研究的資料少見報道，且未見生殖毒性及致畸作用的相關研究報道。貴州由于優(yōu)越的地理位置及良好的生態(tài)環(huán)境,境內曾擁有豐富的野生鐵皮石斛資源,是鐵皮石斛的原產(chǎn)地之一[13-14]。本次研究擬對貴州產(chǎn)鐵皮石斛粉致畸作用進行試驗研究，旨在了解鐵皮石斛粉對SD大鼠是否具有胚胎毒性和致畸毒性。

1 材料與方法

1.1 受試物

鐵皮石斛粉為淺黃綠色粉末，由貴州某藥業(yè)公司提供。人體口服推薦量為每日1.5 g。

1.2 對照藥物

阿司匹林(規(guī)格：100 mg，批號：160528，上海藍季科技發(fā)展有限公司)；陰性對照為蒸餾水。

1.3 實驗動物及環(huán)境

SPF級健康成年SD大鼠，雌性120只(體質量230～260 g)，雄性60只(體質量300～330 g)，由貴州醫(yī)科大學實驗動物中心提供：SCXK(黔)2018-0001。動物質量合格證號：1202129。實驗室屏障環(huán)境動物使用許可證：SYXK(黔)2014-001。溫度：20℃～26℃,濕度：40%～70%。SPF級繁殖飼料由四川省醫(yī)學科學院四川省人民醫(yī)院實驗動物研究所提供：SCXK(川)2015-01。

1.4 試驗方法

1.4.1 分組與處理

實驗共分5組，陰性對照組、陽性對照組及3個劑量組。按最大灌胃量法給予樣品，劑量設計如下：鐵皮石斛粉0.63 g/kgBW、1.25 g/kgBW和2.50 g/kgBW，相當于人體推薦攝入量的25倍、50倍和100倍，陰性對照組為蒸餾水，陽性對照組為阿司匹林(250 mg/kgBW)。低、中、高劑量組受試物配制為分別稱取樣品6.3 g、12.5 g、25.0 g加蒸餾水定容到150 mL；陽性對照組配制為稱取阿司匹林2.5 g加蒸餾水定容到150 mL。每日即配即用，各組灌胃量均為15 mL/kgBW，每天1次。

1.4.2 方法

SD大鼠雌、雄按1:1合籠過夜后，每日早晨觀察陰栓，查出陰栓認為該鼠已交配，當日作為“受孕”零天。確認的“孕鼠”隨機分到各組，每組20只，并稱重、編號，在受孕的第6～15天，各組每天經(jīng)口給予受試物(灌胃體積15 mL/kgBW)。在0、6、9、12、15和20天分別稱體質量一次，按體質量調整受試物灌胃量，并予記錄，自由進食飼料。第20天頸椎脫臼處死母體，剖腹取出子宮，稱子宮連胎重，記錄黃體數(shù)、著床數(shù)、吸收胎、早死胎、晚死胎及活胎數(shù)，逐一記錄胎鼠性別、體重、體長、胎盤重及外觀有無畸形。每窩1/2活胎放入95%的乙醇中固定后放入10 g/L的氫氧化鉀溶液內，透明后放入茜素紅應用液中染色，在體視顯微鏡下檢查有無骨骼畸形。另1/2活胎放入Bouins液固定2周后作內臟檢查。

1.5 統(tǒng)計分析

應用SPSS18 FORWINDOWS統(tǒng)計處理，計量指標的組間差異采用方差分析，計數(shù)指標的組間差異采用卡方檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 對孕鼠一般狀況及體質量的影響

在整個試驗期間，各組孕鼠均未見異常癥狀和體征，也無死亡。陰性對照組孕鼠在整個妊娠期體質量增長正常。鐵皮石斛粉低、中、高劑量組各時間點體質量增長正常，與陰性對照組比較無顯著性差異(P>0.05)。陽性對照組孕鼠在妊娠第12天體質量增長減慢，顯著低于陰性對照組(P<0.05)，見表1。

表1 鐵皮石斛粉對孕鼠體質量的影響

注：與陰性對照組比較，*P<0.05。

2.2 對孕鼠胚胎發(fā)育的影響

陰性對照組子宮連胎重、黃體數(shù)、著床數(shù)、活胎數(shù)和胎鼠體質量、身長、胎盤重等均正常。鐵皮石斛粉低、中、高劑量組平均活胎體質量、平均活胎體長、平均胎盤重與陰性對照組比較有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，但無明顯的劑量-反應關系，且均在本實驗室基礎數(shù)據(jù)正常范圍內，其余指標與陰性對照組比較均無顯著性差異(P>0.05)。陽性對照組吸收胎率顯著高于陰性對照組(P<0.01)；子宮連胎重、平均活胎體重、平均活胎體長均顯著低于陰性對照組(P<0.01)，說明阿司匹林有明顯的胚胎毒性。各劑量組均未出現(xiàn)死胎，外觀檢查僅陽性對照組有3只胎鼠腦膨出合并脊柱裂，外觀畸形率1.50%，見表2和表3。

注：與陰性對照組比較，**P<0.01。

表3 鐵皮石斛粉對活胎鼠生長發(fā)育的影響

注：與陰性對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.3 對胎鼠骨骼的影響

鐵皮石斛粉各劑量組胎鼠骨骼改變主要為胸骨缺失、胸骨骨化不全、14對肋和短肋，與陰性對照組比較無顯著性差異(P>0.05)，表明鐵皮石斛粉對胎鼠骨骼分化無不良影響。陽性對照組胎鼠骨骼畸形主要為頭骨骨化異常、脊椎椎體分岔、椎體單側骨化、頸椎間隙增寬、15對肋、胸骨缺失，畸形率高達98.95%，顯著高于陰性對照組(P<0.01)，見表4、圖1。

表4 鐵皮石斛粉對胎鼠骨骼發(fā)育的影響

注：與陰性對照組比較，**P<0.01。

2.4 對胎鼠內臟的影響

鐵皮石斛粉低、中、高劑量組和陰性對照組未發(fā)現(xiàn)有內臟畸形；陽性對照組見內臟異常胎鼠數(shù)13只，主要為臟器淤血，并見側腦室擴張2只、腎盂擴張2只、腎偏小1只，內臟畸形率12.38%，顯著高于陰性對照組(P<0.01)，見表5。

3 討論

致畸作用是發(fā)育毒性中最主要的一種表現(xiàn)，通過檢測妊娠動物接觸受試物后引起的致畸可能性，可預測其對人體可能的致畸性，是衡量外來化合物發(fā)育毒性的重要指標。母體在孕期受到可通過胎盤屏障的有害物質的作用，會影響胚胎的器官分化與發(fā)育，導致結構異常，出現(xiàn)胎鼠畸形。因此，在受孕動物的胚胎著床后，器官形成期給予受試物，可檢出該物質對胎鼠的致畸作用。本次研究用鐵皮石斛粉在孕鼠的致畸敏感期進行染毒，不但能檢測鐵皮石斛粉的致畸性，還可以觀察其致胚胎、胎鼠死亡和生長遲緩等資料。

注：①⑤陰性對照組；②③④⑦⑧陽性對照組(箭頭所示分別為②囟門偏大，③枕骨Ⅰ級，④囟門偏大、枕骨骨化不全,⑦雙側波形肋，⑧第14胸椎椎體單側骨化，第11、12胸椎椎體分岔)；⑥鐵皮石斛高劑量組：雙側短肋。圖1 體視顯微鏡下觀察阿司匹林和鐵皮石斛粉對胎鼠骨骼發(fā)育的影響

組別受檢胎鼠數(shù)頭部胸部腹部內臟畸胎數(shù)內臟畸形率(%)腦/腦室出血圍腦膜下出血側腦室擴張小眼/無眼胸腔淤血肺偏小腹腔淤血肝淤血腎臟偏小腎盂擴張陰性對照組124000000000000.00低劑量組116000000000000.00中劑量組113000000000000.00高劑量組118000000000000.00陽性對照組10521203021121312.38**

注：與陰性對照組比較，**P<0.01。

本次研究中，設定的陽性對照物為阿司匹林，劑量250 mg/kgBW，實驗孕鼠呈現(xiàn)明顯的胚胎毒性和致畸胎作用，其中子宮連胎重、平均活胎體質量、平均活胎體長均顯著低于陰性對照組，外觀檢查有3只胎鼠見腦膨出合并脊柱裂，吸收胎率9.91%，骨骼畸形率98.95%，內臟畸形率12.38%，均顯著高于陰性對照組，這與本實驗室以往設立的陽性對照模型結果相吻合，提示本次研究所選SD大鼠種屬對致畸物反應敏感。

本次研究采用最大灌胃量法設計給予受試物，因鐵皮石斛粉為一種易吸水、黏稠度高的物質，故設計的最高劑量為2.5 g/kgBW，達到每日人體推薦劑量的100倍。實驗期間未見孕鼠進食量減少及其他母體中毒癥狀，鐵皮石斛粉各劑量組孕鼠增重、黃體數(shù)、著床數(shù)、活胎數(shù)、吸收胎數(shù)和死胎數(shù)未見異常，對胎鼠體質量、胎盤重、身長、骨骼和內臟也未見明顯影響。鐵皮石斛粉在達到人體推薦量100倍的劑量對大鼠未顯示明顯的母體毒性、胚胎毒性和致畸性，致畸毒性的無明顯有害作用水平為2.5 g/kgBW，提示鐵皮石斛粉對人體可能無明顯的致畸作用。本次研究為鐵皮石斛作為藥物、保健食品、新食品資源的開發(fā)利用提供了生殖毒理學參考依據(jù)。